本申請要求于2014年7月10日提交的序列號為62/022,754、2014年11月6日提交的序列號為62/076,094、2015年2月13日提交的序列號為62/115,895和2015年4月20日提交的序列號為62/149,892的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，所有這些申請都通過引用而并入本文。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及可溶性β-葡聚糖與包括減輕免疫抑制的抗癌劑在內(nèi)的影響腫瘤微環(huán)境的抗癌劑的組合。β-葡聚糖為真菌PAMP，并且被血清中的模式識別分子C3以及在包括嗜中性粒細胞和單核細胞在內(nèi)的先天性免疫細胞上的模式識別受體——補體受體3(CR3)識別。來源于酵母的多糖β-葡聚糖——β-葡聚糖(β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖)正在作為與抗腫瘤單克隆抗體組合用于治療若干種癌癥的免疫治療劑進行研發(fā)。β-葡聚糖使得先天性免疫效應(yīng)細胞能夠通過補體CR3依賴性機制殺死補體包被的腫瘤細胞。許多動物腫瘤模型已經(jīng)證明，與單獨的任一藥劑相比，可溶性β-葡聚糖與補體激活性、腫瘤靶向性抗體的聯(lián)合施用導致顯著降低的腫瘤生長和改善的總體存活率。然而，癌癥不僅僅是大量的惡性細胞，其還是募集并利用許多其他非轉(zhuǎn)化細胞的復雜“器官”。惡性細胞與非轉(zhuǎn)化細胞之間的相互作用產(chǎn)生腫瘤微環(huán)境(TME)。TME中的非惡性細胞在癌發(fā)生的各個階段具有動態(tài)且多為腫瘤促進性的功能。細胞因子、趨化因子、生長因子和炎癥因子以及基質(zhì)重塑酶的復雜且動態(tài)的網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動受影響組織內(nèi)的細胞間通訊。因此，為了有效對抗癌癥，必須開發(fā)出抑制TME的腫瘤促進性質(zhì)的療法。技術(shù)實現(xiàn)要素：在一個方面，本公開內(nèi)容描述了可溶性β-葡聚糖與影響腫瘤微環(huán)境的抗癌劑組合的用途和組合物。以上對本發(fā)明的概述并非旨在描述本發(fā)明的每一個公開的實施方案或每一次實施。下面的描述更具體地舉例說明了說明性的實施方案。在整個申請中的若干部分，通過實例列表提供了指導，這些實例可以以各種組合的方式來使用。在每種情況下，所記載的列表僅用作代表性的組，而不應(yīng)被解釋為排他性列表。附圖說明圖1A-1D.體外培養(yǎng)的人M1和M2巨噬細胞的形態(tài)和功能表征。圖2A-2D.可溶性β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞的形態(tài)、表型和功能表征。圖3A-3D.在β-葡聚糖處理的來自強結(jié)合者和弱結(jié)合者的M1和M2巨噬細胞中，CD4T細胞增殖以及對IFN-γ和IL-4產(chǎn)生的調(diào)節(jié)的評估。圖4.在免疫抑制條件下，β-葡聚糖處理的M2和M2a巨噬細胞中的T細胞增殖和IFN-γ調(diào)節(jié)的評估。圖5A-5E.在Treg的存在下β-葡聚糖對CD4/CD8T細胞增殖和活化作用的評估。圖6A-6B.體外培養(yǎng)的人未成熟單核細胞來源的樹突細胞(imMoDC)和成熟單核細胞來源的樹突細胞(mMoDC)的表征。圖7A-7D.β-葡聚糖對MoDC成熟的影響的評估。圖8A-8C.由于細胞-細胞接觸而導致的M2-β-葡聚糖增加CD4T細胞增殖的結(jié)果。圖9.由于可溶性因子而導致的M2-β-葡聚糖增加CD4T細胞增殖的結(jié)果。圖10.強結(jié)合者與弱結(jié)合者中β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞的分析。圖11A-11B.在來自強結(jié)合者的血清的存在下，來源于弱結(jié)合者的單核細胞的M2-β-葡聚糖的功能評估結(jié)果。