本發(fā)明涉及干細胞用培養(yǎng)基、該培養(yǎng)基的制造方法等。

背景技術(shù)：

一直以來，干細胞(胚胎干細胞、人工多能干細胞(iPS細胞)等)的培養(yǎng)使用含有血清的培養(yǎng)基來進行。例如，胎牛血清(FBS)等作為對于細胞增殖而言重要的添加物，被廣泛用于細胞培養(yǎng)。但是，在出于醫(yī)療目的使用培養(yǎng)后的干細胞時，來自異種的成分可能會成為血液媒介病原菌的感染源、異種抗原。此外，還存在血清的批次間差異導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生偏差的可能性。因此，近年來，使用化學(xué)組成明確的培養(yǎng)基(chemically defined medium)培養(yǎng)干細胞已逐漸成為主流，正在進行無血清培養(yǎng)基的開發(fā)。

作為無血清培養(yǎng)基中非常重要的成分之一，可以列舉白蛋白。通過添加白蛋白，可以期待培養(yǎng)基性能穩(wěn)定的維持效果，就細胞培養(yǎng)用途而言，有數(shù)種白蛋白在售。但是，白蛋白比較昂貴，此外，在細胞培養(yǎng)、特別是干細胞的培養(yǎng)中，并不是所有的白蛋白都具有同等效果，培養(yǎng)成績會受白蛋白品質(zhì)的影響，有時還存在白蛋白的添加對細胞增殖發(fā)揮不利作用的情況。進而，培養(yǎng)基中的白蛋白劣化也成為問題。

作為比較廉價的白蛋白，可以列舉由人、牛等動物的血清提取的白蛋白，在供體感染了病毒等的情況下，有病毒傳播的危險性。因此，這些來自動物血清的白蛋白在臨床用途中的使用受到嚴格限制，并且即使在允許使用時，也需要盡可能降低其使用量。

感染風(fēng)險低、在臨床用途中優(yōu)選使用的利用基因重組(recombinant)法制備的白蛋白非常昂貴，因此若將其供于細胞培養(yǎng)且想要確保足夠數(shù)量的細胞時，成本變得極高。因此，為了將這些重組白蛋白用于細胞培養(yǎng)，需要盡可能降低其使用量。

因此，嘗試開發(fā)降低白蛋白使用量的培養(yǎng)基或不含白蛋白的培養(yǎng)基。例如，專利文獻1報道了將聚乙二醇作為白蛋白的替代物用于培養(yǎng)基。專利文獻2報道了一種含有聚乙烯醇的培養(yǎng)基，其特征在于，不含白蛋白。專利文獻3報道了在胚胎干細胞(HESCs)用培養(yǎng)基中使用聚乙烯醇。專利文獻4報道了在由多能細胞分化中胚層系干細胞時，在培養(yǎng)基中使用聚乙烯醇等。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1:日本特開2004－135672號公報

專利文獻2:日本特開2007－228815號公報

專利文獻3:US2010/0317104A1

專利文獻4:WO2011/100286A2

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明的目的在于，提供維持培養(yǎng)基性能的穩(wěn)定且降低了白蛋白的含量的、培養(yǎng)成績良好的干細胞增殖用培養(yǎng)基，特別是iPS細胞增殖用培養(yǎng)基；并提供用于制造該增殖用培養(yǎng)基的培養(yǎng)基添加劑和防止培養(yǎng)基劣化的添加劑。

用于解決課題的手段

本發(fā)明人為了達成上述目的進行了深入研究，結(jié)果確認：通過在含有白蛋白的培養(yǎng)基中組合使用具有特定性質(zhì)的水溶性聚合物、特別是聚乙烯醇，能夠使白蛋白含量降低且獲得優(yōu)異的培養(yǎng)成績，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明如下所述。

[1]一種iPS細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其特征在于，含有水溶性聚合物和白蛋白。

