本申請(qǐng)要求2014年6月23日提交的標(biāo)題為“Compositions,Methods and Therapies for Administering Antigen Peptide”的美國(guó)專利申請(qǐng)系列No.14/312,162的優(yōu)先權(quán)，而該申請(qǐng)要求2011年12月22日提交的標(biāo)題為“Antigen Peptide and Use Thereof”的美國(guó)專利申請(qǐng)系列No.13/380,425、2011年5月23日提交的標(biāo)題為“Antigen Peptide and Use Thereof”的PCT國(guó)際申請(qǐng)系列PCT/JP2011/062305以及2010年5月27日提交的標(biāo)題為“Antigen Peptide and Use Thereof”的臨時(shí)申請(qǐng)61/396,574的優(yōu)先權(quán)。這些申請(qǐng)以引用方式并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明總體而言涉及抗原肽以及它們對(duì)抗粉剌丙酸桿菌(Propionibacterium acne)的用途。本發(fā)明進(jìn)一步包括抗原肽和抗腫瘤壞死因子(抗-TNF)的組合，以及它們對(duì)抗粉剌丙酸桿菌的用途。本發(fā)明還涉及用于治療患有粉刺丙酸桿菌的患者的方法和治療。更具體而言，本發(fā)明包括向患者給予治療有效量的抗原肽和抗-TNF。

背景技術(shù)：

粉刺是一種已知的炎性疾病，其通常出現(xiàn)在患者的多個(gè)部分上，由人機(jī)肌體的頸部延伸至面部。通常，粉刺在青春期是最普遍的，但是已知粉刺也可以在成人期發(fā)現(xiàn)。由于是在人類機(jī)體上的多個(gè)暴露的且可視的部分上形成的炎癥，所以粉刺可能對(duì)患有該疾病的人產(chǎn)生明顯的心理影響。

已經(jīng)研發(fā)出多種用于粉刺的治療試劑。具體而言，已經(jīng)研發(fā)了多種直接作用于作為粉刺病原體的粉刺丙酸桿菌的藥品。

在本領(lǐng)域中，已經(jīng)測(cè)定了粉刺丙酸桿菌的完整基因組序列，由此知曉粉刺丙酸桿菌的許多基因編碼毒性因子。基于該信息，關(guān)于粉刺丙酸桿菌的唾液酸酶的研究已經(jīng)在研發(fā)疫苗中進(jìn)行。

腫瘤壞死因子(TNF)是一種在整個(gè)機(jī)體中循環(huán)的細(xì)胞因子。TNF對(duì)于有效的免疫監(jiān)視而言是重要的，并且是自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的適當(dāng)增殖和功能所必需的。TNF的主要作用是免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)。已知TNF可以導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥，其可以導(dǎo)致多種慢性狀況?？?TNF(也稱為TNF阻斷劑或抑制劑)干擾TNF的機(jī)體生產(chǎn)，由此有效地減少炎癥。

研發(fā)用于治療粉刺丙酸桿菌的大部分藥品作用于作為粉刺病因的粉刺丙酸桿菌細(xì)菌細(xì)胞，并發(fā)揮抗炎作用。因此，在其中再次感染粉刺丙酸桿菌的情況下，會(huì)再次發(fā)生炎癥。因此，使用此類藥品是暫時(shí)有效的，但是它們的使用會(huì)誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌的出現(xiàn)，這使得治療更加困難。

本領(lǐng)域需要研發(fā)對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的抗原肽，以及給予抗原肽以消退、減少或消除患者中粉刺丙酸桿菌的治療和方法，更具體而言，需要能夠持續(xù)治療粉刺的治療和方法。理想的是給予的治療和方法在合理的時(shí)間內(nèi)是有效的。粉刺的持續(xù)治療包括免疫治療，即疫苗。不想被任何特定的理論所束縛，相信建立有效的抗粉刺免疫力(特定的粉刺丙酸桿菌的識(shí)別和免疫記憶)可以立即消除粉刺丙酸桿菌，至少是被相同的粉刺丙酸桿菌菌株的再次感染。因此，合理地希望免疫治療可以發(fā)揮持續(xù)的抗炎作用。

根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由氨基酸序列構(gòu)成的肽和抗-TNF可以高效地抑制粉刺丙酸桿菌在患者中引起的炎癥。

發(fā)明概述

在一個(gè)方面中，本發(fā)明通過(guò)提供包含肽和抗-TNF的組合物而解決上述需要。所述的肽包含以下一種或多種：(a)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；(b)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽；(c)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；以及(d)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽。

在所述的組合物中存在的肽可以包括：(e)多價(jià)抗原肽形式的肽，其中所述的多價(jià)抗原肽是通過(guò)將上述(a)或(b)中所述的多個(gè)肽通過(guò)連接子結(jié)合而獲得的，以及(f)多價(jià)抗原肽形式的肽，其中所述的多價(jià)抗原肽是通過(guò)將上述(c)或(d)中所述的多個(gè)肽通過(guò)連接子結(jié)合而獲得的。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了抑制患者中由粉刺丙酸桿菌感染引起的炎癥的方法。所述的方法包括將肽和抗-TNF引入至患者中。所述的肽包括以下中的一種或多種：(a)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；(b)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽；(c)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；以及(d)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽。

在某些實(shí)施方案中，所述的肽和抗-TNF同時(shí)被引入至患者中。所述的肽和抗-TNF可以結(jié)合從而形成組合物，并且該組合物可以被引入至患者中。在其他的實(shí)施方案中，所述的肽和抗-TNF可以分別被引入至患者中。所述的肽和抗-TNF可以依次被引入至患者中。所述的肽或抗-TNF的任意一者可以被引入至患者中，然后引入另外一者。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供對(duì)抗分泌丙酸桿菌的疫苗，包括上文所述的肽和抗-TNF。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供編碼上文所述的肽的多核苷酸。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供上文所述的多核苷酸可操作地連接的表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體的應(yīng)用能夠提供肽，該肽可以抑制由粉刺丙酸桿菌感染引起的炎癥。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供特異性地識(shí)別上文所述的肽的抗體。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定疫苗對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的效力的方法。所述的方法包括檢測(cè)編碼上文所述的肽的多核苷酸是否存在于由活機(jī)體收集得到的樣品中的步驟。本發(fā)明的方法的用途能夠容易地在將該疫苗給予活機(jī)體之前測(cè)定對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗在活機(jī)體中是否有效。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的方法，其包括將上文所述的疫苗給予個(gè)體的步驟，其中所述的疫苗包含治療有效量的所述的肽和抗-TNF。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的方法，其包括將上文所述的疫苗給予個(gè)體的步驟，其中所述的疫苗包含治療有效量的多核苷酸和抗-TNF。

附圖簡(jiǎn)述

當(dāng)與附圖相結(jié)合進(jìn)行閱讀時(shí)，可以由以下優(yōu)選的實(shí)施方案的描述進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中：

圖1為顯示測(cè)量炎性區(qū)域的結(jié)果的圖，其中所述的炎性區(qū)域是通過(guò)將粉刺丙酸桿菌注射至各個(gè)部分中引起的；

圖2為顯示在由注射粉刺丙酸桿菌引起的炎性區(qū)域與注射后流逝的時(shí)間之間的關(guān)系的圖；

圖3為示出檢測(cè)肽的抗炎作用的步驟的圖；

圖4為顯示檢測(cè)肽的抗炎作用的結(jié)果的圖；

圖5為顯示檢測(cè)肽的抗炎作用的另一個(gè)結(jié)果的圖；

圖6為比較由患者分離的菌株的16S rDNA堿基序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA堿基序列的圖；

圖7為顯示檢測(cè)肽對(duì)抗由患者分離的粉刺丙酸桿菌的注射物的抗炎作用的結(jié)果的圖；

圖8為顯示使用根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的疫苗接種的粉刺患者后續(xù)情況的照片的圖；

圖9為顯示使用根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的疫苗接種的另一位粉刺患者后續(xù)情況的照片的圖；

圖10為顯示使用根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的疫苗接種的另一位粉刺患者后續(xù)情況的照片的圖；以及

圖11為顯示使用根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的疫苗接種的另一位粉刺患者后續(xù)情況的照片的圖。

序列表

使用標(biāo)準(zhǔn)的字母縮寫顯示在所附序列表中列出的氨基酸序列，并且該序列表以引用方式并入本文。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了針對(duì)患者的粉刺丙酸桿菌以及由其導(dǎo)致的炎癥的組合物、方法和治療。所述的組合物、方法和治療包括抗原肽的使用。在某些實(shí)施方案中，抗原肽與抗-TNF組合給予。在抗-TNF存在或不存在下，所述的抗原肽能夠引起對(duì)抗粉刺丙酸桿菌感染的免疫應(yīng)答，并且減少或預(yù)防由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥。本發(fā)明的抗原肽具有極高的抗原性。因此，使用肽、同時(shí)具有抗-TNF或不具有抗-TNF都可以提供對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗。