圖12A-12B.在免疫抑制細胞因子(TCM)的存在下培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞上的PD-L1上調(diào)。圖13.MiaPaCa中的PD-L1上調(diào)。圖14A-14B.可溶性β-葡聚糖對骨髓來源的抑制細胞(MDSC)的影響。圖15.腫瘤細胞上的β-葡聚糖誘導的PD-L1表達的評估。圖16.采用IMPRIMEPGG與DC101抗體組合的小鼠研究的結(jié)果。圖17A-17C.可溶性β-葡聚糖和貝伐珠單抗(bevicizumab)對腫瘤微環(huán)境的體內(nèi)影響。具體實施方式β-葡聚糖是來源于包括例如酵母、細菌、藻類、海藻、蘑菇、燕麥和大麥在內(nèi)的多種微生物和植物源的葡萄糖聚合物。其中，已經(jīng)對酵母β-葡聚糖就其免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)進行了廣泛研究。酵母β-葡聚糖可以以多種形式存在，例如，完整酵母、酵母聚糖、純化的全葡聚糖顆粒、溶解的酵母聚糖多糖或不同分子量的高度純化的可溶性β-葡聚糖。在結(jié)構(gòu)上，酵母β-葡聚糖由排列為β-(1,3)-連接的吡喃葡萄糖骨架的葡萄糖單體和經(jīng)由β-(1,6)糖苷鍵連接至該骨架上的周期性β-(1,3)吡喃葡萄糖分支構(gòu)成。不同形式的酵母β-葡聚糖可以彼此不同地發(fā)揮作用。酵母β-葡聚糖發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的機制可受到不同形式的β-葡聚糖之間的結(jié)構(gòu)差異例如其顆粒或可溶性性質(zhì)、三級構(gòu)象、主鏈長度、側(cè)鏈長度和側(cè)鏈頻率的影響。酵母β-葡聚糖的免疫刺激功能還依賴于在不同物種的不同細胞類型中所涉及的受體，該受體也可依賴于β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。通常，β-葡聚糖免疫療法可包括向受試者施用任何適宜形式的β-葡聚糖或兩種或更多種形式的β-葡聚糖的任意組合。適宜的β-葡聚糖以及適宜的β-葡聚糖從其天然來源的制備在例如公開號為US2008/0103112A1的美國專利申請中描述。在一些情況下，β-葡聚糖可以來源于酵母，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在某些情況下，β-葡聚糖可以是或衍生自β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖，其在本文中也稱為PGG(IMPRIMEPGG,Biothera,Eagan,MN)，為酵母來源的可溶性β-葡聚糖的一種高度純化且充分表征的形式。此外，基于β-葡聚糖的免疫療法可涉及使用例如修飾的和/或衍生的β-葡聚糖，如申請?zhí)枮镻CT/US12/36795的國際專利申請中描述的那些。在其他情況下，β-葡聚糖免疫療法可涉及施用例如顆粒狀可溶性β-葡聚糖或顆粒狀可溶性β-葡聚糖制品，它們在例如第7,981,447號美國專利中均有描述?？拱┟庖咧委熕幬锿ㄟ^多種方式殺死癌細胞：1)先天性免疫細胞的直接激活，2)適應(yīng)性免疫細胞的直接激活，3)通過使腫瘤細胞更具免疫原性或通過摧毀腫瘤誘導的免疫抑制而對先天性和適應(yīng)性免疫細胞的間接激活。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境(TME)下的骨髓細胞，包括M2巨噬細胞、N2嗜中性粒細胞和骨髓來源的抑制細胞(MDSC)，通過直接引起細胞毒性T細胞的功能性耗竭或通過間接增加T調(diào)節(jié)細胞(Treg)的抑制能力而在免疫抑制中起到關(guān)鍵作用。這導致TME中免疫刺激與免疫抑制平衡出現(xiàn)偏移。TME的免疫刺激環(huán)境主要受細胞毒性T細胞和NK細胞、細胞溶解和誘導吞噬的M1巨噬細胞、細胞毒性N1嗜中性粒細胞、誘導體液應(yīng)答的B細胞以及抗原呈遞免疫原性樹突細胞(DC)的存在而影響。