[2]根據(jù)上述[1]所述的培養(yǎng)基，其中，水溶性聚合物為聚乙烯醇。

[3]根據(jù)上述[2]所述的培養(yǎng)基，其中，聚乙烯醇的臨界膠束濃度為0.1～5mg/ml。

[4]根據(jù)上述[2]或[3]所述的培養(yǎng)基，其中，聚乙烯醇的水解率為60～95％。

[5]根據(jù)上述[1]～[4]中任一項所述的培養(yǎng)基，其中，白蛋白為降低了脂肪酸負載量的白蛋白。

[6]一種培養(yǎng)基添加劑，其以水溶性聚合物為有效成分。

[7]根據(jù)上述[6]所述的劑，其中，水溶性聚合物為聚乙烯醇。

[8]根據(jù)上述[7]所述的劑，其中，聚乙烯醇的臨界膠束濃度為0.1～5mg/ml。

[9]根據(jù)上述[7]或[8]所述的劑，其中，聚乙烯醇的水解率為60～95％。

[10]根據(jù)上述[6]～[9]中任一項所述的劑，其中，培養(yǎng)基為含有白蛋白的培養(yǎng)基。

[11]根據(jù)上述[10]所述的劑，其中，白蛋白為降低了脂肪酸負載量的白蛋白。

[12]根據(jù)上述[6]～[11]中任一項所述的劑，其中，培養(yǎng)基為干細胞增殖用培養(yǎng)基。

[13]根據(jù)上述[12]所述的劑，其中，干細胞為iPS細胞。

[14]根據(jù)上述[6]～[13]中任一項所述的劑，其為含有白蛋白的培養(yǎng)基的劣化防止劑。

[15]一種防止含有白蛋白的培養(yǎng)基劣化的方法，其包括添加水溶性聚合物。

[16]根據(jù)上述[15]所述的方法，其中，水溶性聚合物為聚乙烯醇。

[17]一種iPS細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，用上述[1]～[5]中任一項所述的培養(yǎng)用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

發(fā)明效果

如果使用本發(fā)明的培養(yǎng)基則能夠降低培養(yǎng)基中的白蛋白量，因此，能夠在添加更低用量的白蛋白的情況下維持培養(yǎng)基性能的穩(wěn)定。白蛋白使用量的降低能夠進行更加安全且穩(wěn)定的干細胞增殖。因此，能夠降低培養(yǎng)中的培養(yǎng)基更換的頻度，能夠削減干細胞的培養(yǎng)成本。

附圖說明

圖1為確認利用本發(fā)明的培養(yǎng)方法增殖而得的iPS細胞具有未分化性質(zhì)的圖。

具體實施方式

本說明書中，“干細胞”是指具有自我復(fù)制能力及分化/增殖能力的未成熟細胞。根據(jù)分化能力，干細胞包括多能干細胞(pluripotent stem cell)、復(fù)能干細胞(multipotent stem cell)、單能干細胞(unipotent stem cell)等亞群(subpopulation)。多能干細胞是指具有能夠分化為構(gòu)成生物體的全部組織、細胞的能力的細胞。復(fù)能干細胞是指雖然不能分化為全部的種類、但具有能夠分化為多種組織、細胞的能力的細胞。單能干細胞是指具有能夠分化為特定組織、細胞的能力的細胞。

作為多能干細胞，可以列舉胚胎干細胞(ES細胞)、胚胎生殖細胞(EG細胞)、人工多能干細胞(iPS細胞)、通過應(yīng)激或細胞刺激而誘導(dǎo)·篩選的多能干細胞等。培養(yǎng)對體細胞的核進行核移植從而制作的早期胚(early embryo)而建立的干細胞也優(yōu)選作為多能干細胞(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；Nature Biotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999)；Nature Genetics,24,109(2000))。

作為復(fù)能干細胞，可以列舉間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、神經(jīng)干細胞、髓樣干細胞、生殖干細胞等體干細胞等。復(fù)能干細胞優(yōu)選間充質(zhì)干細胞，更優(yōu)選骨髓間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞廣義上是指能夠分化為成骨細胞、成軟骨細胞及成脂細胞等間充質(zhì)細胞中的全部或幾種的干細胞或其前體細胞的群組。

