注射用藥物組合物的制作方法
本發(fā)明屬于癌癥免疫療法的領(lǐng)域，并且涉及包含具有細胞毒性T細胞誘導活性的WT1蛋白衍生的癌抗原肽的可注射藥物組合物。
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背景技術(shù)：
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通常，WT1蛋白衍生的癌抗原肽是衍生自由449個氨基酸(SEQ ID NO:2)組成的人WT1蛋白的部分肽，并且具體是由8-12個氨基酸組成的肽或其二聚體。其被呈遞至主要組織相容性復合體(MHC) I類抗原，并且包括被細胞毒性T細胞(細胞毒性T淋巴細胞，下文被稱為CTL)抗原識別的肽。人類中的MHC被稱為人白細胞抗原(HLA)。
在WT1蛋白衍生的部分肽中，由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO:3)所示的氨基酸序列組成的部分肽(WT1126-134肽)和通過將從由Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO:6)所示的氨基酸序列組成的部分肽(WT1235-243肽)的N末端起第二個氨基酸從甲硫氨酸修飾為酪氨酸而獲得的修飾的肽(即，由Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO:5)所示的氨基酸序列組成的肽)已被報道為可用作結(jié)合HLA以誘導CTL的肽(參見專利文獻1-4)。然而，通過經(jīng)由半胱氨酸殘基之間的二硫鍵綴合這兩種肽而獲得的修飾肽是未知的，并且其最佳癌癥疫苗組合物也是未知的。
另一方面，在WT1蛋白衍生的部分肽中，由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的部分肽(WT134-51肽)本身可用作結(jié)合HLA以誘導CTL的肽，并且還報道了與上述肽組合使用提供作為輔助肽的效果(參見專利文獻5)。然而，含有該肽的最佳癌癥疫苗組合物是未知的。
由于含有WT1126-134肽和/或修飾的WT1235-243肽和WT134-51肽的最佳癌癥疫苗組合物可用作癌癥疫苗，所以期望開發(fā)確保這些肽的穩(wěn)定性的制劑。
[文獻列表]
[專利文獻]
專利文獻1： WO 00/06602
專利文獻2： WO 02/079253
專利文獻3： WO 2004/063217
專利文獻4： WO 2007/063903
專利文獻5： WO 2010/123065。
[發(fā)明概述]
[本發(fā)明待解決的問題]
本發(fā)明的一個問題是提供由式(1)表示的肽或由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的WT1部分肽的穩(wěn)定的可注射藥物組合物，其可用于配制包含以下肽的癌癥疫苗制劑：
其中Cys和Cys之間的鍵顯示二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵。
[解決問題的方式]
本發(fā)明人已進行深入研究以試圖解決上述問題，并且發(fā)現(xiàn)含有由式(1)表示的肽或具有SEQ ID NO:1中所示的序列的WT1部分肽以及海藻糖和pH調(diào)節(jié)劑的液體制劑提供制劑穩(wěn)定性優(yōu)異的液體制劑和/或冷凍干燥的制劑，其導致本發(fā)明的完成。
也就是說，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
1. 可注射藥物組合物，其包含以下組分：
(a)一種或多種肽，其選自：
由式(1)表示的肽：
其中Cys和Cys之間的鍵是二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵，
由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽及其鹽，
(b)海藻糖或海藻糖水合物，和
(c)pH調(diào)節(jié)劑。
2. 1的組合物，其中所述組分(a)是一種或多種肽，其選自由式(1)表示的肽及其鹽。
3. 2的組合物，其還包含甘露醇。
4. 3的組合物，其中所述甘露醇是D-甘露醇。
5. 2-4中任一項的組合物，其還包含甲硫氨酸。
6. 5的組合物，其中所述甲硫氨酸是L-甲硫氨酸。
7. 2-6中任一項的組合物，其具有1-3的pH。
8. 2-7中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中組分(b)的含量為1-100 mg/g。
9. 3-8中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中甘露醇的含量為1-50 mg/g。
10. 5-9中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中甲硫氨酸的含量為1-30 mg/g。
11. 1的組合物，其中組分(a)是一種或多種肽，其選自由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)表示的氨基酸序列組成的肽及其鹽。
12. 11的組合物，其還包含增溶劑。
13. 12的組合物，其中所述增溶劑是檸檬酸、乳酸、酒石酸、乙酸或三氟乙酸。
14. 12的組合物，其中所述增溶劑是酒石酸。
15. 12-14中任一項的組合物，其具有2-3的pH。
16. 11的組合物，其具有5-10的pH。
17. 11-16中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中組分(b)的含量為1-100 mg/g。
18. 12-15中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中增溶劑的含量為0.1-10 mg/g。
19. 11-18中任一項的組合物，其中用作pH調(diào)節(jié)劑的酸是弱酸。
20. 1的組合物，其中組分(a)包含一種或多種選自由式(1)表示的肽及其鹽的肽，和一種或多種選自由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽及其鹽的肽。
21. 20的組合物，其還包含甘露醇。
22. 20或21的組合物，其還包含甲硫氨酸。
23. 20-22中任一項的組合物，其還包含增溶劑。
24. 20-23中任一項的組合物，其具有2-3的pH。
25. 20-24中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中組分(b)的含量為1-100 mg/g。
26. 21-25中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中甘露醇的含量為1-50 mg/g。
27. 22-26中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中甲硫氨酸的含量為1-30 mg/g。
28. 23-27中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑，其中增溶劑的含量為0.1-10 mg/g。
29. 冷凍干燥的制劑，其通過將8-10、17、18和25-28中任一項的組合物冷凍干燥而獲得。