在某些實(shí)施方案中，使用肽并結(jié)合抗-TNF可以產(chǎn)生相對(duì)于減少或消除由粉刺丙酸桿菌導(dǎo)致的炎癥而言增強(qiáng)的或改善的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明使用的抗-TNF可以是多種形式。例如抗-TNF可以被引入至傳遞機(jī)制中，例如液態(tài)載體或媒介物，從而促進(jìn)引入(例如注射)。

根據(jù)本發(fā)明使用的抗-TNF可以包括多種合適的材料。非限定性實(shí)例包括可以證明抗-TNF作用或結(jié)果(例如減少由TNF產(chǎn)生的炎癥)的任何材料。此外，根據(jù)本發(fā)明使用的合適的抗-TNF材料可以選自本領(lǐng)域已知的多種抗-TNF材料。在某些實(shí)施方案中，可以使用TNF抑制劑，包括融合蛋白質(zhì)，包括但不限于依那西普。依那西普是市售可得的，商品名為Enbrel。

根據(jù)本發(fā)明使用的肽可以為以下肽(a)至(d)中的一種或多種：

(a)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；

(b)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽，所述的肽通過(guò)免疫應(yīng)答而生成抑制粉刺丙酸桿菌增加的抗體；

(c)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；以及

(d)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽，所述的肽通過(guò)免疫應(yīng)答而生成抑制粉刺丙酸桿菌增加的抗體。

在本發(fā)明中，“多個(gè)氨基酸”可以為例如2個(gè)或3個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地，為2個(gè)氨基酸。

在其中氨基酸被取代的實(shí)施方案中，優(yōu)選的取代為一個(gè)氨基酸取代為與所述的一個(gè)氨基酸具有相同性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸，例如一個(gè)氨基酸取代為與所述的一個(gè)氨基酸具有相同側(cè)鏈官能團(tuán)的另一個(gè)氨基酸(例如Arg取代為L(zhǎng)ys，Asp取代為Glu)；以及一個(gè)疏水性氨基酸取代為另一個(gè)疏水性氨基酸(例如Val取代為Ile)。

本發(fā)明和權(quán)利要求書所用的術(shù)語(yǔ)“肽”與“多肽”或“蛋白質(zhì)”可交換使用。

由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽相當(dāng)于粉刺丙酸桿菌的膜蛋白中從第90個(gè)氨基酸殘基至第103個(gè)氨基酸殘基的氨基酸殘基，其中所述的粉刺丙酸桿菌的膜蛋白由Genbank/EMBL/DDBJ中以登錄號(hào)No.AAT84059登記的氨基酸序列構(gòu)成。由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽相當(dāng)于粉刺丙酸桿菌的膜蛋白中由第260個(gè)氨基酸殘基至第272個(gè)氨基酸殘基的氨基酸殘基，其中所述的粉刺丙酸桿菌的膜蛋白由Genbank/EMBL/DDBJ中以登錄號(hào)No.YP_056445登記的氨基酸序列構(gòu)成。

通常，在抗體的生產(chǎn)中，作為優(yōu)異的抗原的氨基酸序列為親水性氨基酸序列和具有豐富電荷的氨基酸序列，還有預(yù)計(jì)具有轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。電荷可以是正電或負(fù)電，并且理想的是包括至少5個(gè)帶電荷的氨基酸。此外，所選的氨基酸的長(zhǎng)度優(yōu)選地相當(dāng)于10至15個(gè)殘基。相應(yīng)地選擇SEQ NO.1或3所示的氨基酸序列。

這些肽誘導(dǎo)了對(duì)于粉刺丙酸桿菌(其為異型生物質(zhì)的)的免疫力。推斷在免疫力的誘導(dǎo)中，由于誘導(dǎo)了Th2為主的免疫力，因此誘導(dǎo)了特異性抗體的產(chǎn)生。

生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的肽的方法可以使用化學(xué)合成或表達(dá)載體。在其中使用化學(xué)合成的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以通過(guò)公知的合成方法生產(chǎn)。非限定性實(shí)例包括但不限于液相肽合成和固相肽合成。在其中使用表達(dá)載體的實(shí)施方案中，肽可以由其中已引入表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)，或者可以使用體外翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)。例如編碼所述的肽的多核苷酸(例如包含SEQ NO.2或4所示的堿基序列的多核苷酸)被插入至表達(dá)載體中，并且該表達(dá)載體被引入至宿主細(xì)胞中。靶肽可以在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。本發(fā)明和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化子”不僅指細(xì)胞、組織和器官，還指活有機(jī)體本身。用于制備轉(zhuǎn)化子的方法包括本領(lǐng)域公知的操作，例如通過(guò)將重組載體引入至宿主中的轉(zhuǎn)化。待轉(zhuǎn)化的活有機(jī)體的非限定性實(shí)例包括但不限于微生物、植物和動(dòng)物。基因引入至宿主細(xì)胞中可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種操作來(lái)證實(shí)，例如但不限于PCR、Southern雜交和Northern雜交。

在其中通過(guò)制備轉(zhuǎn)化子來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的肽的實(shí)施方案中，優(yōu)選的是所述的肽在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)。但是，所述的肽可以在宿主細(xì)胞中短暫表達(dá)。由此生產(chǎn)的肽可以通過(guò)已知的方法純化。用于純化所述的肽的合適的方法的非限定性實(shí)例包括但不限于凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析和親和層析。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的肽可以為多價(jià)抗原肽的形式(其還可以稱為MAP：多重抗原肽)，其是通過(guò)將下文所述的多種肽(a)或(b)通過(guò)連接子結(jié)合或者通過(guò)將下文所述的多種肽(c)或(d)通過(guò)連接子結(jié)合而獲得的：

(a)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；

(b)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽，所述的肽通過(guò)免疫應(yīng)答而生成抑制粉刺丙酸桿菌增加的抗體；

(c)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；以及

(d)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列通過(guò)缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列構(gòu)成的肽，所述的肽通過(guò)免疫應(yīng)答而生成抑制粉刺丙酸桿菌增加的抗體。

MAP是能夠顯示較高抗原性的肽，并且是通過(guò)以下方式獲得的多價(jià)肽：將連接子添加至特定肽的C-末端，并通過(guò)連接子將該特定的肽與基于Lys構(gòu)建的MAP結(jié)構(gòu)(基質(zhì))結(jié)合。MAP可以通過(guò)傳統(tǒng)的已知方法合成。在一個(gè)MAP分子中所包含的特定肽的數(shù)量沒(méi)有特別限定，但是優(yōu)選為5個(gè)或更多。在一個(gè)MAP分子中所包含的特定肽的數(shù)量的上限沒(méi)有限定，因?yàn)榫涂乖远裕@一數(shù)量?jī)?yōu)選為較大。在某些實(shí)施方案中，局限可能是由于合成技術(shù)，因此，可以生產(chǎn)特定肽的數(shù)量為15個(gè)分子或更少的MAP。

通常，Cys殘基用作構(gòu)成連接子的氨基酸，其中所述的連接子被添加至特定的肽中。但是，在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的MAP形式的肽中，在特定肽與Cys殘基之間使用包含Gly殘基的連接子。具體而言，-GlyCys或-GlyGlyCys作為連接子被添加至特定肽的C-末端。例如-GlyCys被添加至由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽的C-末端，而-GlyGlyCys被加入至由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽的C-末端。由于在Cys殘基與該特定肽的C-末端之間添加了Gly殘基，所以該Cys殘基具有旋轉(zhuǎn)柔性，這樣當(dāng)該特定肽與MAP結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí)，所述的肽不會(huì)遭受位阻，并且連接子處的Cys殘基可以形成角，該角能夠使得Cys殘基接近于MAP反應(yīng)性基團(tuán)。本發(fā)明的MAP形式的肽中的連接子不限于所述的連接子，并且可以為由Cys殘基構(gòu)成的一般的連接子。

在另一個(gè)方面中，以肽組合物形式提供本發(fā)明的肽，其中所述的肽組合物包含肽(e)或(f)，如下所示：

(e)多價(jià)抗原肽形式的肽，其中所述的多價(jià)抗原肽是通過(guò)將多個(gè)所述的肽(a)或(b)通過(guò)連接子結(jié)合而獲得的；以及

(f)多價(jià)抗原肽形式的肽，其中所述的多價(jià)抗原肽是通過(guò)將多個(gè)所述的肽(c)或(d)通過(guò)連接子結(jié)合而獲得的。

本文和權(quán)利要求書所用的術(shù)語(yǔ)“肽組合物”是指包含多種肽成分的物質(zhì)。

各個(gè)肽成分可以以多種比例組合，從而形成肽組合物。各成分的比例沒(méi)有特別限定，并且可以是例如1:1(重量比)。此外，為了確保較高的免疫原性，肽組合物優(yōu)選地包含多價(jià)抗原肽形式的肽(其中所述的多價(jià)抗原肽是通過(guò)將多個(gè)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽通過(guò)連接子結(jié)合而獲得)，以及多價(jià)抗原肽形式的肽(其中所述的多價(jià)抗原肽是通過(guò)將多個(gè)由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽通過(guò)連接子結(jié)合而獲得)。