本發(fā)明中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以使用本身公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，只要不妨礙干細胞的增殖則沒有特別限定，可以列舉例如DMEM、EMEM、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、GMEM(Glasgow's MEM)、RPMI-1640、α-MEM、Ham's培養(yǎng)基F-12、Ham's培養(yǎng)基F-10、Ham's培養(yǎng)基F12K、Medium 199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy's 5A、Leibovitz's L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth's MB752/1、CMRL-1066、Williams'培養(yǎng)基E、Brinster's BMOC-3培養(yǎng)基、E8培養(yǎng)基(Nature Methods,2011,8,424-429)、ReproFF2培養(yǎng)基(ReproCELL Inc.)及這些的混合培養(yǎng)基等。此外，還可以使用改變成干細胞培養(yǎng)用途的培養(yǎng)基、上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基與其它培養(yǎng)基的混合物等。

本發(fā)明中，“含有白蛋白的培養(yǎng)基”為在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加白蛋白而成的培養(yǎng)基(“白蛋白”將在后面說明)。

本發(fā)明中，“含有白蛋白的培養(yǎng)基的劣化”是指：與剛制備后的含有白蛋白的培養(yǎng)基相比，它的支持細胞增殖的能力、維持細胞的未分化狀態(tài)的能力下降的狀態(tài)，具體而言，在制備含有白蛋白的培養(yǎng)基且經(jīng)過了一定時間后供于培養(yǎng)時，培養(yǎng)細胞的增殖數(shù)、未分化標志量等與用剛制備后的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時相比變低的現(xiàn)象。作為這類現(xiàn)象的原因，可以列舉例如：在培養(yǎng)基制備后經(jīng)過一定時間的期間內(nèi)，培養(yǎng)基中的白蛋白分解、變性、吸附于培養(yǎng)基容器等，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的白蛋白量對于在細胞培養(yǎng)中有效地發(fā)揮作用而言變得不足。

本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以含有本身公知的添加物。作為添加物，只要不妨礙干細胞的增殖則沒有特別限定，可以列舉例如生長因子(例如胰島素等)、鐵源(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白等)、多胺類(例如腐胺等)、礦物質(zhì)(例如硒酸鈉等)、糖類(例如葡萄糖等)、有機酸(例如丙酮酸、乳酸等)、氨基酸(例如L－谷氨酰胺等)、還原劑(例如2－巰基乙醇等)、維生素類(例如抗壞血酸、d－生物素等)、類固醇(例如β－雌二醇、孕酮等)、抗生素(例如鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、緩沖劑(例如HEPES等)等。此外，還可以適當(dāng)含有一直以來用于干細胞培養(yǎng)的添加物。優(yōu)選在本身公知的濃度范圍內(nèi)含有各添加物。

本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以含有血清。就血清而言，若為來自動物的血清，則只要不妨礙干細胞的增殖就沒有特別限定，優(yōu)選來自哺乳動物的血清(例如胎牛血清、人血清等)。血清的濃度在本身公知的濃度范圍內(nèi)即可。但是，由于已獲知血清成分還含有人ES細胞的分化因子等、此外血清的批次間差異可能導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生偏差，因此血清的含量越低越優(yōu)選，最優(yōu)選不含血清。進而，在出于醫(yī)療目的使用培養(yǎng)后的干細胞時，來自不同種屬的成分可能成為血液媒介病原菌的感染源、異種抗原，因此優(yōu)選不含血清。在不含血清時，可以使用血清的替代物(例如Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco)、Glutamax(Gibco)等)。

本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基，其為干細胞用增殖用培養(yǎng)基、特別是iPS細胞用增殖用培養(yǎng)基，其特征在于，含有水溶性聚合物和白蛋白(此后也稱為本發(fā)明的培養(yǎng)基)。增殖用培養(yǎng)基是指能夠在維持干細胞的復(fù)制能力、多能性、單能性的狀態(tài)下進行該細胞的復(fù)制(即增殖)的培養(yǎng)基。

1.本發(fā)明的培養(yǎng)基

本發(fā)明的培養(yǎng)基可以適合用于任一干細胞的增殖，優(yōu)選用于ES細胞或iPS細胞、更優(yōu)選iPS細胞的增殖。

此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以適合用于來自任一動物的干細胞的增殖?？墒褂帽景l(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細胞例如為來自小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等嚙齒類；兔子等兔形目；豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄目；狗、貓等食肉目；人、猴、獼猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等靈長類等的干細胞，優(yōu)選來自人的干細胞。