30. 1-18中任一項的組合物，其為液體制劑、懸浮液制劑或冷凍干燥的制劑。
31. 1-7、11-16、19-24和30中任一項的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑。
32. 20-24中任一項的組合物，其通過向冷凍干燥的制劑的形式的2-7中任一項的組合物中添加液體制劑的形式的11-15中任一項的組合物而產(chǎn)生。
33. 32的組合物，其為液體制劑或懸浮液制劑。
34. 癌癥疫苗組合物，其包含1-28和30-33中任一項的組合物。
35. 34的組合物，其還包含佐劑。
36. 35的組合物，其中所述佐劑是Montanide。
37. 改善可注射藥物組合物中的組分(a)的穩(wěn)定性的方法：
(a)一種或多種肽，其選自：
由式(1)表示的肽：
其中Cys和Cys之間的鍵是二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵，
由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽及其鹽，
所述方法包括在組合物中共混上述組分(a)以及以下組分(b)和(c)：
(b)海藻糖或海藻糖水合物，
(c)pH調(diào)節(jié)劑。
38. 改善癌癥疫苗組合物中的肽(a)的穩(wěn)定性的方法：
(a)一種或多種肽，其選自：
由式(1)表示的肽：
其中Cys和Cys之間的鍵是二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵，
由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽及其鹽，
所述方法包括在組合物中共混上述組分(a)以及以下組分(b)、(c)和(d)：
(b)海藻糖或海藻糖水合物，
(c)pH調(diào)節(jié)劑，
(d)甲硫氨酸。
39. 產(chǎn)生20-24中任一項的組合物的方法，其中向冷凍干燥的制劑的形式的2-7中任一項的組合物中添加液體制劑的形式的11-15中任一項的組合物。
40. 生產(chǎn)癌癥疫苗組合物的方法，其包括向佐劑中添加通過39的方法獲得的組合物。
41. 18的組合物，其中組分(b)的含量為1-100 mg/g。
42. 1-18中任一項的組合物，其中所述pH調(diào)節(jié)劑是鹽酸和/或氫氧化鈉。
[發(fā)明效果]
使用本發(fā)明的可注射的藥物組合物，可以產(chǎn)生穩(wěn)定含有具有細胞毒性T細胞誘導活性的本發(fā)明的肽的癌癥疫苗組合物，并且可以制備制劑穩(wěn)定性優(yōu)異的癌癥疫苗。此外，當將可注射的藥物組合物冷凍干燥以得到冷凍干燥的制劑時，可以制備穩(wěn)定保持肽的冷凍干燥的制劑。
[附圖簡述]
圖1是顯示實驗實施例4的結(jié)果的圖?？v軸顯示接種細胞數(shù)中反應(yīng)的細胞數(shù)，而橫軸顯示在體外脈沖(パルス)的肽。在圖1中，黑色條顯示通過脈沖SEQ ID NO:3中所示的肽的HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠來源的脾細胞的培養(yǎng)結(jié)果，而白色條顯示沒有脈沖的培養(yǎng)結(jié)果。
圖2是顯示實驗實施例4的結(jié)果的圖?？v軸顯示接種細胞數(shù)中反應(yīng)的細胞數(shù)，而橫軸顯示在體外脈沖的肽。在圖2中，黑色條顯示通過脈沖SEQ ID NO:5中所示的肽的HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠來源的脾細胞的培養(yǎng)結(jié)果，而白色條顯示沒有脈沖的培養(yǎng)結(jié)果。
[實施方案的描述]
下面詳細解釋本發(fā)明的實施方案。
在本說明書中，各示例的優(yōu)選實施方案可以與其它示例的優(yōu)選實施方案組合，或者可以并入上述1-42中描述的相應(yīng)示例。
在本發(fā)明中，“可注射的藥物組合物”是指含有本發(fā)明的肽和一種或多種除所述肽以外的組分的組合物。癌癥疫苗組合物可以通過混合可注射的藥物組合物和各種佐劑來制備。
本發(fā)明的可注射的藥物組合物可以以溶液、懸浮液、冷凍干燥的制劑等的形式提供。
在本發(fā)明中，“液體制劑”是指“可注射的藥物組合物”中含有的各組分，其溶解在溶劑中。盡管在本發(fā)明中通常使用水作為“溶劑”，但可以將藥理學上可接受的溶劑諸如丙二醇、聚乙二醇等與水部分混合，只要不影響本發(fā)明的效果。優(yōu)選水。另外，添加至水中且溶解于其中的下述“冷凍干燥的制劑”也包括在本發(fā)明的“液體制劑”中。
在本發(fā)明中，“懸浮液制劑”通過將“可注射的藥物組合物”中含有的各組分與分散介質(zhì)混合并懸浮于其中而獲得。盡管在本發(fā)明中通常使用水作為“分散介質(zhì)”，但可以將藥理學上可接受的溶劑諸如丙二醇、聚乙二醇等與水部分混合，只要不影響本發(fā)明的效果。優(yōu)選水。另外，添加至水中且懸浮于其中的下述“冷凍干燥的制劑”也包括在“本發(fā)明的懸浮液制劑”中。
在本發(fā)明中，“冷凍干燥的制劑”通過將本發(fā)明中的“液體制劑”或“懸浮液制劑”冷凍干燥而獲得。通常，將其進行以改善在“液體制劑”或“懸浮液制劑”中的肽的化學或物理穩(wěn)定性。當其用作癌癥疫苗時，添加適量的水，并將混合物攪拌以得到液體制劑或懸浮液制劑，其與各種佐劑混合以制備癌癥疫苗組合物。
在本發(fā)明中，所述“肽”是用于制備癌癥疫苗的癌抗原肽，并且是選自由式(1)表示的肽和由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽的肽或其鹽。
其中Cys和Cys之間的鍵是二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵。
在本說明書中，所述肽在左側(cè)具有N末端，且各氨基酸符號表示以下氨基酸殘基。
Ala或A：丙氨酸殘基
Arg或R：精氨酸殘基
Asn或N：天冬酰胺殘基
Asp或D：天冬氨酸殘基
Cys或C：半胱氨酸殘基
Gln或Q：谷氨酰胺殘基
Glu或E：谷氨酸殘基
Gly或G：甘氨酸殘基
His或H：組氨酸殘基
Ile或I：異亮氨酸殘基
Leu或L：亮氨酸殘基
Lys或K：賴氨酸殘基
Met或M：甲硫氨酸殘基
Phe或F：苯丙氨酸殘基
Pro或P：脯氨酸殘基
Ser或S：絲氨酸殘基
Thr或T：蘇氨酸殘基
Trp或W：色氨酸殘基
Tyr或Y：酪氨酸殘基
Val或V：纈氨酸殘基。
“由式(1)表示的肽”是指由Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO:4)所示的氨基酸序列組成的肽，其中半胱氨酸殘基與Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO:3)的N末端鍵合，并且由Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO:5)所示的肽的半胱氨酸殘基通過二硫鍵彼此鍵合。
由Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO:3)所示的氨基酸序列組成的肽是從由蛋白(具體地，由449個氨基酸(SEQ ID NO:2)組成的人WT1蛋白)(其為維爾姆斯氏腫瘤的腫瘤抑制基因WT1的基因產(chǎn)物)的N末端起的第126位精氨酸(Arg)至第134位亮氨酸(Leu)的9個連續(xù)氨基酸組成的部分肽(WT1126-134)。該肽是呈遞給MHC I類抗原并被CTL識別為抗原的肽。
由Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO:5)所示的氨基酸序列組成的肽是修飾肽，其為由從WT1蛋白的N末端起的第235位半胱氨酸(Cys)至第243位亮氨酸(Leu)的9個連續(xù)氨基酸組成的部分肽(WT1235-243肽)，其中從N末端起的第二個氨基酸從甲硫氨酸(Met)修飾為酪氨酸(Tyr)。該肽是呈遞給MHC I類抗原并被CTL識別為抗原的肽。
“由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽”是從WT1蛋白的N末端起的第34位色氨酸(Trp)至第51位亮氨酸(Leu)的18個氨基酸組成的部分肽(WT134-51肽)。該肽是呈遞給MHC II類抗原的肽，并誘導WT1特異性輔助T細胞。
由式(1)表示的肽或由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的肽的鹽沒有特別限制，只要其為藥學上可接受的鹽。本發(fā)明中的“鹽”的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽的實例包括無機酸鹽諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等，以及有機酸鹽諸如檸檬酸鹽、草酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等。堿加成鹽的實例包括與無機堿的鹽諸如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽等，與有機堿的鹽諸如三乙基銨鹽、三乙醇銨鹽、吡啶鎓鹽、二異丙基銨鹽等，等，以及堿性或酸性氨基酸諸如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的氨基酸鹽。
本發(fā)明的肽還涵蓋由式(1)表示的肽或其鹽、由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的肽或其鹽的水合物、溶劑化物諸如乙醇溶劑化物等。此外，本發(fā)明的肽涵蓋可以存在的由式(1)表示的肽的任何立體異構(gòu)體或其鹽諸如任何非對映異構(gòu)體、對映異構(gòu)體等以及任何實施方案中的任何晶體。
由式(1)表示的肽或其鹽可以通過本說明書中的實施例中描述的方法或已知方法(參見專利文獻2-4等)來產(chǎn)生。另一方面，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的肽或其鹽可以通過已知方法產(chǎn)生(參見專利文獻5)。此外，本發(fā)明的肽可以通過相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的方法來產(chǎn)生。產(chǎn)生方法的實例包括文獻(Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development of Pharmaceutical Product subsequent vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991)等中描述的方法。
當通過上述方法獲得的本發(fā)明的肽是游離形式時，游離形式可以通過已知方法或與其類似的方法轉(zhuǎn)化為合適的鹽。相反，當本發(fā)明的肽作為鹽獲得時，所述鹽可以通過已知方法或與其類似的方法轉(zhuǎn)化為游離形式或其它鹽。
本發(fā)明的可注射藥物組合物可以各自單一含有由式(1)表示的肽或其一種鹽，或者可以含有所述肽及其一種或多種鹽，或所述肽的兩種或更多種鹽(下文有時總稱為“肽(1)”)。類似地，本發(fā)明的可注射藥物組合物可以各自單一含有由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的肽或其一種鹽，或者可以含有所述肽及其一種或多種鹽，或所述肽的兩種或更多種鹽(下文有時總稱為“肽(2)”)。此外，本發(fā)明的可注射藥物組合物任選地含有肽(1)和肽(2)兩者。
當本發(fā)明的可注射藥物組合物是液體制劑或懸浮液制劑(下文有時稱為“本發(fā)明的液體形式的制劑”)時，本發(fā)明的肽相對于本發(fā)明的液體形式的制劑的重量的含量沒有特別限定，并且其僅需要是藥理學可接受的或性質(zhì)可接受的。在本發(fā)明的肽中，例如，肽(1)的含量(當含有兩種或更多種肽時，其總量)優(yōu)選為0.5 mg-200 mg/g，進一步優(yōu)選0.5 mg-100 mg/g，0.5 mg-50 mg/g或1 mg-25 mg/g，其可以根據(jù)目標進行選擇。另一方面，肽(2)的含量(當含有兩種或更多種肽時，其總量)優(yōu)選為0.05 mg-200 mg/g，進一步優(yōu)選0.05 mg-100 mg/g，0.05 mg-50 mg/g或0.1 mg-25 mg/g，其可以根據(jù)目標進行選擇。當本發(fā)明的液體制劑含有肽(1)和肽(2)兩者時，肽(1)和肽(2)的重量比可以從1:0.1-1:5的范圍適當選擇。
當本發(fā)明的可注射藥物組合物是冷凍干燥的制劑(下文有時稱為“本發(fā)明的冷凍干燥的制劑”)時，每體積本發(fā)明的肽的含量沒有特別限定。本發(fā)明的冷凍干燥的制劑通過將本發(fā)明的液體形式的制劑冷凍干燥而獲得，并且肽的含量僅需要滿足液體形式的制劑的含量。具有比冷凍干燥前更高的濃度的本發(fā)明的液體形式的制劑，可以通過在本發(fā)明的冷凍干燥的制劑的復水期間溶解或分散于比冷凍干燥前的本發(fā)明制劑的液體形式的制備物的液體量更少的量的水中來獲得。
除了本發(fā)明的上述肽(組分(a))外，本發(fā)明的可注射藥物組合物特征性地含有以下組分(b)和(c)：
(b)海藻糖或海藻糖水合物
(c)pH調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明中，“海藻糖”是通過葡萄糖的1,1-糖苷鍵形成的一種二糖。海藻糖可以是無水物或其水合物。優(yōu)選海藻糖水合物。本發(fā)明的可注射藥物組合物可以含有無水物或其水合物的單一形式的海藻糖，或者可以組合含有其兩種或更多種。在本發(fā)明的可注射藥物組合物中，海藻糖相對于組合物的重量的含量沒有特別限定。其相對于本發(fā)明的液體形式的制劑的重量的含量(當以包括兩種或更多種的形式包含時，其全部量)為例如1-50 mg/g，1-70 mg/g，1-100 mg/g，1-150 mg/g，1-200 mg/g，3-50 mg/g，3-70 mg/g，3-100 mg/g，3-150 mg/g，3-200 mg/g，5-50 mg/g，5-70 mg/g，5-100 mg/g，5-150 mg/g，5-200 mg/g等。