此外，本發(fā)明提供了編碼肽(a)-(d)的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸的非限定性實(shí)例包括但不限于由SEQ NO.2或4所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“堿基序列”與“核酸序列”或“核苷酸序列”可互換使用，并且表示為脫氧核糖核苷酸序列(簡(jiǎn)寫為A、G、C和T)。SEQ NO.2所示的堿基序列編碼由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，SEQ NO.4所示的堿基序列編碼由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。

本發(fā)明的多核苷酸可以為DNA或RNA形式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的肽的氨基酸序列信息和編碼所述肽的堿基序列信息容易地生成本發(fā)明的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明的多核苷酸可以通過(guò)一般的DNA合成或PCR生產(chǎn)。

此外，本發(fā)明提供了包含編碼所述的肽的多核苷酸的載體。當(dāng)所述的載體用于所述肽的生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選的是所述的載體為多核苷酸可操作地連接的表達(dá)載體。如本文和權(quán)利要求書中所用，短語(yǔ)“可操作地連接”是指編碼靶肽的多核苷酸處于控制區(qū)域(例如啟動(dòng)子)的控制之下，并且能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述的肽。用于使編碼靶肽的多核苷酸與表達(dá)載體“可操作地連接”以便構(gòu)建所需的載體的操作是本領(lǐng)域公知的。此外，將表達(dá)載體引入至宿主細(xì)胞中的技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)所需的肽。

本發(fā)明的肽和/或本發(fā)明的多核苷酸的使用能夠誘導(dǎo)對(duì)粉刺丙酸桿菌的免疫力。此外，本發(fā)明的肽和/或多核苷酸組合抗-TNF能夠誘導(dǎo)對(duì)粉刺丙酸桿菌的免疫力。換言之，本發(fā)明的肽和/或肽/抗-TNF組合、和/或本發(fā)明的多核苷酸和/或多核苷酸/抗-TNF組合可以起到對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗的作用。因此，本發(fā)明的肽和/或肽/抗-TNF組合、和/或本發(fā)明的多核苷酸和/或多核苷酸/抗-TNF組合的使用能夠抑制由于粉刺丙酸桿菌引起的真皮內(nèi)炎癥(例如粉刺和丘疹)。

本發(fā)明還包括對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗，包括上文提及的肽和/或肽/抗-TNF組合、上文提及的肽組合和/或肽組合/抗-TNF組合、或者上文提及的多核苷酸和/或多核苷酸/抗-TNF組合作為有效成分。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指可用于免疫治療(疫苗治療)并誘導(dǎo)對(duì)本發(fā)明的肽具有特異性的免疫應(yīng)答的疫苗。

本發(fā)明的疫苗可以以疫苗組合物的形式或疫苗試劑盒的形式提供。在本發(fā)明中，“包含有效成分的疫苗組合物”和“包含有效成分的疫苗試劑盒”通常稱為“包含有效成分的疫苗”。“試劑盒”是指其中各成分被包含在不同的物質(zhì)中、使得所述至少一種成分被包含在一種物質(zhì)中而其余的成分包含在另一種物質(zhì)中的形式。疫苗組合物和疫苗試劑盒在下文中詳細(xì)描述。

通常，術(shù)語(yǔ)“疫苗組合物”是指“其中兩種或多種成分作為整體存在、從而所述成分被認(rèn)為是一種物質(zhì)的疫苗物質(zhì)”。本發(fā)明的疫苗的給予可以是例如肽或者肽和抗-NTF的單一給予，其中所述的肽由SEQ NO.1所示的氨基酸序列或者由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成，或者為這兩種肽的混合物。在其中使用兩種肽的混合物的實(shí)施方案中，即使粉刺丙酸桿菌的抗原蛋白質(zhì)(該抗原蛋白質(zhì)相當(dāng)于兩種肽中的一種)的氨基酸序列突變，并且所述一種肽的抗炎作用喪失，另一種肽仍可以賦予抗炎作用。此類組合物除了所述的肽和抗-TNF以外，可以包含其他的成分(例如藥物可接受的支持物)。

通常，當(dāng)所述的肽、抗-TNF和任何其他的成分沒(méi)有組合成疫苗組合物時(shí)，各成分的組合不能視為一種組合物，但是可以被術(shù)語(yǔ)“試劑盒”所涵蓋，并且可以以試劑盒的形式提供。這可以被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地理解。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的肽和/或肽和抗-TNF的疫苗組合物。在其他的實(shí)施方案中，疫苗組合物包含本發(fā)明的多核苷酸和/或多核苷酸和抗-TNF。所述的多核苷酸優(yōu)選為能夠表達(dá)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的肽的形式，并且更優(yōu)選地以表達(dá)載體(其中本發(fā)明的多核苷酸與該表達(dá)載體可操作地連接)的形式提供。如上文所述，本發(fā)明的肽或本發(fā)明的多核苷酸在制備對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗中被用作有效的疫苗成分。

本發(fā)明的疫苗可以用作對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的預(yù)防性疫苗或治療性疫苗。如本文和權(quán)利要求書中所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防性疫苗”是指給予未感染的且未治療的個(gè)體以預(yù)防該個(gè)體免于被疾病感染的疫苗。如本文和權(quán)利要求書所用，術(shù)語(yǔ)“治療性疫苗”是指給予已經(jīng)感染疾病的個(gè)體以改善感染或使得感染盡可能小或消除疾病的免疫病理學(xué)作用的疫苗。

用于制備包含有效成分的疫苗的多種常規(guī)方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，并且可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的疫苗。所述的疫苗可以以溶液或懸液形式制備，使得它們可以注射至患者中。備選地，本發(fā)明的疫苗可以以合適的固體形式制備，從而在注射至患者中之前溶解或懸浮在溶液中。此類制備物可以乳化，或者可以為在核糖體中乳化的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的疫苗組合物的有效成分(多種)可以與藥物可接受的并且與有效成分相容的稀釋劑混合。稀釋劑的優(yōu)選的實(shí)例包括水、生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇和它們的混合物。此外，如果需要，本發(fā)明的疫苗組合物可以包括少量的輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、以及pH緩沖劑。

本發(fā)明的疫苗組合物可以通過(guò)注射(包括真皮內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)注射)以多種途徑(例如鼻腔、粘膜、口服、陰道內(nèi)、尿道和眼內(nèi))給予，或者可以使用貼劑(皮內(nèi)給予)或栓劑等非口服給予。

本發(fā)明的疫苗組合物可以口服給予。就口服給予而言，本發(fā)明的疫苗組合物可以與稀釋劑組合使用，例如醫(yī)藥級(jí)甘露醇,乳糖,淀粉,硬脂酸鎂,糖酸鈉,纖維素和碳酸鎂。本發(fā)明的疫苗組合物在口服給予時(shí)，可以為溶液、懸液、片劑、藥丸、膠囊、持釋配制物或散劑的形式。在其中本發(fā)明的疫苗組合物以凍干形式提供的實(shí)施方案中，凍干物質(zhì)在給予之前可以再構(gòu)建成懸液。再構(gòu)建優(yōu)選在緩沖溶液中實(shí)施。

本發(fā)明的疫苗組合物可以包含用于增強(qiáng)疫苗的效力的佐劑。有效的佐劑的實(shí)例包括但不限于氫氧化鋁,磷酸鋁,硫酸鋁鉀(明礬),硫酸鈹,硅石,高嶺土,碳,油包水型乳液,水包油型乳液,胞壁酰二肽,細(xì)菌內(nèi)毒素,脂肪X,百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis),短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum),多聚核糖核苷酸,海藻酸鈉,羊毛脂,溶血卵磷脂,維生素A,sponin,脂質(zhì)體,左旋咪唑,DEAE-葡聚糖,嵌段共聚物和其他合成佐劑。這些佐劑可以購(gòu)自多個(gè)供應(yīng)商。這些佐劑的代表性實(shí)例包括水包油類型的佐劑、氫氧化鋁佐劑和與這些佐劑混合的佐劑。允許施加至人類的佐劑為氫氧化鋁。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了疫苗試劑盒。疫苗試劑盒相當(dāng)于上文提及的疫苗組合物，并且可以包含本發(fā)明的肽或本發(fā)明的多核苷酸作為有效疫苗成分，并且可以包含抗-TNF，而且可以進(jìn)一步包含一種或多種可任選的成分。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗試劑盒包含本發(fā)明的肽和/或肽和抗-TNF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗試劑盒包含本發(fā)明的多核苷酸和/或多核苷酸和抗-TNF。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為能夠表達(dá)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的肽的形式，并且更優(yōu)選為以表達(dá)載體的形式提供，其中本發(fā)明的多核苷酸與所述的表達(dá)載體可操作地連接。