免疫刺激細胞因子和趨化因子如干擾素γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等是免疫刺激活性的關(guān)鍵協(xié)調(diào)物。使得TME的免疫抑制性質(zhì)發(fā)生偏移的重要參與者為抗炎Th2細胞、N2嗜中性粒細胞、M2巨噬細胞、Treg和致耐受性DC。免疫抑制性細胞因子和趨化因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-10(IL-10)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-4(IL-4)等是免疫抑制活性的關(guān)鍵協(xié)調(diào)物。憑借與骨髓來源的細胞(即嗜中性粒細胞和單核細胞)上的CD11b結(jié)合的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，可溶性β-葡聚糖與N1嗜中性粒細胞和M1巨噬細胞結(jié)合并增加它們的免疫刺激功能，并且降低MDSC、N2嗜中性粒細胞和M2巨噬細胞的免疫抑制功能。這種調(diào)節(jié)導致TME中不同的先天性和適應(yīng)性細胞亞群之間的交互(cross-talk)，并最終使平衡朝免疫刺激方向傾斜。更具體地，一旦與外周血單核細胞結(jié)合，可溶性β-葡聚糖就在M1/抗致瘤性極化相比M2/促致瘤性極化條件下調(diào)節(jié)單核細胞向巨噬細胞的分化，使得M1極化得到增強從而增加巨噬細胞免疫刺激功能，而M2極化得到抑制從而降低巨噬細胞免疫抑制功能。可溶性β-葡聚糖直接影響M2復極化為M1表型并驅(qū)動Th1極化，并且即使在Treg的存在下，可溶性β-葡聚糖引發(fā)的先天性免疫細胞產(chǎn)生細胞因子以間接影響CD4和CD8T細胞增殖，并最終驅(qū)動Th1極化?？扇苄驭?葡聚糖通過已知將先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答聯(lián)系起來的兩個先天性細胞亞群(單核細胞來源的巨噬細胞和樹突細胞)而引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并將會上調(diào)在單核細胞來源的巨噬細胞和樹突細胞兩者上的PD-L1表達。盡管PD-L1上調(diào)，但可溶性β-葡聚糖處理的單核細胞來源的巨噬細胞和樹突細胞使T細胞活化和增殖增強，并且由可溶性β-葡聚糖引發(fā)的協(xié)調(diào)的免疫應(yīng)答引起類似于適應(yīng)性免疫抗性的腫瘤反應(yīng)，即PD-L1表面表達的上調(diào)。可溶性β-葡聚糖可與非補體激活性、腫瘤靶向性減輕免疫抑制的MAb組合。例如，可溶性β-葡聚糖可在包括黑素瘤、腎細胞癌、肺癌等若干種癌癥的治療中與抗PD-L1免疫檢查點抑制劑(Fc-工程化的IgG1MAb)進行組合。已報道，抗-PD1/PD-L1抗體的效力依賴于腫瘤上PD-L1的表達水平。腫瘤上PD-L1表達的機制之一被稱為適應(yīng)性免疫抗性，其中由于腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫應(yīng)答(例如，活化T細胞的干擾素γ產(chǎn)生)而適應(yīng)性地誘導PD-L1表達?？扇苄驭?葡聚糖直接或間接誘導Th1極化。這種作用使PD-L1在腫瘤細胞上的表達上調(diào)，從而增強抗-PD1/PD-L1抗體的抗腫瘤活性。檢驗點抑制劑的實例為納武單抗(nivolumab)和派姆單抗(pembrolizumab)?？扇苄驭?葡聚糖可與增強免疫共刺激的非補體激活性、非腫瘤靶向性MAb組合。例如，a)靶向樹突細胞的抗-CD40MAb(IgG2MAb)，b)若干種癌癥治療中T細胞共刺激的增強劑：抗-OX40、抗-41BB?？扇苄驭?葡聚糖還可與非補體激活性、非腫瘤靶向性減輕免疫抑制的小分子以及非補體激活性、腫瘤靶向性減輕免疫抑制的小分子進行組合。其可用作癌癥疫苗中的佐劑以驅(qū)動Th1極化。其可在治療上用來減弱慢性疾病(即，TB)中的抑制機制，以加速感染的完全清除。