在本發(fā)明中，“pH調(diào)節(jié)劑”是通常用于藥物制劑的pH調(diào)節(jié)劑。其具體實例包括無機酸諸如鹽酸、硫酸、磷酸、磷酸二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸三鈉等或其鹽，有機酸諸如硝酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、馬來酸、乙酸鈉水合物、無水乙酸鈉、檸檬酸鈉水合物、檸檬酸二氫鈉、酒石酸鈉等或其鹽，無機堿諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水等，以及有機堿諸如氨丁三醇、組氨酸、L-精氨酸、葡甲胺等。優(yōu)選檸檬酸、乳酸、酒石酸、鹽酸、硫酸、硝酸、氫氧化鈉和氫氧化鉀、氨丁三醇、組氨酸、L-精氨酸和葡甲胺，并且進一步優(yōu)選酒石酸、鹽酸和氫氧化鈉、氨丁三醇、L-精氨酸和葡甲胺。
從另一個方面來看，當組分(a)是肽(2)時，作為pH調(diào)節(jié)劑的酸優(yōu)選為弱酸。
添加pH調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)本發(fā)明的液體形式的制劑的pH以落入能夠確保本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的pH范圍內(nèi)。由于能夠確保本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的pH范圍根據(jù)如下所述的本發(fā)明的液體形式的制劑中含有的肽的種類而變化，所以使用適合于其的pH調(diào)節(jié)劑。
當本發(fā)明的可注射藥物組合物僅含有肽(1)時，本發(fā)明的液體形式的制劑具有1-10的pH。從溶解度和穩(wěn)定性的方面來看，當液體形式的制劑是液體制劑時，pH為優(yōu)選1-4，進一步優(yōu)選1-3，最優(yōu)選2-3。鑒于溶解度，當液體形式的制劑是懸浮液制劑時，優(yōu)選pH 5-10。在除了上述那些實施方案以外的實施方案中，當液體形式的制劑是液體制劑時，優(yōu)選的pH包括1.5-4.5、1.5-3.5、1.5-3.0、2.0-3.0。對于懸浮液制劑，優(yōu)選的pH包括4-9、4-6、5-9。
另一方面，當本發(fā)明的可注射藥物組合物僅含有肽(2)時，本發(fā)明的液體形式的制劑具有pH 2-10，更具體地2-3、3-9、6-9、7。從穩(wěn)定性的方面來看，pH優(yōu)選為5-10，進一步優(yōu)選6-8。
此外，當本發(fā)明的可注射藥物組合物含有肽(1)和肽(2)時，本發(fā)明的液體形式的制劑具有2-10的pH。從穩(wěn)定性的方面來看，當液體形式的制劑是液體制劑時，優(yōu)選的pH包括2-4、2-3、1.7-3.2和1.5-3.5。
在本說明書中，將數(shù)字四舍五入至所述數(shù)字之下一位。例如，當數(shù)字為2時，其顯示不小于1.5且小于2.5。
當本發(fā)明的液體形式的制劑不含pH調(diào)節(jié)劑并顯示比所需pH范圍更高的pH值時，可以通過添加無機酸、有機酸等作為pH調(diào)節(jié)劑將pH調(diào)節(jié)至所需pH。作為無機酸和有機酸，可以使用上述那些。
當本發(fā)明的液體形式的制劑不含pH調(diào)節(jié)劑并顯示比所需pH范圍更低的pH值時，可以使用無機堿或有機堿作為pH調(diào)節(jié)劑。作為無機堿和有機堿，可以使用上述那些。當本發(fā)明的可注射藥物組合物僅含有肽(2)時，優(yōu)選使用無機堿或有機堿作為pH調(diào)節(jié)劑。具體地，可以提及磷酸氫二鈉、氨丁三醇、組氨酸、L-精氨酸和葡甲胺等。優(yōu)選磷酸氫二鈉、氨丁三醇、L-精氨酸和葡甲胺。在本發(fā)明的可注射藥物組合物中，有機堿相對于組合物的重量的含量沒有特別限定。其相對于本發(fā)明的液體形式的制劑的重量的含量為例如1-100 mg/g，1-50 mg/g，1-150 mg/g，5-100 mg/g，5-50 mg/g，5-150 mg/g，10-100 mg/g，10-50 mg/g，10-150 mg/g 等。
當本發(fā)明的可注射藥物組合物含有肽(1)作為組分(a)時，所述組合物可以含有甘露醇。
在本發(fā)明中，“甘露醇”是一種糖醇，分類為己糖醇，并且對應(yīng)于甘露糖的還原形式。甘露醇含有光學異構(gòu)體，包括D型、L型和DL型，并且這些中的任一種的使用都顯示不影響本發(fā)明的效果。優(yōu)選天然存在的D-甘露醇。盡管甘露醇包括多種晶體體系，但它們中的任一種的使用顯示不影響本發(fā)明的效果。在本發(fā)明的可注射藥物組合物中，甘露糖相對于組合物的重量的含量沒有特別限定。其相對于本發(fā)明的液體形式的制劑的重量的含量為例如1-20 mg/g，1-30 mg/g，1-50 mg/g，3-20 mg/g，3-30 mg/g，5-20 mg/g，5-30 mg/g等。
當本發(fā)明的可注射藥物組合物含有肽(2)作為組分(a)時，所述組合物優(yōu)選還含有增溶劑以防止肽的溶解性變得不穩(wěn)定。作為“增溶劑”，可以使用有機酸。使用增溶劑，肽(2)可以在液體制備物的溶解步驟中快速溶解。此外，對于通過將本發(fā)明的液體形式的制劑冷凍干燥而獲得的冷凍干燥的制劑，當使用注射用水重構(gòu)冷凍干燥的制劑時，其可以迅速再溶解。增溶劑的具體實例包括檸檬酸、乳酸、酒石酸、乙酸和三氟乙酸等。優(yōu)選檸檬酸、乳酸和酒石酸，并且進一步優(yōu)選酒石酸。在本發(fā)明的可注射藥物組合物中，增溶劑相對于組合物的重量的含量沒有特別限定。其相對于本發(fā)明的液體形式的制劑的重量的含量為例如1-5 mg/g，1-10 mg/g，1-15 mg/g，1-20 mg/g，3-10 mg/g，3-15 mg/g，3-20 mg/g，5-10 mg/g，5-15 mg/g，5-20 mg/g，0.1-5 mg/g，0.1-10 mg/g，0.1-15 mg/g，0.1-20 mg/g，0.3-10 mg/g，0.3-15 mg/g，0.3-20 mg/g，0.5-10 mg/g，0.5-15 mg/g或0.5-20 mg/g。
當本發(fā)明的可注射藥物組合物含有肽(1)作為組分(a)時，鑒于所述肽當其作為癌癥疫苗組合物制備時的穩(wěn)定性，所述組合物期望地還含有甲硫氨酸。通過含有甲硫氨酸，當其作為癌癥疫苗組合物制備時，可以抑制肽(1)中含有的甲硫氨酸殘基的氧化。
本發(fā)明中的“甲硫氨酸”是必需氨基酸之一，并且是側(cè)鏈中包含硫原子的疏水性氨基酸。盡管“甲硫氨酸”具有光學異構(gòu)體且包括D型、L型和DL型，但可以使用這些中的任一種，而不影響本發(fā)明的效果。甲硫氨酸經(jīng)常用作藥物產(chǎn)品的賦形劑，并且日本藥典(第16版)中描述的L型是優(yōu)選的。在本發(fā)明的可注射藥物組合物中，甲硫氨酸相對于組合物的重量的含量沒有特別限定。其相對于本發(fā)明的液體形式的制備物的重量的含量為例如1-5 mg/g，1-10 mg/g，1-20 mg/g，1-30 mg/g，3-10 mg/g，3-20 mg/g，3-30 mg/g，5-10 mg/g，5-20 mg/g，5-30 mg/g等。
另外，除了上述組分，本發(fā)明的可注射藥物組合物，還可以適當?shù)匕ǔＳ糜谒幬镏苿┑馁x形劑，諸如穩(wěn)定劑、增溶劑、緩沖劑、等滲劑等，只要不影響本發(fā)明的效果。