所述的試劑盒通常包含具有一個(gè)或多個(gè)容器(例如瓶子、板、管和盤)的包裝，其中所述的容器中具有特定的材料。所述的試劑盒優(yōu)選地具有使用包含在構(gòu)成該試劑盒的各個(gè)容器任何一個(gè)中的各材料的使用說(shuō)明。此外，本發(fā)明的試劑盒可以為其中包含多種不同的組合物的包裝。所述的組合物的形式可以如上文所述，并且如果所述的組合物為溶液形式，則該組合物可以包含在容器中?？梢栽O(shè)計(jì)本發(fā)明的試劑盒，使得材料A和B混合并包含在單一的容器中，或者包含在各個(gè)容器中?！笆褂谜f(shuō)明”可以書寫于紙上或其他類型的媒介物上，或者可以打印出來(lái)。備選地，“使用說(shuō)明”可以為磁帶或電子媒介物的形式，例如計(jì)算機(jī)可讀光盤或帶、以及CD-ROM。此外，本發(fā)明的試劑盒可以包含裝有稀釋劑、溶劑、清洗液或其他試劑的容器。此外，所述的試劑盒可以事先包含預(yù)防/治療由于粉刺丙酸桿菌感染引起的粉刺所需的設(shè)備。

如上文所述，本發(fā)明的疫苗的使用能夠高效地預(yù)防/治療由于粉刺丙酸桿菌感染引起的炎癥(粉刺)。

換言之，用于治療或預(yù)防由粉刺丙酸桿菌引起的感染的方法包括以下步驟：向個(gè)體給藥疫苗，該疫苗包含治療有效量的本發(fā)明的肽或治療有效量的本發(fā)明的多核苷酸，以及任選地治療有效量的抗-TNF。

本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指其量能夠使所述的肽或所述的多核苷酸發(fā)揮所需的治療作用或預(yù)防作用的肽或多核苷酸的量。在其中存在抗-TNF的多個(gè)實(shí)施方案中，抗-TNF也可以以治療有效量存在。治療有效量可以根據(jù)給予疫苗的個(gè)體的年齡、體重和其他健康狀況，根據(jù)待治療的炎癥的狀況以及給予的方法而不同。在所有情況下，在最基礎(chǔ)的水平下，所需的作用是與使用本發(fā)明的治療方法之前患者腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞相比，該患者的腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞消退、減少或消除。在皮下給予的某些實(shí)施方案中，疫苗的給予可以使得在一次給予中提供5-10μg肽/kg體重或10-50μg多核苷酸/kg體重。為了誘導(dǎo)足以抗炎癥的免疫應(yīng)答，可以將所述的疫苗多次、兩次或更多次地給予患者。在某些實(shí)施方案中，以預(yù)定的間隔進(jìn)行給予。

另一個(gè)實(shí)例如下：在疫苗(其包含基于由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽的MAP與基于由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽的MAP的混合物(重量比為1:1))的情況下，可以以下方式通過(guò)皮下注射進(jìn)行給予：以生理鹽水溶液的形式5次上下、按3至5天的時(shí)間間隔給予100-500μg各種肽/注射。

在通過(guò)貼劑給予的情況下，一劑可以較少，劑量的數(shù)量可以減少，并且個(gè)體可以使用貼劑治療自己。

本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“患者或個(gè)體”是指?jìng)€(gè)人和除了人類以外的哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、兔、豬、牛和猴)。

本發(fā)明提供了特異性識(shí)別本發(fā)明的任意一種肽的抗體。換言之，本發(fā)明的抗體可以特異性地結(jié)合任意一種所述的肽。在某些實(shí)施方案中，所述的抗體優(yōu)選為與以下物質(zhì)結(jié)合的抗體：(1)由SEQ NO.1或3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽；或者(2)通過(guò)MAP工藝由SEQ NO.1或3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽合成的多價(jià)抗原肽。

本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白(IgA,IgD,IgE,IgG,IgM及其Fab片段，F(xiàn)(ab')₂片段和Fc片段)?？贵w的實(shí)例包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體和抗獨(dú)特性抗體。

本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法生產(chǎn)。例如所述的抗體可以通過(guò)以下方法獲得：將本發(fā)明的肽給予哺乳動(dòng)物的活的機(jī)體并導(dǎo)致免疫應(yīng)答，從而在活的機(jī)體中生產(chǎn)抗體。在這種情況下獲得的抗體通常為多克隆抗體?？梢允褂帽景l(fā)明的肽通過(guò)常規(guī)的已知雜交瘤技術(shù)來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體。備選地，可以利用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體。

本發(fā)明的抗體的使用能夠使人們?nèi)菀椎丶兓景l(fā)明的肽。例如通過(guò)使用本發(fā)明的抗體對(duì)本發(fā)明的肽(使用本發(fā)明的載體或本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子在細(xì)胞中表達(dá))進(jìn)行親和純化，可以高效地收集所述的肽。

本發(fā)明的抗體可以是任何抗體，只要該抗體特異性地結(jié)合本發(fā)明的肽即可。就各免疫球蛋白(IgA,IgD,IgE,IgG或IgM)的種類、用于制備嵌合抗體的方法、用于制備肽抗原的方法等而言，所述的抗體沒(méi)有限定，這在本發(fā)明中具體說(shuō)明。因此，通過(guò)除了上文所述的方法以外的方法獲得的抗體也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

用于測(cè)定疫苗對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的效力的本發(fā)明的方法僅需要包含測(cè)定編碼上文所述的肽的多核苷酸是否存在于由活機(jī)體收集得到的樣品中的檢測(cè)步驟，并且就其他特定的步驟以及待使用的儀器和裝置而言沒(méi)有特別限定。

在其中在檢測(cè)步驟中檢測(cè)編碼所述肽的多核苷酸的情況下，可以確定對(duì)測(cè)試受試對(duì)象給予本發(fā)明的疫苗非常可能高效地抑制由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥。具體而言，當(dāng)檢測(cè)編碼上文所述的肽的多核苷酸時(shí)，可以確定本發(fā)明的疫苗有可能有效地對(duì)抗粉刺丙酸桿菌。

用于檢測(cè)編碼所述的肽的多核苷酸的方法沒(méi)有特別限定。例如所述的方法可以是通過(guò)PCR擴(kuò)增的檢測(cè)，或者是通過(guò)測(cè)定PCR產(chǎn)物的堿基序列的檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定PCR產(chǎn)物的堿基序列，可以更精確地測(cè)定接種的作用是否發(fā)揮。還可以根據(jù)擴(kuò)增是否產(chǎn)生PCR片段來(lái)測(cè)定接種的作用是否發(fā)揮。例如，在其中使用用于擴(kuò)增上述多核苷酸的特定引物通過(guò)擴(kuò)增來(lái)生成所需長(zhǎng)度的片段的情況下(在其中PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的情況下)，測(cè)試受試對(duì)象非常有可能感染了保留有上述多核苷酸的粉刺丙酸桿菌，這樣可以確定接種的作用是高度預(yù)計(jì)的。另一方面，在其中未生成具有所需長(zhǎng)度的片段的情況下(在其中PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性的情況下)，可以確定接種的作用預(yù)計(jì)很小。在PCR擴(kuò)增之前，可以通過(guò)培養(yǎng)所述的樣品使得由測(cè)試受試對(duì)象收集得到的樣品中所包含的粉刺丙酸桿菌生長(zhǎng)。

通過(guò)檢測(cè)由活的機(jī)體收集得到的樣品中是否存在粉刺丙酸桿菌的16S rDNA的部分序列，可以確定是否應(yīng)用抗粉刺丙酸桿菌的本發(fā)明的疫苗的方法。16S rDNA的部分序列是否存在的檢測(cè)可以是通過(guò)PCR擴(kuò)增的檢測(cè)以及通過(guò)測(cè)定PCR產(chǎn)物的堿基序列的檢測(cè)。該檢測(cè)可以表明測(cè)試受試對(duì)象的炎癥衍生自粉刺丙酸桿菌。這可以是使用所述疫苗的基礎(chǔ)。

模型動(dòng)物(其為除了人類以外的哺乳動(dòng)物，例如下文提及的實(shí)施例中的小鼠，其腹中線經(jīng)皮注射具有預(yù)定細(xì)菌細(xì)胞濃度或更高濃度的粉刺丙酸桿菌，從而導(dǎo)致粉刺丙酸桿菌的炎癥)和用于制備模型動(dòng)物的方法也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在模型動(dòng)物中，以比傳統(tǒng)的創(chuàng)建炎癥的方法更高效的方式來(lái)創(chuàng)建粉刺丙酸桿菌的炎癥。用于研發(fā)抗粉刺藥品的目前已經(jīng)使用的測(cè)定系統(tǒng)是基于所述的藥品已經(jīng)施加的假設(shè)。因此，在研發(fā)疫苗的過(guò)程中，還沒(méi)有構(gòu)建好已得到確認(rèn)的、能夠測(cè)定疫苗體內(nèi)效果的測(cè)定系統(tǒng)。用于測(cè)定疫苗的效力的方法、模型動(dòng)物和制備模型動(dòng)物的方法可以優(yōu)選地用于研發(fā)對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗。