最后，其可用來使Th2占優(yōu)勢的自身免疫性疾病(變態(tài)反應(yīng)、哮喘、特應(yīng)性疾病)中的Th2-Th1平衡向Th1極化環(huán)境方向偏移。雖然非補體激活性免疫抑制減輕劑可能是優(yōu)選的，特別是對于非腫瘤靶向劑而言，但本發(fā)明也可利用補體激活性免疫抑制減輕劑來進行。一個實例可為巴維昔單抗(bavituximab)。本發(fā)明部分地包括共施用β-葡聚糖與另一種藥劑，如本文所用的，該藥劑可為抗體制品或小分子制品或為了影響TME而施用的任何制品。如本文所用的，“共施用”是指兩種或更多種組分的組合施用，使得該組合的治療或預(yù)防效果可大于任一組分單獨施用時的治療或預(yù)防效果。兩種組分可以同時共施用或順序地共施用。同時共施用的組分可以在一個或多個藥物組合物中提供。兩種或更多種組分的順序共施用包括這樣的情況，其中施用這些組分使得所有組分在施用后是同時生物可利用的。無論組分是同時共施用還是順序地共施用，組分均可在單一部位或在不同部位處共施用。在另一方面，所述方法包括向受試者施用組合物，該組合物包含與抗體、治療性抗體、抗腫瘤抗體或抗體片段如抗體的Fc部分綴合的β-葡聚糖部分。申請?zhí)枮镻CT/US12/36795的國際專利申請中描述了修飾的和/或衍生的可溶性β-葡聚糖，包括β-葡聚糖部分與抗體的β-葡聚糖綴合物，這也可應(yīng)用于抗體片段的綴合物。β-葡聚糖部分可以是或衍生自β-1,3/1,6葡聚糖。在這種語境中，“衍生自”表示綴合物可能必須通過產(chǎn)生替換β-葡聚糖的一個或多個原子的共價鍵來制備。如本文所用的，“衍生自β-1,3/1,6葡聚糖”是指在替換β-葡聚糖的一個或多個原子以形成綴合物的共價鍵之后作為該綴合物的一部分而保留的β-葡聚糖的一部分?？蓪ⅵ?葡聚糖、抗體或小分子制品和/或兩種組分的組合與“載體”一起配制于組合物中。如本文所用的，“載體”包括任何溶劑、分散介質(zhì)、媒介物、涂料、稀釋劑、抗細菌劑和/或抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這類介質(zhì)和/或試劑作為藥物活性物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑均與β-葡聚糖或抗體不相容，否則將涵蓋其在治療組合物中的應(yīng)用。補充的活性成分也可摻入組合物中。“藥學上可接受的”意指在生物學上或在其他方面并非不期望的物質(zhì)，即，該物質(zhì)可與β-葡聚糖和/或藥劑一起施用至個體，而不會引起任何不期望的生物效應(yīng)或不會以有害的方式與包含它的藥物組合物中的任何其他組分相互作用?？蓪ⅵ?葡聚糖、藥劑和/或兩種組分的組合配制成藥物組合物。在一些實施方案中，β-葡聚糖和藥劑可以在單一制劑中提供。在其他實施方案中，β-葡聚糖和藥劑可以在分開的制劑中提供?？蓪⑺幬锝M合物配制成適應(yīng)于一種或多種優(yōu)選的給藥途徑的各種和/或多種形式。因此，藥物組合物可經(jīng)由一種或多種已知的途徑來施用，包括例如口服、腸胃外(例如，皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)等)或局部(例如，鼻內(nèi)、肺內(nèi)、乳房內(nèi)、陰道內(nèi)、子宮內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、直腸等)給藥途徑?？梢詫⑺幬锝M合物或其部分施用于粘膜表面，例如通過向例如鼻或呼吸道粘膜(例如，通過噴霧或氣霧劑)施用。還可經(jīng)由持續(xù)或延遲釋放來施用藥物組合物或其部分。制劑可以方便地以單位劑型提供，并且可通過藥學領(lǐng)域公知的方法來制備。制備具有藥學上可接受的載體的組合物的方法包括使β-葡聚糖和/或藥劑與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，可通過使活性化合物與液體載體、精細粉碎的固體載體或兩者均勻和/或緊密地結(jié)合，并且如果需要，然后將產(chǎn)物成形為所需的制劑而制備該制劑。β-葡聚糖、藥劑和/或兩種組分的組合可以以任何合適的形式提供，包括但不限于溶液、懸浮液、乳液、噴霧劑、氣霧劑或任何形式的混合物。