本發(fā)明的可注射藥物組合物可以通過通常用于產(chǎn)生藥物產(chǎn)品等的方法來產(chǎn)生。例如，在維持在5-25℃的恒定溫度的環(huán)境下將注射用水添加至合適的容器中，并向其中添加預先稱重的肽和賦形劑，同時緩慢攪拌混合物。然后，將混合物最終調(diào)節(jié)至具有所需pH。將混合物通過過濾等滅菌，并填充在容器諸如玻璃小瓶等中，其用橡膠塞等密封。當產(chǎn)生冷凍干燥的制劑時，可以通過本身已知的方法將獲得的本發(fā)明的液體形式的制劑冷凍干燥。
盡管本發(fā)明的肽也可以各自單一用作癌癥疫苗的抗原肽，但癌癥疫苗組合物中也可以含有肽(1)和肽(2)。由于肽(2)本身單一結(jié)合HLA并誘導CTL，以及當與肽(1)組合使用時提供作為輔助肽的效果，預期含有肽(1)和肽(2)兩者的癌癥疫苗組合物顯示協(xié)同疫苗效果。當癌癥疫苗組合物中含有兩種肽時，可以將含有兩種肽的本發(fā)明的單一可注射藥物組合物與佐劑混合，或者可以將含有每種肽的本發(fā)明的兩種可注射藥物組合物與佐劑混合以形成三種材料的混合物。
含有肽(1)和肽(2)兩者的本發(fā)明的液體形式的制劑可以通過將兩種肽進行上述產(chǎn)生方法來直接制備(在單個步驟中)，或者也可以通過使每種肽進行上述產(chǎn)生來制備單獨的液體制劑或懸浮液制劑并混合它們來獲得。在一個優(yōu)選實施方案中，可以提及這樣的方法，其包括將含有肽(1)的液體制劑或懸浮液制劑冷凍干燥，并添加含有肽(2)的液體制劑或懸浮液制劑以溶解或懸浮含有肽(1)的冷凍干燥的制劑。或者，制備兩種含有各肽的冷凍干燥的制劑，將含有肽(2)的冷凍干燥的制劑重新溶解或再懸浮于比冷凍干燥前的液體制劑或懸浮液制劑更少量的水中，并且將溶液或懸浮液添加至含有肽(1)的冷凍干燥的制劑中以溶解或懸浮于其中，由此可以制備具有比冷凍干燥前的液體制劑或懸浮液制劑的濃度更高的濃度的液體制備物或懸浮液制劑。
盡管使用本發(fā)明的可注射藥物組合物的癌癥疫苗的制備方法沒有特別限制，但可以提及，例如，通過與適當佐劑混合來制備癌癥疫苗的方法；通過預先與適當佐劑混合并將混合物冷凍干燥等來制備癌癥疫苗的方法；通過當使用時將本發(fā)明的液體形式的制劑與各種佐劑混合來制備癌癥疫苗的方法等。佐劑的實例包括沉降性佐劑、油性佐劑等。沉降性佐劑是吸附肽的無機物質(zhì)的懸浮液。沉降性佐劑的具體實例包括氫氧化鈉、氫氧化鋁(Alum)、磷酸鈣、磷酸鋁、硫酸鋁鉀、PEPES、羧基乙烯基聚合物等。油性佐劑是油性乳劑，其中含有肽的水溶液包封在礦物油中以形成用于乳化的膠束。油性佐劑的具體實例包括液體石蠟、羊毛脂、弗氏佐劑(完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑)、Montanide、W/O乳劑(參見WO 2006/078059)等。
使用本發(fā)明的可注射藥物組合物制備的癌癥疫苗可用于預防或治療與WT1基因的表達水平升高相關(guān)的癌癥，例如血液癌癥諸如白血病，骨髓增生異常綜合征，多發(fā)性骨髓瘤，惡性淋巴瘤等，以及實體瘤諸如胃癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌，乳腺癌，生殖細胞癌，肝癌，皮膚癌，膀胱癌，前列腺癌，子宮癌，子宮頸癌，卵巢癌，腦腫瘤等。
由于本發(fā)明的可注射藥物組合物可以穩(wěn)定地保持作為活性成分的癌抗原肽，所以可以選擇各種施用形式。具體地，可以提及經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、經(jīng)皮、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用等，并且可以根據(jù)使用目標通過上述方法制備癌癥疫苗。通常，作為優(yōu)選用于用癌癥疫苗的免疫刺激的施用途徑，腸胃外施用是已知的，并且可以提及，例如，腹膜內(nèi)施用，皮下施用，皮內(nèi)施用，肌肉內(nèi)施用，靜脈內(nèi)施用，以及經(jīng)鼻施用，經(jīng)皮施用等。這些中，可以優(yōu)選提及通過注射的施用，諸如皮下施用，皮內(nèi)施用，腹膜內(nèi)施用，肌肉內(nèi)施用等。
[實施例]
以下通過參考實施例、比較實施例、實驗實施例等更詳細地進行解釋本發(fā)明，所述實施例、比較實施例、實驗實施例等不應(yīng)當被解釋為限制性的。
作為由Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列組成的肽(肽(2))，使用通過專利文獻(WO 2010/123065)中描述的方法產(chǎn)生的肽；作為海藻糖，使用作為海藻糖水合物的“海藻糖SG(由Hayashibara Biochemical Lab制造)”；且作為D-甘露醇，使用“mannit S(由Mitsubishi Shoji Foodtech制造)或低內(nèi)毒素的D-(-)-甘露醇(由Merck制造)”。作為氨丁三醇，使用“氨丁三醇(由Nacalai Tesque制造)”；作為組氨酸，使用“組氨酸(由Nacalai Tesque制造)”；作為L-精氨酸，使用“L-精氨酸鹽酸鹽(由Nacalai Tesque制造)；且作為葡甲胺，使用“葡甲胺(由Nacalai Tesque制造)”。作為乳酸，使用“乳酸(由Nacalai Tesque制造)”；作為酒石酸，使用“L(+)-酒石酸，粉末(由Merck制造)”；且作為檸檬酸，使用“檸檬酸單水合物(由Nacalai Tesque制造)”。作為甲硫氨酸，使用“L-甲硫氨酸(由Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.制造)”。作為pH調(diào)節(jié)劑，使用鹽酸，“1 mol/l鹽酸(由Nacalai Tesque制造)”；作為氫氧化鈉，使用“1 mol/l氫氧化鈉溶液(由Nacalai Tesque制造)”；并且作為磷酸二氫鈉，使用“磷酸二氫鈉(由Nacalai Tesque制造)”。作為Montanide，使用“(Montanide ISA 51 VG(由SEPPIC制造)”。
[肽的合成]
由式(1)表示的肽(肽(1))的合成
步驟1. H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH的合成
(C(Npys)RMFPNAPYL的合成)
使用282 mg Fmoc-Leu-Alko-樹脂(Alko是對烷氧基芐醇)(由Watanabe Chemical制造；0.71 mmol/g，0.2 mmol)作為起始材料，根據(jù)Fmoc/tBu方法，通過固相合成組裝肽鏈。使用由CS Bio制造的CS336X肽合成儀進行固相合成，并通過用20％哌啶的DMF溶液處理5分鐘和20分鐘來進行Fmoc基團的脫保護。通過與1.05 mmol受保護的氨基酸、1 mmol HBTU和2 mmol DIPEA的DMF溶液反應(yīng)1小時來進行受保護的氨基酸的偶聯(lián)。獲得的樹脂用DMF和乙醚洗滌，并在減壓下干燥，以得到Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-樹脂(630 mg)。向該肽樹脂中添加TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5的混合物(10 ml)，并將混合物在室溫下振蕩2小時。過濾掉樹脂，并將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮。將反應(yīng)混合物冰冷卻并添加二乙醚(50 ml)。將所得沉淀通過過濾收集，用乙醚洗滌并在減壓下干燥，以得到粗肽(217 mg)。將獲得的粗肽溶液溶解于20％乙酸水溶液(7 ml)和乙腈(1 ml)的混合物中，并通過反相HPLC純化。