本發(fā)明中使用的白蛋白只要是用于細胞培養(yǎng)用途的白蛋白則沒有特別限定，優(yōu)選使用降低了脂肪酸負載量的白蛋白。若為已經(jīng)降低了脂肪酸負載量的白蛋白則可以直接添加到培養(yǎng)基中，若為脂肪酸負載量尚未降低的白蛋白，則在實施脫脂肪酸處理后添加到培養(yǎng)基中。

作為脂肪酸，可以列舉碳數(shù)為8～20的飽和脂肪酸(例如棕櫚酸、硬脂酸)及碳數(shù)為16～20的不飽和脂肪酸(例如油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸)。

作為白蛋白，具體而言，可以列舉卵清白蛋白(ovalbumin)、來自豬的白蛋白、來自牛的白蛋白、來自人的白蛋白等天然來源的白蛋白，牛源化、豬源化、或人源化等基因重組白蛋白等，特別優(yōu)選示出來自血清的白蛋白、人源化基因重組白蛋白(recombinant human albumin(rHSA))?？梢允褂每缮藤彨@得的白蛋白。作為可商購獲得的白蛋白，就rHSA而言，可以列舉Sigma-Aldrich公司的A9731(型號)、ScienCell Research Laboratories公司的OsrHSA-10(型號)、Wuhan Healthgen Biotechnology Co.,Ltd.,HY01E-10g(型號)、E Enzyme Inc.的HSA-1r(型號)、BioVerde公司的IBK-A1-10(型號)等來自重組稻谷的制品；Sigma-Aldrich公司的A7223(型號)、A6608(型號)、A7736(型號)、Novozymes公司的Albucult(注冊商標)(型名)、Recombumin alpha(注冊商標)(型名)、AlbIX(注冊商標)(型名)等來自重組酵母的制品。作為來自人血漿的白蛋白，可以列舉Sigma-Aldrich公司的A1887(型號)、A1653(型號)、A9511(型號)、A3782(型號)、A8763(型號)、A4327(型號)、Biological Industries Ltd的Bio-Pure HSA 10％Solution(型名)等制品。

白蛋白是與各種物質(zhì)的結(jié)合能力高的蛋白質(zhì)，與鈣、鋅等微量元素以及脂肪酸、酶、激素等結(jié)合。例如，來自血清的白蛋白與血清中所含的各種物質(zhì)結(jié)合，就脂肪酸而言，1分子白蛋白通常具有與2分子脂肪酸結(jié)合的能力。

白蛋白的脫脂肪酸處理只要是能夠降低白蛋白的脂肪酸負載量的處理則沒有特別限定，可以列舉活性炭處理、離子交換處理、加熱處理等，從經(jīng)濟性、簡便性等觀點出發(fā)，優(yōu)選活性炭處理。進而，通過活性炭處理，白蛋白的脂肪酸負載量能夠降低至相對于白蛋白1g優(yōu)選9mg以下、更優(yōu)選7mg以下、進而優(yōu)選2.2mg以下。

白蛋白的脂肪酸負載量的測定可以使用該領(lǐng)域中通常實施的方法或基于該方法的方法來實施，可以列舉例如：使游離脂肪酸甲酯化后用GC-MS進行檢測、基于紅外分光進行的定量、以及鄧肯貝(Duncombe)提取法、使用?；o酶A合成酶(ACS)和?；o酶A氧化酶(ACOD)的ACS－ACOD法等。任一方法均可以使用以測定試劑盒形式市售的試劑盒。

本發(fā)明中，培養(yǎng)基中的白蛋白的含量只要為通?？商砑釉诩毎囵B(yǎng)用培養(yǎng)基中的量則沒有特別限定，本發(fā)明中，通過與水溶性聚合物組合使用，可以減少其含量。具體而言，以終濃度達到0.01～10mg/ml、優(yōu)選0.1～5mg/ml、更優(yōu)選0.2～3.5mg/ml、進而優(yōu)選0.3～3mg/ml的量添加于干細胞培養(yǎng)用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。含量過少時，無法期待培養(yǎng)基性能穩(wěn)定的維持效果；過多時，培養(yǎng)基的制造成本上升，實用性下降。