參照實(shí)施例，下文更詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案。應(yīng)該注意本發(fā)明不限于以下實(shí)施例，并且其細(xì)節(jié)可以修改。本發(fā)明不限于上述實(shí)施方案的描述，但是技術(shù)人員可以在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)改變?；诓煌瑢?shí)施方案中公開(kāi)的技術(shù)手段的適當(dāng)組合的實(shí)施方案涵蓋在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。說(shuō)明書中引用的所有文件均以引用方式并入本文。

實(shí)施例

實(shí)施例1-粉刺丙酸桿菌的培養(yǎng)

粉剌丙酸桿菌的菌株(下文簡(jiǎn)稱為“P.acnes”(ATCC6919))購(gòu)自RIKEN BioResource Center(JCM編號(hào)No.6425)。將購(gòu)得的粉剌丙酸桿菌的菌株根據(jù)得自上述中心的培養(yǎng)條件信息培養(yǎng)。具體而言，在厭氧的手套式操作箱中，將粉剌丙酸桿菌的菌株懸浮于100ml GAM培養(yǎng)基(由Nippon Suisan Kaisha,Ltd.制造)中，并使用小瓶在37℃下厭氧培養(yǎng)3天。

實(shí)施例2-粉剌丙酸桿菌引起小鼠皮膚產(chǎn)生皮內(nèi)炎癥

將粉剌丙酸桿菌的活細(xì)菌細(xì)胞放置于脫氣的生理鹽水中，同時(shí)保持厭氧狀態(tài)，由此制備粉剌丙酸桿菌的活細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量為5x10⁷細(xì)胞/ml,1x10⁸細(xì)胞/ml或5x10⁸細(xì)胞/ml的懸液。通過(guò)噴射氮?dú)獗３謪捬鯒l件。根據(jù)以下假設(shè)來(lái)計(jì)算粉剌丙酸桿菌的活細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量：通過(guò)分光光度計(jì)在550nm下測(cè)量的OD測(cè)量值0.98-1.02相當(dāng)于5x10⁸個(gè)細(xì)胞/ml，參見(jiàn)Ramstad S.et al.,Photochem.Photobiol.Sci.,2006,5,66-72。

將50μl制備的粉剌丙酸桿菌懸液皮內(nèi)注射至Balb/c雄鼠(9-10周齡)的剃過(guò)毛的腹中線、頸部、腰椎背部、尾根背部和耳部。以預(yù)定的次數(shù)測(cè)量各部分上的炎性區(qū)域(長(zhǎng)軸x短軸：mm²)，該區(qū)域皮內(nèi)注射有所述的懸液。各組由5個(gè)個(gè)體組成。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在其中注射粉剌丙酸桿菌(其細(xì)菌細(xì)胞濃度為5x10⁸細(xì)胞/ml)懸液的組中，可顯然證明了炎癥。圖1為顯示在注射后5天所觀察的各部分處炎性區(qū)域結(jié)果的圖。如圖1所示，在皮內(nèi)注射懸液的各部分中觀察到炎癥，并且炎性區(qū)域在腹中線的皮內(nèi)部分最大。換言之，當(dāng)引起小鼠的皮內(nèi)炎癥時(shí)，皮內(nèi)注射至腹中線是最有效的。在所有觀察的部分中，耳部的炎癥是最輕的。圖2為顯示在將懸液皮內(nèi)注射至腹中線后，在各次中在腹中線處的性區(qū)域結(jié)果的圖。如圖2所示，在注射粉剌丙酸桿菌后5天，在腹中線處的炎性區(qū)域最大。

與此相反，在其中注射粉剌丙酸桿菌(其細(xì)菌細(xì)胞濃度分別為5x10⁷細(xì)胞/ml和1x10⁸細(xì)胞/ml)懸液的組中，在任何部分及任何次數(shù)均不能引起炎癥。

實(shí)施例3-肽的制備

將PepA(其為由SEQ NO.1所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽)的粉末或PepD(其為由SEQ NO.3所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽)的粉末溶解于生理鹽水(由Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.生產(chǎn))中，從而制備800μg/ml肽溶液。

作為比較例，使用PepB(其為相當(dāng)于粉刺丙酸桿菌膜蛋白中第10-26位氨基酸殘基的肽，其中所述的粉刺丙酸桿菌膜蛋白由Genbank/EMBL/DDBJ登記的編號(hào)為No.AAT81852的氨基酸序列構(gòu)成)和PepC(其為相當(dāng)于粉刺丙酸桿菌膜蛋白中第145-166位氨基酸殘基的肽，其中所述的粉刺丙酸桿菌膜蛋白由Genbank/EMBL/DDBJ登記的編號(hào)為No.YP_055518的氨基酸序列構(gòu)成)。表1示出各肽中氨基酸序列的信息。用作比較例的序列為可以是生產(chǎn)抗體過(guò)程中用作抗原的強(qiáng)候選物的氨基酸序列，即富含親水性氨基酸和電荷、并且選自具有轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氨基酸序列的氨基酸序列。此外，根據(jù)Bruggemann H.et al.,“The Complete Genome Sequence of Propionibacterium Acnes,a Commensal of Human Skin,”Science,2004,305,671-673中所述的基因組分析，由上述編號(hào)No登記的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)為預(yù)計(jì)被表達(dá)的蛋白質(zhì)。

表1

實(shí)施例4-肽PepA對(duì)抗由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的抗炎作用

在實(shí)施例2中，由將50μl粉刺丙酸桿菌(5x10⁸細(xì)胞/ml)皮內(nèi)注射至腹中線后經(jīng)過(guò)5天，由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥區(qū)域最大。因此，在相同的條件下測(cè)定各種肽的抗炎作用，即通過(guò)將50μl粉刺丙酸桿菌(5x10⁸細(xì)胞/ml)皮內(nèi)注射至腹中線，并測(cè)量注射后5天時(shí)的炎性區(qū)域(mm²)。圖3顯示用于檢測(cè)抗炎作用的操作。

圖3為示意性顯示用于檢測(cè)抗炎作用的操作的圖。如圖3所示，在注射粉刺丙酸桿菌的活細(xì)菌細(xì)胞之前18天(圖3中的第“0”天)，在所述的注射之前的11天(圖3中的第“7”天)，以及在所述的注射之前的4天(圖3中的第“14”天)，將PepA(40μg/50μl/個(gè)體)皮內(nèi)接種至Balb/c雄鼠的背部(在首次接種PetA時(shí)為7周齡)，即，總計(jì)3次。然后，將粉刺丙酸桿菌皮內(nèi)注射至小鼠的腹中線，并在注射后5天測(cè)量炎性區(qū)域(圖3中的第“23”天)。各組由10只小鼠構(gòu)成。作為比較例，準(zhǔn)備一組小鼠，對(duì)其給予不具有PepA的PBS，并且再準(zhǔn)備一組小鼠，對(duì)其給予PepB或PepC而非PepA，并且類似地，將粉刺丙酸桿菌注射至這些組的小鼠中。這些結(jié)果示于圖4中。

圖4為示出PepA的抗炎作用的結(jié)果的圖。如圖4所示，給予PepA的組與給予PBS的對(duì)照組相比，展示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地減小的炎性區(qū)域(P＝0.00865(P<0.01))。換言之，PepA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地展示對(duì)抗由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的抗炎作用。在給予PepB的組中，P＝1。在給予PepC的組中，P＝0.1655。這些數(shù)字不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此PepB和PepC被視為不具有對(duì)抗由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的抗炎作用。

上述結(jié)果顯示包含肽PepA的組合物作為對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗(即，粉刺疫苗)是有效的。

實(shí)施例5-肽PepA和PepD對(duì)抗由粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的抗炎作用

在與實(shí)施例4相同的條件下，使用致炎癥系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)各種肽的抗炎作用，不同之處在于在注射粉刺丙酸桿菌之前給予小鼠的肽由PepA,PepB和PepC改為PepA和PepD。結(jié)果示于圖5中。

圖5為示出PepA和PepD的抗炎作用的結(jié)果的圖。如圖5所示，給予PepA的組與給予PBS的對(duì)照組相比，展示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減小的炎性區(qū)域(P＝0.0012(P<0.01))，如實(shí)施例4所示的結(jié)果。此外，給予PepD的組與給予PBS的對(duì)照組相比，展示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減小的炎性區(qū)域(P＝0.00175(P<0.01))。

上述結(jié)果顯示包含肽PepA或PepD的組合物作為對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗(即，粉刺疫苗)是有效的。

實(shí)施例6-粉刺患者具有的菌株的鑒定

16S rDNA的提取

在37℃下，在GAM平板瓊脂培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)由粉刺患者的生病部位收集得到的膿，并收集部分細(xì)菌細(xì)胞。將所收集的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至GAM平板瓊脂培養(yǎng)基上，并厭氧培養(yǎng)，得以產(chǎn)生單個(gè)集落。收集單個(gè)集落的細(xì)菌細(xì)胞，并懸浮于20mM NaOH水溶液中。將懸液在94℃下加熱3min，溶解細(xì)菌細(xì)胞，提取16S rDNA。使用提取的16S rDNA，測(cè)定患者所感染的細(xì)菌細(xì)胞的16S rDNA的堿基序列。相對(duì)于分別由3名粉刺患者收集得到的3組細(xì)菌細(xì)胞的各組，測(cè)定堿基序列。