泵： 由Shimazu制造；LC-8A
柱： YMC ODS-A 3 cm ×25 cm L, 10 μm
洗脫液1： H2O/0.1% TFA
洗脫液2： CH3CN/0.1% TFA
流速： 20 ml/min
檢測： UV 220 nm。
將粗肽溶液注入用15％的洗脫液2平衡的柱中。其后，將洗脫液2的濃度經(jīng)10分鐘升高至37％，并且其后以每分鐘0.24％的速率升高。收集含有目標產(chǎn)物的級分并冷凍干燥，以得到H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (53 mg)。
質(zhì)譜： LC-ESI/MS m/z =1366.1 [M+1]+ (計算值 = 1366.6)
步驟2. (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)二硫鍵的合成
[由式(1)表示的化合物的合成：
其中Cys和Cys之間的鍵是二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵。]。
將步驟1中獲得的H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (50 mg)和通過已知方法(例如，WO 07/063903)合成的H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (即，CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)) (43 mg)混合，添加DMSO (1 mL)，并將混合物在室溫下攪拌20分鐘。將反應(yīng)混合物用0.1％ TFA水(5 ml)稀釋，并通過反相HPLC純化。
泵： 由Shimazu制造；LC-8A
柱： YMC ODS-A 3 cm ×25 cm L, 10 μm
洗脫液1： H2O/0.1% TFA
洗脫液2： CH3CN/0.1% TFA
流速： 20 ml/min
檢測： UV 220 nm。
將反應(yīng)溶液注入用25％的洗脫液2平衡的柱中。其后，洗脫液2的濃度以每分鐘0.25％的速率升高。將含有目標產(chǎn)物的級分收集，冷凍干燥，通過反相HPLC再純化，并冷凍干燥，以得到(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)二硫鍵(即，由式(1)表示的肽(肽(1))(21 mg)。
質(zhì)譜： LC-ESI/MS m/z =1191.8 [M+2]2+ (計算值 =1191.9)
其中Cys和Cys之間的鍵是二硫鍵，Leu-OH顯示Leu的C-末端是游離羧基，而其它鍵是肽鍵。
[液體制劑或懸浮液制劑的制備]
[實施例1]
將作為肽的上述肽(1)(組分(a))和作為組分(b)的海藻糖以表1中所述的量溶解于注射用水中，并將混合物用作為pH調(diào)節(jié)劑的鹽酸和/或氫氧化鈉(組分(c))調(diào)節(jié)至pH 1。在過濾通過0.2 μm除菌過濾器后，將混合物填充在玻璃小瓶中至1 mL并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例1的液體制劑。
[實施例2-10]
以與實施例1中相同的方式，以表1或2中所述的量制備肽(1)、海藻糖、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸和/或氫氧化鈉)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例2、3、5-8和10的液體制劑。
以與實施例1中相同的方式，以表1或2中所述的量制備肽(1)、海藻糖、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸和/或氫氧化鈉)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例4和9的液體制劑。
[實施例11-19]
以與實施例1中相同的方式，以表3或4中所述的量制備作為組分(a)的SEQ ID NO:1 (WAPVLDFAPPGASAYGSL)中所示的肽(下文為肽(2))、海藻糖、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸和/或氫氧化鈉)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例12、15和18的液體制劑。
以與實施例1中相同的方式，以表3或4中所述的量制備作為組分(a)的SEQ ID NO:1 (WAPVLDFAPPGASAYGSL)中所示的肽(下文為肽(2))、海藻糖、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸和/或氫氧化鈉)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例11、13、14、16、17和19的液體制劑。
[實施例20-24]
以與實施例1中相同的方式，以表5中所述的量制備肽(1)、海藻糖、D-甘露醇、注射用水、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸和/或氫氧化鈉)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例20-24的液體制劑。
[實施例25]
將以表6中所述的量制備的肽(1)和海藻糖添加至適量的注射用水中，并通過攪拌機分散混合物，其后將pH用作為pH調(diào)節(jié)劑的鹽酸和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié)至4，以得到實施例25的懸浮液制劑。
[實施例26-29]
以與實施例25中相同的方式，將以表6中所述的量制備的肽(1)和海藻糖添加至適量的注射用水中，并使用表6中所述的pH調(diào)節(jié)劑，并調(diào)節(jié)至表6的pH以得到實施例26-29的懸浮液制劑。
[實施例30]
將作為肽的肽(2)(組分(a))、海藻糖(組分(b))、作為pH調(diào)節(jié)劑的氨丁三醇(組分(c))溶解于注射用水中至表7中所述的量。在過濾通過0.2 μm除菌過濾器后，并且將混合物填充在玻璃小瓶中至1 mL并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例30的液體制劑。
[實施例31-34]
以與實施例30中相同的方式，以表7中所述的量制備肽(2)、海藻糖、pH調(diào)節(jié)劑和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例31-34的液體制劑。
[實施例35-37]
以與實施例1中相同的方式，以表8中所述的量制備肽(2)、海藻糖、增溶劑(檸檬酸、乳酸、酒石酸)、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例35-37的液體制劑。