白蛋白在培養(yǎng)基中形成三維狀結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)以作為脂溶性物質(zhì)的載體的作用為代表的各種功能，由此認為，通過模仿這種立體結(jié)構(gòu)則能夠代替或輔助白蛋白的功能?；衔锏牧Ⅲw結(jié)構(gòu)化可以通過利用膠束形成使具有表面活性功能的化合物締合體化而實現(xiàn)，因此想到了通過形成膠束來代替或輔助白蛋白的可能性。在這方面，本發(fā)明中，水溶性聚合物由于其膠束形成能力而能夠代替或輔助白蛋白。

本發(fā)明中使用的水溶性聚合物為能夠用于細胞培養(yǎng)用途、即不顯示細胞毒性的水溶性聚合物，且通過與白蛋白組合使用而能夠降低白蛋白的使用量。本發(fā)明中使用的水溶性聚合物的一個方式為：臨界膠束濃度(CMC)為0.1～10mg/ml、優(yōu)選0.1～5mg/ml、更優(yōu)選0.5～1mg/ml。本發(fā)明中使用的水溶性聚合物的一個方式是聚乙烯醇，CMC為0.1～5mg/ml、優(yōu)選0.5～5mg/ml、更優(yōu)選0.5～1mg/ml。這里，膠束是指由于在水溶液中親水基部分朝向水相側(cè)、疏水基部分朝向內(nèi)側(cè)地進行取向、從而一定數(shù)量的分子聚集而形成的水溶性聚合物分子的締合體。本發(fā)明中，“膠束”除了包含這樣的狹義的膠束以外，還包含稱為擬膠束的膠體狀的聚集體(例如Revue Roumaine de Chimie,54卷,577-581頁,2009年)。CMC過低時，有由于其極高的膠束形成能力而使培養(yǎng)基中所含的表面活性劑等聚集、影響細胞培養(yǎng)的擔(dān)憂；過高時，為了形成膠束而需要大量添加，此時，培養(yǎng)基的粘度、滲透壓上升，有影響培養(yǎng)細胞的擔(dān)憂。CMC越低則膠束形成能力越高。

CMC的測定可以使用該領(lǐng)域中通常實施的方法或基于該方法的方法來實施，例如，可以使用電導(dǎo)法、粘度法、色素法、表面張力法、光散射法等來測定。進而，近年還使用利用熒光物質(zhì)芘測定熒光強度從而計算的方法。

作為本發(fā)明中使用的水溶性聚合物，具體而言，可以列舉聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)等，優(yōu)選PVA。

本發(fā)明中作為水溶性聚合物使用的PVA，優(yōu)選水解率為60～95％、優(yōu)選70～90％、更優(yōu)選75～90％。這里所謂的水解率是指：使作為PVA原料的聚乙酸乙烯酯的乙?；ㄟ^水解而轉(zhuǎn)化為羥基的比例。百分比越高表示水解程度越深。水解率過低時，水溶性不充分；即使過高，高分子彼此的羥基形成氫鍵，反而在水中的溶解性、分散性變差。為了能夠與細胞更均勻地接觸，優(yōu)選使用溶液化的PVA。溶液化中使用的溶劑只要是細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中可添加的、對細胞增殖沒有不良影響的溶劑則沒有特別限定，可以列舉水、生理緩沖液等。

本發(fā)明中，培養(yǎng)基中的水溶性聚合物的含量只要是通?？商砑釉诩毎囵B(yǎng)用培養(yǎng)基中的量則沒有特別限定，具體而言，在水溶性聚合物為PVA時，以終濃度達到0.1～20mg/ml、優(yōu)選1～20mg/ml、更優(yōu)選1～10mg/ml、進而優(yōu)選3～7mg/ml的量添加于干細胞培養(yǎng)用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。此外，培養(yǎng)基中的白蛋白和水溶性聚合物含量的比值可以根據(jù)所使用的水溶性聚合物的種類適當(dāng)調(diào)整，例如，在水溶性聚合物為PVA時，可以設(shè)為1：1.1～100、優(yōu)選1：1.1～50、更優(yōu)選1：1.1～25、進而優(yōu)選1：3～15。含量過少時，無法期待作為白蛋白的替代物的效果；過多時，則擔(dān)心細胞毒性。