16S rDNA的堿基序列的測(cè)定

所提取的16S rDNA用作模板DNA。此外，關(guān)于引物，使用引物9F(正向引物)：5'-GTTTGATCCTGGCTCA-3'(SEQ NO.5)和引物800R(反向引物)：5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'(SEQ NO.6)。在此實(shí)施的PCR由30個(gè)循環(huán)構(gòu)成，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成：94℃，30秒；55℃，60秒，以及72℃，60秒。通過(guò)AmpliTaq Gold DNA Polymerase(由Applied Biosystems制造)進(jìn)行PCR。反應(yīng)后，純化PCR產(chǎn)物。隨后，使用純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行循環(huán)順序反應(yīng)。純化在循環(huán)順序反應(yīng)中得到的產(chǎn)物，提供給ABI PRISM 310Genetic Analyzer System(由Applied Biosystems制造)，并使用分析軟件BioEdit測(cè)定堿基序列。在循環(huán)序列反應(yīng)中使用的引物為上述引物9F和引物536R:5'-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3'(SEQ NO.7)。循環(huán)順序反應(yīng)由25個(gè)循環(huán)構(gòu)成，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成：96℃，10秒；50℃，5秒；以及60℃，4分鐘。

測(cè)定堿基序列的結(jié)果

測(cè)定堿基序列的結(jié)果顯示，在所建立的衍生自患者的3個(gè)分開(kāi)的細(xì)菌菌株(患者菌株1-3)的每一個(gè)中，在擴(kuò)增部分(SEQ NO.16)的16S rDNA堿基序列具有與粉刺丙酸桿菌ATCC6919菌株的相應(yīng)堿基序列(SEQ NO.8)相同的序列。圖6示出相對(duì)于患者菌株1的結(jié)果。因此，衍生自患者的3種分開(kāi)的細(xì)菌細(xì)胞鑒定為粉刺丙酸桿菌。

實(shí)施例7-肽PepA對(duì)抗由衍生自患者的粉刺丙酸桿菌引起的炎癥的抗炎作用

通過(guò)與實(shí)施例5相同的操作來(lái)檢測(cè)PepA的抗炎作用，不同之處在于注射至小鼠中的粉刺丙酸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞為在實(shí)施例6中分離得到的粉刺患者衍生的粉刺丙酸桿菌細(xì)菌細(xì)胞。結(jié)果示于圖7中。

圖7為示出在通過(guò)PepA免疫后向小鼠的腹中線皮內(nèi)注射患者菌株1-3(P1-粉刺丙酸桿菌至P3-粉刺丙酸桿菌)并在注射后5天測(cè)量小鼠的炎性區(qū)域的結(jié)果的圖。如圖7所示，與給予PBS而非PepA的對(duì)照組相比，給予PepA的組顯示相對(duì)于患者菌株1的P＝0.0252(P<0.05)，相對(duì)于患者菌株2的P＝0.0476(P<0.05)，以及相對(duì)于患者菌株3的P＝0.0237(P<0.05)。換言之，給予PepA相對(duì)于注射每個(gè)患者菌株而言，能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地減少炎性區(qū)域。這表明PepA作為粉刺疫苗是廣泛有效的。

實(shí)施例8-在衍生自粉刺患者的粉刺丙酸桿菌中編碼PepA或PepD的堿基序列的檢測(cè)

為了使PepA或PepD能夠有效地用作疫苗，理想的是靶粉刺丙酸桿菌具有包含PepA或PepD的蛋白質(zhì)。因此，通過(guò)實(shí)施PCR并測(cè)定和檢查PCR產(chǎn)物的堿基序列來(lái)檢測(cè)靶粉刺丙酸桿菌菌株是否具有包含PepA或PepD的蛋白質(zhì)。

通過(guò)PCR證明PepA

在此用于檢測(cè)編碼PepA氨基酸序列的堿基序列所使用的引物為引物L(fēng):5'-GATGAAAGCCATCCAGGAAA-3'(SEQ NO.9)和引物R:5'-GCACACGAAACAACGCTAGA-3'(SEQ NO.10)。在此實(shí)施的PCR由35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)由以下步驟構(gòu)成：95℃，15秒；60℃，20秒；72℃，30秒。使用AmpliTaq Gold DNA Polymerase(由Applied Biosystems制造)實(shí)施PCR。

結(jié)果通過(guò)由所檢測(cè)的患者衍生粉刺丙酸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增得到了具有所需長(zhǎng)度的PCR片段，隨后推斷存在編碼PepA氨基酸序列的堿基序列。這表明相當(dāng)于PepA的蛋白質(zhì)具有與PepA相同的氨基酸序列。

此外，針對(duì)由21名志愿者收集得到的樣本檢查它們是否具有編碼PepA氨基酸序列的堿基序列，發(fā)現(xiàn)21名病例中有19名病例為陽(yáng)性。在本實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性”是指使用特定的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增生成了具有所需長(zhǎng)度的片段。在本實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)“陰性”是指使用特定的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增不能生成具有所需長(zhǎng)度的片段。

類似地，針對(duì)由21名志愿者收集得到的樣本通過(guò)PCR檢查它們是否具有粉刺丙酸桿菌的16S rDNA。結(jié)果顯示，在編碼PepA氨基酸序列的堿基序列檢測(cè)中為陽(yáng)性的19名病例在16S rDNA的檢測(cè)中也是陽(yáng)性，并且在編碼PepA氨基酸序列的堿基序列檢測(cè)中為陰性的2名病例在16S rDNA的檢查中也是陰性。在證明編碼PepA氨基酸序列的堿基序列的PCR檢測(cè)中為陰性的2名病例的結(jié)果不能表明2名志愿者不攜帶編碼PepA氨基酸序列的堿基序列，但是表明粉刺丙酸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量如此低，以至于不能檢測(cè)到細(xì)菌細(xì)胞。由上述結(jié)果來(lái)看，推測(cè)包含PepA氨基酸序列的蛋白質(zhì)存在于其中證實(shí)有粉刺丙酸桿菌的16S rDNA的19名病例中。

表2

此外，與上文類似，針對(duì)由另外11名志愿者收集的樣本檢查它們是否具有粉刺丙酸桿菌的16S rDNA。結(jié)果顯示，各種樣本均為粉刺丙酸桿菌陽(yáng)性。此外，針對(duì)11名病例檢查它們是否具有編碼PepA氨基酸序列的堿基序列，發(fā)現(xiàn)所有11名病例均為陽(yáng)性。表3示出這11名病例的結(jié)果以及19名病例的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)他們均為陽(yáng)性。

表3

編碼PepA和PepD的堿基序列的證明

相對(duì)于由5名志愿者收集得到的各個(gè)樣本以及實(shí)施例1中所述的粉刺丙酸桿菌，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼PepA氨基酸序列的DNA和編碼PepD氨基酸序列的DNA。在擴(kuò)增編碼PepA的DNA過(guò)程中，引物L(fēng)(SEQ NO.9)和引物R(SEQ NO.10)被用作引物。在擴(kuò)增編碼PepD的DNA過(guò)程中，引物om1L:5'-GGTGCTGTCGTCAATAACAACTTC-3'(SEQ NO.14)和引物om1R:5'-GGAGTGGCCAGAGACGATCT-3'(SEQ NO.15)被用作引物。在此實(shí)施的PCR由以下步驟構(gòu)成：(i)95℃，5分鐘；此后(ii)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成：95℃，15秒；53℃，20秒；以及72℃，30秒；以及此后(iii)72℃，7分鐘；以及25℃，10分鐘。表4示出PCR的結(jié)果。

如表4所示，在所有的樣本中，對(duì)于PepA，通過(guò)擴(kuò)增生成了具有所需尺寸的PCR產(chǎn)物。其中通過(guò)擴(kuò)增生成了具有所需尺寸的PCR產(chǎn)物的病例顯示為“陽(yáng)性”。對(duì)于PepD，通過(guò)擴(kuò)增生成了具有所需尺寸的PCR產(chǎn)物，患者菌株D的樣本除外。