[實施例38-43]
以與實施例1中相同的方式，以表9或10中所述的量制備肽(2)、海藻糖、增溶劑(酒石酸)、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例38-43的液體制劑。
[實施例44-47]
以與實施例1中相同的方式，以表11中所述的量制備肽(2)、海藻糖、增溶劑(酒石酸)、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)和注射用水，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例44-47的液體制劑。
[實施例48-50]
以與實施例1中相同的方式，以表12中所述的量制備肽(1)、海藻糖、D-甘露醇、注射用水和pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例48-50的液體制劑。
[實施例51-54]
以與實施例1中相同的方式，以表13中所述的量制備肽(1)、海藻糖、D-甘露醇、甲硫氨酸、注射用水和pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例52的液體制劑。
以與實施例1中相同的方式，以表13中所述的量制備肽(1)、海藻糖、D-甘露醇、甲硫氨酸、注射用水和pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例51、53和54的液體制劑。
[實施例55-58]
以與實施例1中相同的方式，以表14中所述的量制備肽(2)、海藻糖、酒石酸、注射用水和pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例55和56的液體制劑。
以與實施例1中相同的方式，以表14中所述的量制備肽(2)、海藻糖、酒石酸、注射用水和pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例57和58的液體制劑。
[實施例59-66]
以與實施例1中相同的方式，以表15或16中所述的量制備肽(1)、肽(2)、海藻糖、D-甘露醇、L-甲硫氨酸、酒石酸、注射用水和pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，將其填充于小瓶中，并用丁基橡膠塞緊密密封，由此獲得實施例59-66的液體制劑。
[冷凍干燥的制劑的制備]
[實施例1A-66A]
將實施例1、4、6、9、11、13、14、16、17、19、20、51、53、54和57-66中產(chǎn)生的液體制劑或懸浮液制劑填充于玻璃小瓶中，置于冷凍干燥機中并冷凍干燥，以得到實施例1A、4A、6A、9A、11A、13A、14A、16A、17A、19A、20A、51A、53A、54A和57A-66A的冷凍干燥的制劑。冷凍干燥在以下條件下進行，所述條件包括在接近-40℃下冷凍液體制劑或懸浮液制劑，將冷凍干燥機中的壓力降低至真空，同時將冷凍干燥機中的溫度升高至接近-20℃，并干燥約20小時，并將冷凍干燥機中的溫度升高至接近30℃并干燥約12小時。
將實施例2、3、5、7、8、10、12、15、18、21-50、52、55和56中產(chǎn)生的液體制劑填充于玻璃小瓶中，置于冷凍干燥機中并冷凍干燥，以得到實施例2A、3A、5A、7A、8A、10A、12A、15A、18A、21A-50A、52A、55A和56A的冷凍干燥的制劑。冷凍干燥在以下條件下進行，所述條件包括在接近-40℃下冷凍液體制劑或懸浮液制劑，將冷凍干燥機中的壓力降低至真空，同時將冷凍干燥機中的溫度升高至接近-20℃，并干燥約20小時，并將冷凍干燥機中的溫度升高至接近30℃并干燥約12小時。
[實驗實施例1] 液體和懸浮液制劑的穩(wěn)定性的評估
將實施例2、3、5、7、8、10、12、15、18、21-26、30-34和52的液體制劑在25℃下儲存1周，并評估純度。通過反相高效液相色譜法(檢測波長：220nm)，使用C18反相柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm或4.6 mm×150 mm，5 μm)和純水、乙腈、三氟乙酸作為流動相測量純度。使用通過該方法測量的峰面積，通過下式計算基于肽的純度和儲存前的純度(作為100％)的相對純度(相比于初始值)。
肽的純度(％)=肽的峰面積/含有相關(guān)物質(zhì)的總峰面積 × 100
相對純度(相比于初始值)(％)=儲存樣品上肽的純度/儲存前肽的純度× 100
結(jié)果顯示于表17中。每種制劑在25℃、1周下顯示不小于80％，并且可以獲得穩(wěn)定的制劑。
[實驗實施例2] 冷凍干燥的制劑的穩(wěn)定性的評估
將實施例5A、10A、12A、15A、18A、23A-26A、30A-43A、48A-50A、52A、55A和56A的冷凍干燥的制劑在60℃下保存2周，并添加注射用水以轉(zhuǎn)化為液體制劑，并評估純度。以與實驗實施例1中相同的方式測量和計算純度。
結(jié)果顯示于表18中。每種制劑在60℃、2周下顯示不小于80％，并且可以獲得穩(wěn)定的制劑。
[實驗實施例3] 冷凍干燥的制劑的再溶解性的評估
將實施例44A-47A的冷凍干燥的制劑在40℃下儲存1個月，并通過目視觀察證實添加注射用水以重構(gòu)水時的再溶解特性。結(jié)果顯示于表19中。表19的結(jié)果表明，預先添加酒石酸作為增溶劑改善了再溶解性。
[實驗實施例4] 特異性CTL誘導活性的證實
獲得實施例67的液體制劑，其含有與實施例51中相同的組成比的肽(1)、海藻糖、D-甘露醇、甲硫氨酸、注射用水、pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸)，且具有調(diào)節(jié)至2.7的pH。將實施例67的液體制劑填充于小瓶中到2 mL，置于冷凍干燥機中并冷凍干燥，以得到實施例67A的冷凍干燥的制劑。將實施例67A的含有肽(1)的冷凍干燥的制劑和實施例55A的含有肽(2)的冷凍干燥的制劑與佐劑混合，以得到癌癥疫苗組合物。另外，以與實驗實施例2中相同的方式評估實施例67A的冷凍干燥的制劑的穩(wěn)定性。作為結(jié)果，在25℃下儲存3個月后的相對純度(相比于初始值)為100％，并且可以獲得穩(wěn)定的制劑。
1) 癌癥疫苗組合物的制備
將實施例55A的含有肽(2)的冷凍干燥的制劑重構(gòu)于1.2 mL注射用水中。將重構(gòu)的溶液收集到1 mL，添加并重新溶解于實施例67A的含有肽(1)的冷凍干燥的制劑中，以得到實施例68的液體制劑。將液體制劑(0.9 mL)與作為佐劑的Montanide (0.9 mL)混合，并將混合物乳化，以得到實施例67的癌癥疫苗組合物。
2) CTL誘導活性評估
通過使用HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)CTL誘導測試評估上述癌癥疫苗組合物的CTL誘導能力。