本發(fā)明提供以水溶性聚合物為有效成分的培養(yǎng)基添加劑(此后也稱為本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑)。

2.本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑

本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑中使用的水溶性聚合物與上述“1.本發(fā)明的培養(yǎng)基”中使用的水溶性聚合物的含義相同。含有水溶性聚合物的本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑以必要量添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基等中，在培養(yǎng)基性能維持方面，可以成為白蛋白的替代物，因此特別適合添加于含有白蛋白的培養(yǎng)基。這里，培養(yǎng)基中所含的白蛋白與上述“1.本發(fā)明的培養(yǎng)基”中使用的白蛋白的含義相同。

本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑中，除了作為有效成分的水溶性聚合物以外，可以含有培養(yǎng)基中優(yōu)選添加的各種因子。例如，可以含有上述“1.本發(fā)明的培養(yǎng)基”的部分所例示的、本身公知的添加物。

本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑在培養(yǎng)基性能維持方面可以成為白蛋白的替代物，即，具有防止培養(yǎng)基劣化的效果。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑還能夠適合作為含有白蛋白的培養(yǎng)基的劣化防止劑使用。

本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加量可以根據(jù)所期望的效果、所含有的水溶性聚合物的種類適當(dāng)選擇。例如，在使用PVA作為水溶性聚合物的培養(yǎng)基添加劑的情況下，添加于含有白蛋白的培養(yǎng)基、例如干細胞(特別是iPS細胞)增殖培養(yǎng)用的含有白蛋白的培養(yǎng)基時，以作為有效成分的水溶性聚合物的量計，通常以0.1～20mg/ml、優(yōu)選1～20mg/ml、更優(yōu)選1～10mg/ml、進而優(yōu)選3～7mg/ml的量來添加。此外，在最終制備后的培養(yǎng)基中，白蛋白和水溶性聚合物的含量比例可以設(shè)為1：1.1～100、優(yōu)選1：1.1～50、更優(yōu)選1：1.1～25、進而優(yōu)選1：3～15。

本發(fā)明提供干細胞的培養(yǎng)方法(此后也稱為本發(fā)明的培養(yǎng)方法)。

3.本發(fā)明的培養(yǎng)方法

本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括用本發(fā)明的培養(yǎng)基(參見上述“1.本發(fā)明的培養(yǎng)基”的部分)培養(yǎng)干細胞(優(yōu)選iPS細胞)的工序。

干細胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)器只要能夠進行干細胞的培養(yǎng)則沒有特別限定，可以列舉燒瓶、組織培養(yǎng)用燒瓶、皿、陪替氏培養(yǎng)皿(petri dish)、組織培養(yǎng)用皿、多聯(lián)皿、微平板、微孔板、多聯(lián)盤、多孔板、載玻片、腔室玻片、培養(yǎng)皿(Schale)、管、托盤、培養(yǎng)袋及滾瓶。

培養(yǎng)器可以為細胞粘附性，也可以為細胞非粘附性，根據(jù)目的適當(dāng)選擇。出于提高培養(yǎng)器表面與細胞的粘附性的目的，細胞粘附性的培養(yǎng)器可以用細胞外基質(zhì)(ECM)等任意細胞支持用基質(zhì)進行包被。細胞支持用基質(zhì)可以是以干細胞或飼養(yǎng)細胞(使用時)的粘附為目的的任意物質(zhì)。

其它的培養(yǎng)條件可以適當(dāng)設(shè)定。例如，對培養(yǎng)溫度沒有特別限定，可以為約30～40℃、優(yōu)選約37℃。CO₂濃度可以為約1～10％、優(yōu)選約2～5％。氧分壓可以為1～10％。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行的干細胞培養(yǎng)、或本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑向干細胞培養(yǎng)中的添加時機只要能夠獲得所期望的干細胞增殖促進效果則沒有特別限定。例如，可以將干細胞接種在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，也可以在將干細胞接種在含有白蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～數(shù)天、優(yōu)選培養(yǎng)1天后，在該培養(yǎng)基中添加本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑。或者用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基更換。