隨后，測(cè)定PCR產(chǎn)物的堿基序列，以測(cè)定推斷的氨基酸序列。通過(guò)使用3130x1Genetic Analyzer,Sequencing Analysis Software ver5.3.1.以及KB BaseCaller(各由Applied Biosystems生產(chǎn))來(lái)進(jìn)行堿基序列的測(cè)定。表4示出結(jié)果。如表4所示，在所有的樣本中，PepA的序列是保守的。換言之，由此獲得的推斷的氨基酸序列與SEQ NO.1所示的氨基酸序列相同。另一方面，在患者菌株C和E的樣本中，PepD的序列是保守的。換言之，由此獲得的推斷的氨基酸序列與SEQ NO.3所示的氨基酸序列相同。在患者菌株A和B的樣本中，推斷的氨基酸序列具有一個(gè)氨基酸突變。具體而言，定位于SEQ NO.3所示的氨基酸序列N-末端第11位的氨基酸殘基由Gln改變?yōu)長(zhǎng)ys。在衍生自Riken BioResource Center的菌株中也觀察到這種突變，其中所述的菌株用于在多個(gè)實(shí)施例中測(cè)定單一肽的抗炎作用?；颊呔闍為衍生自實(shí)施例6中粉刺患者的樣本。

表4

然而，如實(shí)施例5和圖5所示，單一給予PepD可以對(duì)由衍生自RIKEN BioResource Center的菌株所引起的炎癥產(chǎn)生抗炎性作用，其中所述的菌株在PepD的氨基酸序列中包含突變。這顯示PepD可以作為甚至對(duì)包含具有一個(gè)氨基酸突變的PepD的菌株引起的炎癥有效的疫苗。

類似的，在如表5所示的由30名志愿者收集得到的樣本的粉刺丙酸桿菌中，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼PepA氨基酸序列的DNA和編碼PepD氨基酸序列的DNA，并測(cè)定相應(yīng)PCR產(chǎn)物的堿基序列，由此測(cè)定相應(yīng)的推斷氨基酸序列。表5示出結(jié)果。

表5

如表5所示，在此檢測(cè)的所有樣本中，PepA的氨基酸序列完全保守。表4和5的結(jié)果顯示真實(shí)患者衍生的粉刺丙酸桿菌的PepA序列是非常保守的。

另一方面，在所檢測(cè)的30個(gè)病例的20個(gè)病例中，PepD的氨基酸序列是完全保守的(66.7％)。在所檢測(cè)的病例的6個(gè)病例中，氨基酸序列是部分突變的(¹¹Gln→Lys)。這是相當(dāng)于the RIKEN BioResource Center菌株的部分突變，通過(guò)使用小鼠的檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)上述菌株給予疫苗是有效的。因此，由疫苗作用的效力來(lái)看，認(rèn)為PepD序列在30個(gè)病例中的26個(gè)病例中是有效的(86.7％)。換言之，PepD序列是很保守的。

由上文所述來(lái)看，認(rèn)為PepA和PepD具有在患者細(xì)菌細(xì)胞中很保守的序列，因此作為患者的疫苗是高度有效的。

實(shí)施例9-對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗應(yīng)用疫苗的制備

如上文所述，發(fā)現(xiàn)在實(shí)施例5中使用小鼠的致粉刺炎癥測(cè)試系統(tǒng)中，兩種單鏈肽(PepA和PepD)都具有抗炎作用。為了使這些肽更高效地工作，通過(guò)MAP工藝合成PepA和PepD的MAP肽。如此得到的合成肽由結(jié)合于MAP結(jié)構(gòu)的7-13個(gè)分子的PepA或PepD單鏈肽構(gòu)成。制備MAP肽的混合物溶液(其中混合了PepA和PepD的MAP肽)并用作疫苗。

如下制備混合物溶液的制備物。最初，制備單個(gè)MAP肽，然后使用蒸餾水透析，并凍干且制成粉末。隨后，將各種粉末溶解于生理鹽水(由Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.生產(chǎn))中，使得相應(yīng)MAP肽的濃度為1mg/ml(各種所得的溶液在下文中均稱為“PA-MAP溶液”)。PA-MAP溶液經(jīng)過(guò)內(nèi)毒素檢測(cè)和細(xì)胞毒性檢測(cè)。內(nèi)毒素的量滿足根據(jù)NIH的允許量(5EU或更低/kg體重/1彈丸注射)。此外，在細(xì)胞毒性檢測(cè)中，將10μl測(cè)試肽溶液和90μl外周血單個(gè)核細(xì)胞(2x10⁶細(xì)胞/ml，在純RPMI1640中)在37℃下共培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞生存比例與對(duì)照是基本相等的(差異為+/-5％或更低)，在所述的對(duì)照中，培養(yǎng)其中加入生理鹽水的外周血單個(gè)核細(xì)胞，隨后未發(fā)現(xiàn)毒性。

病例1

以5天的時(shí)間間隔，將100μl制備的PA-MAP溶液5次皮下接種于粉刺患者的上臂中。該粉刺患者為攜帶實(shí)施例8中所示的患者菌株A的患者。圖8示出觀察結(jié)果。

如圖8所示，在處理前(在初次給予時(shí))，皮膚的整個(gè)區(qū)域由于粉刺細(xì)菌的皮下增殖而凸出和升高(如圖中箭頭所示)，并伴有炎癥。在初次接種后1個(gè)月，盡管仍觀察到粉刺的凸出和升高，但是它們分成2個(gè)區(qū)域，并且炎癥得到改善和局部化。在最后接種后的3個(gè)月，炎癥逐漸減少，粉刺變成結(jié)疤，并且凸出和升高變平。由于處于處理過(guò)程，所以觀察到色素沉積。未觀察到接種引起的惡化現(xiàn)象。

病例2

由攜帶實(shí)施例8所示的患者菌株C的粉刺患者收集樣本，并且通過(guò)PCR擴(kuò)增粉刺丙酸桿菌的16S rDNA來(lái)證明粉刺患者是否感染粉刺丙酸桿菌。結(jié)果顯示粉刺患者為粉刺丙酸桿菌陽(yáng)性。使用(i)引物L(fēng)1(由與引物9F相同的序列構(gòu)成)和(ii)引物R2：5'-GCACGTAGTTAGCCGGTGCT-3'(SEQ NO.13)通過(guò)PCR進(jìn)行粉刺丙酸桿菌的16S rDNA的擴(kuò)增，其中所述的PCR由以下步驟構(gòu)成：(i)95℃，5分鐘；此后(ii)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下步驟組成：95℃，15秒；55℃，20秒；以及72℃，30秒；以及(iii)72℃，7分鐘。

以3天的時(shí)間間隔，將300μl制備的PA-MAP溶液5次皮下接種于粉刺患者的上臂中。圖9示出觀察結(jié)果。

如圖9所示，在初次接種后1個(gè)月和3個(gè)月，在處理前(在初次給予時(shí))觀察到的臉頰上的炎癥整個(gè)區(qū)域發(fā)生改善。未觀察到接種引起的惡化現(xiàn)象。

病例3

由攜帶實(shí)施例8所示的患者菌株D的粉刺患者收集樣本，通過(guò)PCR在與病例2中相同的條件下擴(kuò)增粉刺丙酸桿菌的16S rDNA來(lái)證明粉刺患者是否感染粉刺丙酸桿菌。結(jié)果顯示粉刺患者為粉刺丙酸桿菌陽(yáng)性。

以3天的時(shí)間間隔，將300μl制備的PA-MAP溶液5次皮下接種于粉刺患者的上臂中。圖10示出觀察結(jié)果。

如圖10所示，處理前(在初次給予時(shí))所觀察的鼻子周圍的整個(gè)炎癥區(qū)域在初次接種后1個(gè)月和3個(gè)月有所改善。未觀察到接種引起的惡化現(xiàn)象。

病例4

由攜帶實(shí)施例8所示的患者菌株E的粉刺患者收集樣本，通過(guò)PCR在與病例2中相同的條件下擴(kuò)增粉刺丙酸桿菌的16S rDNA來(lái)證明粉刺患者是否感染粉刺丙酸桿菌。結(jié)果顯示粉刺患者為粉刺丙酸桿菌陽(yáng)性。

以5天的時(shí)間間隔，將300μl制備的PA-MAP溶液5次皮下接種于粉刺患者的上臂中。圖11示出觀察結(jié)果。

如圖11所示，處理前(在初次給予時(shí))所觀察的臉頰的廣泛區(qū)域上的整個(gè)炎癥區(qū)域在初次接種后1個(gè)月和3個(gè)月有所改善。未觀察到接種引起的惡化現(xiàn)象。

上述結(jié)果顯示包含肽PepA和肽PepD的組合物作為對(duì)抗粉刺丙酸桿菌的疫苗是有效的，即粉刺疫苗。

本發(fā)明的應(yīng)用使得有可能進(jìn)行預(yù)防和治療粉刺的免疫治療。因此，本發(fā)明適用于醫(yī)療領(lǐng)域、藥物領(lǐng)域等，并且是極有用的。