小鼠MHC有缺陷的HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠表達人MHC HLA-A*02:01和小鼠MHC H-2Db以及HLA-DRB1*01:01的嵌合HLA。使用該小鼠，可以選擇能夠在HLA-A*02陽性人中誘導CTL的肽(Eur J Immunol.2004; 34:3060-9)。另一方面，HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)是表達作為人MHC的HLA-A*24:02和作為小鼠MHC的H-2Kb的嵌合HLA的小鼠。使用該小鼠，可以選擇能夠在HLA-A*24陽性人中誘導CTL的肽(Int J Cancer.2002; 100:565-70)。
將上述癌癥疫苗組合物以50 μL/部位皮內(nèi)施用至小鼠尾基部中的兩個部位。為了評估癌癥疫苗組合物的肽特異性T細胞誘導，使用IFNγ ELISPOT測定試劑盒。在施用后一周，用CO2氣體將小鼠安樂死，分離脾臟，并制備脾細胞。在脾細胞制備的前一天，將ELISPOT板用抗小鼠IFNγ抗體處理，并在脾細胞制備當天用含有10％ FBS的RPMI1640培養(yǎng)基封閉。將制備的來源于HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞以1.25×105個細胞/孔接種，并將制備的來源于HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞以5×105個細胞/孔接種，各自都在封閉的ELISPOT板中。將肽(SEQ ID NO:3、5)以40 mg/mL溶解于DMSO中，并用含有10％ FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進一步稀釋至40μg/mL。將稀釋的肽(SEQ ID NO:3)以10μg/mL的終濃度添加至HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠來源的脾細胞。此外，將稀釋的肽(SEQ ID NO:5)以10μg/mL的終濃度添加至HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠來源的脾細胞。此后，將細胞在37℃、5% CO2下培養(yǎng)18-20小時，以在體外用肽再刺激。培養(yǎng)后，除去上清液，并根據(jù)所附方案使ELISPOT板顯色。通過ImmunoSpot分析儀(由C.T.L.制造)測量顯色的斑點的數(shù)量。
使用HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠的IFNγ ELISPOT測定的結(jié)果顯示于圖1中，并且使用HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠的IFNγ ELISPOT測定的結(jié)果顯示于圖2中。
在圖1和2中，縱軸顯示在接種細胞中反應(yīng)的細胞數(shù)，而橫軸顯示在體外脈沖的肽。在圖1中，黑色條顯示通過脈沖SEQ ID NO:3中所示的肽的HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠來源的脾細胞的培養(yǎng)結(jié)果，而白色條顯示沒有脈沖的培養(yǎng)結(jié)果。也就是說，黑色條和白色條的值的差異顯示肽特異性CTL的數(shù)量，并且顯示施用上述癌癥疫苗組合物在小鼠體內(nèi)誘導對SEQ ID NO:3中所示的肽特異性的CTL。在圖1中，白色條不顯示值。這意味著當目標肽未被脈沖時，HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞沒有反應(yīng)。作為該測試的結(jié)果，在來源于HLA-A*02:01轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞中證實了對SEQ ID NO:3中所示的肽特異性的IFNγ的產(chǎn)生。
此外，在圖2中，黑色條顯示通過脈沖SEQ ID NO:5中所示的肽的HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠來源的脾細胞的培養(yǎng)結(jié)果，而白色條顯示沒有脈沖的培養(yǎng)結(jié)果。也就是說，黑色條和白色條的值的差異顯示肽反應(yīng)性細胞的數(shù)量，并且顯示施用上述癌癥疫苗組合物在小鼠體內(nèi)誘導對SEQ ID NO:5中所示的肽特異性的CTL。在圖2中，白色條不顯示值。這意味著當目標肽未被脈沖時，HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞沒有反應(yīng)。作為該測試的結(jié)果，在來源于HLA-A*24:02轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞中證實了對SEQ ID NO:5中所示的肽特異性的IFNγ的產(chǎn)生。
由此清楚的是，上述癌癥疫苗組合物可以在體內(nèi)誘導對SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5中所示肽特異性的CTL。因此，表明從其中包括肽(1)的肽是穩(wěn)定的制劑和其中包括肽(2)的肽是穩(wěn)定的制劑重新制備的制劑可以用作癌癥疫苗。
[產(chǎn)業(yè)實用性]
根據(jù)本發(fā)明，可以提供含有WT1蛋白衍生的癌抗原肽且顯示良好的懸浮性的懸浮液制劑和通過冷凍干燥該懸浮液制劑而獲得且具有高穩(wěn)定性的冷凍干燥的制劑，并且可以使用該肽作為癌癥疫苗。
本申請基于在日本提交的專利申請?zhí)?014-197667(申請日：2014年9月27日)，其內(nèi)容完全并入本文。
序列表
<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.
<120> 注射用藥物組合物
<130> 092363
<150> JP 2014-197667
<151> 2014-09-27
<160> 6
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 肽
<400> 1
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 肽
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Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
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<220>
<223> 肽
<400> 4
Cys Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<400> 5
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
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<220>
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Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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