根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法增殖出的iPS細胞維持了未分化性質(zhì)。作為確認iPS細胞是否具有未分化性的方法，有以未分化標志作為指標來確認的方法。作為未分化標志，可以列舉堿性磷酸酶、Oct3/4、Sox2、Nanog、ERas、Esgl等。作為檢測這些未分化標志的方法，可以列舉檢測mRNA的方法、免疫學(xué)檢測方法等。

以下示出實施例更詳細地說明本發(fā)明，但這些對本發(fā)明的范圍沒有限定。

實施例

(材料和方法)

1.聚乙烯醇(PVA)

PVA使用以下物質(zhì)。

[日本合成化學(xué)公司制]

Gohsenol EG－05PW(水解率88％)

Gohsenol NL－05(水解率99％)

Gohsenol KL－05(水解率79％)

Gohsenol EG－03P(水解率88％)

[ACROS Organics公司制]

302780250(水解率78％)

[關(guān)東化學(xué)公司制]

32283－02(水解率86.5～89％)。

2.白蛋白

重組人白蛋白使用Novozymes公司制的重組人白蛋白。

品名：Recombumin及Albucult

人血清白蛋白使用將Baxter公司制白蛋白用活性炭(和光純藥公司制)處理后的產(chǎn)物。通過活性炭處理，白蛋白所負載的脂肪酸量(和光純藥公司制：使用LabAssay NEFA定量)降低到每1g白蛋白含1～2mg。

3.臨界膠束濃度(CMC)的測定

PVA的臨界膠束濃度(CMC)基于非專利文獻(Journal of Controlled Release,143卷,201-206頁,2010年)所述的方法通過使用熒光物質(zhì)芘的熒光強度測定法而計算。在不同濃度(0.01～50mg/ml)的PVA水溶液中混合6mM芘/丙酮溶液后，在室溫振蕩1小時。測定混合液對激發(fā)波長333nm及339nm的發(fā)射波長390nm的熒光強度(I－333及I－339)。對相對于PVA濃度的熒光強度比(I－339/I－333)作圖，將熒光強度比急劇上升時的PVA濃度作為CMC。結(jié)果如表1所示。

[表1]

各種PVA的臨界膠束濃度CMC測定結(jié)果

(結(jié)果)

實施例1：用iPS細胞增殖系統(tǒng)的評價－1

使用各種水溶性聚合物，評價人工多能干細胞(iPS細胞)的增殖效果。iPS細胞使用由iPS Academia Japan,Inc購買的201B7株。細胞培養(yǎng)使用包被了基底膜基質(zhì)(Nippon Becton Dickinson Company,Ltd.,制的基質(zhì)膠)的培養(yǎng)容器(Nippon Becton Dickinson Company,Ltd.,，F(xiàn)alcon培養(yǎng)皿或Falcon培養(yǎng)板)在5％CO₂/37℃的條件下進行。在iPS細胞用無血清細胞培養(yǎng)基Essential 8培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中以達到規(guī)定濃度的方式添加各種PVA以及各種白蛋白，作為受試培養(yǎng)基。將其立即用于培養(yǎng)或在4℃保管2～4周后用于培養(yǎng)，從而研究其效果。接種時使用的培養(yǎng)基中添加了Y－27632(最終濃度10μM，NACALAI TESQUE,INC.制：08945－84)。第二天起，使用未添加Y－27632的受試培養(yǎng)基培養(yǎng)。每2～3天進行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)1周后測定細胞數(shù)。細胞數(shù)的測定通過“改訂細胞培養(yǎng)入門ノート(修訂細胞培養(yǎng)入門筆記),77～83頁,2010年,羊土社”所述的方法來進行。需要說明的是，作為對照，用僅添加了白蛋白、未添加PVA的培養(yǎng)基同樣地進行培養(yǎng)。

評價基準如下。

◎：細胞數(shù)相對于對照為150％以上

○：細胞數(shù)相對于對照為120％以上且小于150％

□：細胞數(shù)相對于對照為100％以上且小于120％

－：細胞數(shù)相對于對照為50％以上且小于100％

×：細胞數(shù)相對于對照小于50％

結(jié)果如表2～4所示。

[表2]