實(shí)施例10-包含抗-TNF的粉刺疫苗的制備

根據(jù)本發(fā)明的疫苗是通過(guò)將500μg肽抗原ABF155和500μg肽抗原ABF156與50mg抗-TNF組合而制備的?？?TNF可以商品名Enbrel商業(yè)上獲得。對(duì)照疫苗是通過(guò)將500μg肽抗原ABF155和500μg肽抗原ABF156結(jié)合(不具有抗-TNF)組合而制備的。在總計(jì)12周內(nèi)，每周1次將各種疫苗皮下注射給予患者。在總計(jì)4個(gè)月內(nèi)，每月1次進(jìn)行以下血液檢驗(yàn)：WBC,RBC,Hb,血像,生化檢驗(yàn),IgM,IgG,IgG亞型。得到Propioni Bacterium Antibody Titer(ELISA測(cè)試)和Cytokine Assays。所述的測(cè)試包括使用接收疫苗之前和之后由患者得到的外周血液樣品測(cè)量針對(duì)粉刺丙酸桿菌和疫苗肽的抗體效價(jià)和T細(xì)胞應(yīng)答。

實(shí)施例11-包含抗-TNF的粉刺疫苗的制備和給予

根據(jù)本發(fā)明制備總計(jì)8種疫苗，并將各種疫苗給予患有粉刺丙酸桿菌的不同患者。所述的給予由以下構(gòu)成：由第0周開(kāi)始，每周1次將疫苗注射至各個(gè)患者的臀部。因此，在初始注射后的每周都向患者的臀部給予另一次注射。在第0周，取得8位患者中每一位的感染區(qū)域的照片，此后，每4周取得隨后的照片。該照片用于鑒定粉刺斑點(diǎn)的初始數(shù)量，以及在一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)于疫苗的粉刺斑點(diǎn)進(jìn)展和/或消退。此外，在第0周對(duì)8位患者中每一位實(shí)施血液檢驗(yàn)，此后，每4周進(jìn)行隨后的血液檢驗(yàn)。

6種疫苗包含肽和抗-TNF的組合，2種疫苗僅包含肽，即缺乏抗-TNF。在第0周，通過(guò)將500μg肽抗原ABF155和500μg肽抗原ABF156與50mg抗-TNF(市售可得，商品名為Enbrel)組合來(lái)制備初始疫苗，即6種肽/抗-TNF疫苗。在第0周，通過(guò)將500μg肽抗原ABF155和500μg肽抗原ABF156組合(不具有抗-TNF)來(lái)制備初始疫苗，即2種對(duì)照疫苗。對(duì)于在第0周后給予的各種疫苗而言，肽和抗-TNF的量保持相同。但是，應(yīng)該考慮的是，在第0周后給予的各種疫苗中，抗-TNF的量可以根據(jù)患者的整體狀況來(lái)調(diào)節(jié)。例如原始疫苗由50mg抗-TNF構(gòu)成，并且應(yīng)該考慮的是隨后的注射可以包含相同量、更多的或更少的量。在某些實(shí)施方案中，其中觀察到有所改善(例如粉刺斑點(diǎn)的消退)時(shí)，可以使用較少量的抗-TNF，觀察到患者的狀況惡化(例如粉刺斑點(diǎn)的數(shù)量增加)時(shí)，可以使用較多量的抗-TNF。

患者#1至#8中每一位的數(shù)據(jù)分別示于表A至H中。如表A和B所示(對(duì)于患者#1和#2)，將包含肽和抗-TNF的疫苗給予粉刺患者產(chǎn)生了完全的應(yīng)答。粉刺斑點(diǎn)的數(shù)量顯著減少(由第0周的8個(gè)斑點(diǎn)減少至第12周的0個(gè)斑點(diǎn))。如表C所示(對(duì)于患者#3)，向粉刺患者給予僅包含肽的疫苗在第0至第4周得到穩(wěn)定的疾病應(yīng)答。粉刺斑點(diǎn)的數(shù)量基本保持相同(由第1周的4個(gè)斑點(diǎn)至第4周的4個(gè)斑點(diǎn))。然而，對(duì)于接下來(lái)12周的注射(即，第4周至第16周)使用具有抗-TNF的疫苗。結(jié)果粉刺斑點(diǎn)的數(shù)量在整個(gè)這12周的時(shí)間內(nèi)減少(由第4周的4個(gè)斑點(diǎn)減少至第16周的0個(gè)斑點(diǎn))。如表D所示(對(duì)于患者#4)，向粉刺患者給予包含肽和抗-TNF的疫苗產(chǎn)生了部分應(yīng)答。粉刺斑點(diǎn)的數(shù)量顯著減少(由第0周的7個(gè)斑點(diǎn)減少至第10周的3個(gè)斑點(diǎn))。如表E所示(對(duì)于患者#5)，向粉刺患者給予僅包含肽的疫苗產(chǎn)生了部分應(yīng)答。粉刺斑點(diǎn)的數(shù)量減少(由第0周的5個(gè)斑點(diǎn)減少至第11周的1個(gè)斑點(diǎn))。如表F和G所示(對(duì)于患者#6和#7)，向粉刺患者給予包含肽和抗-TNF的疫苗產(chǎn)生了部分應(yīng)答?；颊?6和#7的粉剌斑點(diǎn)的數(shù)量減少(對(duì)于患者#6由第0周的14個(gè)斑點(diǎn)減少至第12周的2個(gè)斑點(diǎn)，對(duì)于患者#7由第0周的2個(gè)斑點(diǎn)減少至第12周的1個(gè)斑點(diǎn))。表H顯示了粉刺斑點(diǎn)數(shù)(對(duì)于患者#8)，向粉刺患者給予包含肽和抗-TNF的疫苗產(chǎn)生穩(wěn)定的疾病應(yīng)答(第0周斑點(diǎn)的數(shù)量和第12周斑點(diǎn)的數(shù)量是相同的，即5個(gè)斑點(diǎn))。

根據(jù)上述結(jié)果，可以認(rèn)為疫苗中存在的肽作為抗原是有效的，并且抗-TNF有效地抑制由免疫應(yīng)答(通過(guò)給予疫苗而引發(fā))過(guò)度誘導(dǎo)的炎癥。此外，還表明肽和抗-TNF的組合有效地增強(qiáng)疫苗效力。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離本發(fā)明的廣泛構(gòu)思的情況下，可以對(duì)上述實(shí)施方案進(jìn)行修改。因此，應(yīng)該理解的是本發(fā)明不限于所公開(kāi)的具體的實(shí)施方案，而是涵蓋在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的修改，如所附的權(quán)利要去書所限定的。

序列表

<110> HASUMI, KENICHIRO

KURAYA, MIKIO

<120> 抗原肽及其應(yīng)用

<130> 86510(70904)

<140>

<141>

<150> PCT/JP2011/062305

<151> 2011-05-23

<150> 61/396,574

<151> 2010-05-27

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 粉刺丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)

<400> 1

Ala Ile Gln Glu Lys Tyr Gly Asp Asp Arg Glu Arg Ala Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 2

gccatccagg aaaagtacgg cgacgacagg gaacgtgccg gc 42

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 3

Lys Asp Ala Asp Lys Asp Asn Pro Thr Tyr Gln Lys Val

1 5 10

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 4

aaggacgctg acaaagacaa cccgacgtac cagaaggtc 39

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 5

gtttgatcct ggctca 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 6

taccagggta tctaatcc 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 7

gtattaccgc ggctgctgg 19

<210> 8

<211> 511

<212> DNA

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 8

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60

ggaaaggccc tgcttttgtg gggtgctcga gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgagtaa 120

cctgcccttg actttgggat aacttcagga aactggggct aataccggat aggagctcct 180

gctgcatggt gggggttgga aagtttcggc ggttggggat ggactcgcgg cttatcagct 240

tgttggtggg gtagtggctt accaaggctt tgacgggtag ccggcctgag agggtgaccg 300

gccacattgg gactgagata cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360

cacaatgggc ggaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgcgg gatgacggcc ttcgggttgt 420

aaaccgcttt cgcctgtgac gaagcgtgag tgacggtaat gggtaaagaa gcaccggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtgatacgta g 511

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 9

gatgaaagcc atccaggaaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 10

gcacacgaaa caacgctaga 20

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 11

Gly Arg Lys Pro Asp Thr Asn Lys Arg Ser Trp His Arg Lys Ala Ser

1 5 10 15

Arg

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 12

Ile Asp Gln Val Arg Glu Tyr Arg His Arg Asp Asp Asp Asp Asp Glu

1 5 10 15

Asp Pro Gly Glu Asp Gly

20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 13

gcacgtagttagccggtgct 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 14

ggtgctgtcg tcaataacaa cttc 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 15

ggagtggcca gagacgatct 20

<210> 16

<211> 504

<212> DNA

<213> 粉刺丙酸桿菌

<400> 16

gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacgga 60

aaggccctgc ttttgtgggg tgctcgagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct 120

gcccttgact ttgggataac ttcaggaaac tggggctaat accggatagg agctcctgct 180

gcatggtggg ggttggaaag tttcggcggt tggggatgga ctcgcggctt atcagcttgt 240

tggtggggta gtggcttacc aaggctttga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc 300

acattgggac tgagatacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac 360

aatgggcgga agcctgatgc agcaacgccg cgtgcgggat gacggccttc gggttgtaaa 420

ccgctttcgc ctgtgacgaa gcgtgagtga cggtaatggg taaagaagca ccggctaact 480

acgtgccagc agccgcggtg atac 504