在Essential 8培養(yǎng)基中添加PVA和Recombumin時的細胞評價結(jié)果

[表3]

在Essential 8培養(yǎng)基中添加PVA和Albucult時的細胞評價結(jié)果

[表4]

在Essential 8培養(yǎng)基中添加PVA和人血清白蛋白時的細胞評價結(jié)果

如表1所示，水解率為79％或88％的PVA的CMC為1mg/ml以下，與水解率為99％的PVA的CMC(20mg/ml)相比為明顯低的濃度，因此膠束形成能力高。

如表2、3所示，水解率為79％或88％的PVA與水解率為99％的PVA相比，添加濃度為1mg/ml及5mg/ml的任一者時，iPS細胞的增殖促進活性均良好。特別是添加濃度為5mg/ml時，就細胞數(shù)相對于對照為120％以上的頻度而言，在水解率為79％或88％的PVA時，在12個樣品中為9個樣品，與此相對，在水解率為99％的PVA時，在12個樣品中僅為3個樣品，效果的差異是明顯的。

進而，如表4所示，水解率為88％的PVA與人血清白蛋白一起添加時，iPS細胞的增殖促進活性也良好。

實施例2：用iPS細胞增殖系統(tǒng)的評價－2

使用PVA作為水溶性聚合物，來評價在含有白蛋白的培養(yǎng)基中的iPS細胞增殖效果。作為PVA，使用了Gohsenol EG－05PW，作為白蛋白，使用了人血清白蛋白。iPS細胞的入手及培養(yǎng)與實施例1同樣進行。在iPS細胞用無血清細胞培養(yǎng)基(feederless medium)Essential 8培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中以達到規(guī)定濃度的方式添加PVA以及白蛋白，作為受試培養(yǎng)基。將其立即用于培養(yǎng)或在4℃保管3周后用于培養(yǎng)，從而研究其效果。接種時使用的培養(yǎng)基中添加了Y－27632(最終濃度10μM，NACALAI TESQUE,INC.制：08945－84)。第二天起，使用未添加Y－27632的受試培養(yǎng)基培養(yǎng)。每2～3天進行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)1周后測定細胞數(shù)。細胞數(shù)的測定與實施例1同樣地進行。需要說明的是，作為對照，用僅添加了白蛋白(1.4mg/ml)、未添加PVA的培養(yǎng)基同樣地進行培養(yǎng)。

評價基準如下。

與對照相比，

◎：細胞增殖能力顯著高

○：細胞增殖能力為同等

△：細胞增殖能力顯著低

結(jié)果如表5所示。

[表5]

在Essential 8培養(yǎng)基中添加PVA和人血清白蛋白時的細胞評價結(jié)果

實施例3：未分化標志的測定

(測定方法)

利用實時PCR法進行的mRNA表達解析

將用各種受試培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞回收，用RNeasy Plus Mini Lit(Qiagen公司制)提取細胞中的總RNA。以所提取的各總RNA為模板，使用PrimerScript RT reagent Kit(寶生物公司制)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而合成cDNA。將其作為模板，使用各種正向引物以及反向引物(均委托Hokkaido System Science Co.,Ltd.來進行合成)、Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司制)，用7500Fast Real Time PCR system(Applied Biosystems公司制)進行PCR。mRNA表達量利用作為內(nèi)標的β－肌動蛋白(ActB)或GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，3-磷酸甘油醛脫氫酶)進行標準化。

(結(jié)果)

將結(jié)果示于圖1。如圖1所示，就作為iPS細胞的代表性未分化標志的Oct3/4以及Nanog的任一者而言，即使添加PVA且減少白蛋白量，其表達量也沒有變化。

由以上結(jié)果確認，PVA不影響iPS細胞的未分化性能。

產(chǎn)業(yè)上的利用可能性

如果使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，則能夠使干細胞高效地增殖。因此，能夠降低培養(yǎng)中的培養(yǎng)基更換頻度，能夠降低干細胞的培養(yǎng)成本。

本申請以在日本提出申請的日本特愿2014－070763(申請日2014年3月31日)為基礎(chǔ)，其內(nèi)容全部包含在本說明書中。