該組合物可以與任何藥學上可接受的賦形劑、載體或媒介物一起在制劑中遞送。例如，該制劑可以以常規(guī)的局部劑型來遞送，例如乳膏、軟膏、氣霧制劑、非氣霧噴霧劑、凝膠、洗劑等。該制劑可進一步包含一種或多種添加劑，包括例如佐劑、皮膚滲透促進劑、著色劑、香料、調(diào)味劑、保濕劑、增稠劑等。在一些實施方案中，β-葡聚糖可來源于酵母，例如釀酒酵母。在一些實施方案中，β-葡聚糖可包括β-1,3/1,6葡聚糖，例如，β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖。在一些實施方案中，所述方法可包括施用足夠的β-葡聚糖以向受試者提供例如約100ng/kg至約50mg/kg的劑量，但在一些實施方案中，可通過以該范圍之外的劑量施用β-葡聚糖來實施該方法。在一些實施方案中，所述方法包括施用足夠的β-葡聚糖以向受試者提供約10μg/kg至約5mg/kg的劑量，例如約4mg/kg的劑量?；蛘撸刹捎迷谥委熯^程臨開始前獲得的實際體重來計算劑量。對于以這種方式計算的劑量，利用Dubois方法在治療過程開始前計算體表面積(m2)：m2＝(體重kg0.425×身高cm0.725)×0.007184。因此，在一些實施方案中，所述方法可包括施用足夠的β-葡聚糖以提供例如約0.01mg/m2至約10mg/m2的劑量。在一些實施方案中，所述方法可包括施用足夠的能與β-葡聚糖特異性結(jié)合的抗體，以向受試者提供例如約100ng/kg至約50mg/kg的劑量，但在一些實施方案中，可通過以該范圍之外的劑量施用該抗體來實施該方法。在一些實施方案中，所述方法包括施用足夠的抗體以向受試者提供約10μg/kg至約5mg/kg的劑量，例如約100μg/kg至約1mg/kg的劑量?；蛘?，可采用在治療過程臨開始前獲得的實際體重來計算劑量。對于以這種方式計算的劑量，利用Dubois方法在治療過程開始前計算體表面積(m2)：m2＝(體重kg0.425×身高cm0.725)×0.007184。因此，在一些實施方案中，所述方法可包括施用足夠的抗體以提供例如約0.01mg/m2至約10mg/m2的劑量。在一些實施方案中，β-葡聚糖和藥劑可以例如以每周單劑量到多劑量來共施用，但在一些實施方案中，可以通過以該范圍之外的頻率來共施用β-葡聚糖和藥劑而實施該方法。在某些實施方案中，β-葡聚糖和藥劑可以大約每年施用一次至每周施用一次。術(shù)語“和/或”意指所列出的要素的一個或全部，或任意兩個或更多個所列出的要素的組合；術(shù)語“包括”及其變化形式在說明書和權(quán)利要求中出現(xiàn)時不具有限制性含義；除非另有說明，否則“一個”、“一種”、“該”和“至少一個”可互換使用，并且意指一個或超過一個；并且利用端點對數(shù)值范圍的表述包括包含在該范圍內(nèi)的所有數(shù)值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。在前面的描述中，為清楚起見，可以單獨地描述特定的實施方案。除非另外明確說明特定實施方案的特征與另一實施方案的特征不兼容，否則某些實施方案可包括本文關(guān)于一個或多個實施方案所描述的兼容特征的組合。對于包括離散步驟的本文公開的任何方法，這些步驟可以以任何可行的順序進行。并且根據(jù)需要，可以同時進行兩個或更多個步驟的任何組合。本發(fā)明通過以下實施例予以說明。應(yīng)當理解，特定的實施例、材料、量和程序應(yīng)根據(jù)本文所述的本發(fā)明的范圍和精神而進行寬泛地解釋。實施例實施例1體外培養(yǎng)的人M1和M2巨噬細胞的建立和表征：采用Ficoll梯度和磁珠分離來富集來自人全血的CD14+單核細胞。然后將所富集的單核細胞(5×105個細胞/mL)于M1-極化(補充有5％自體血清和100ng/mL重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)(R&DSystems)的XVivo10培養(yǎng)基(LonzaGroup))或M2-極化(補充有10％自體血清和50ng/mL重組人巨噬細胞集落刺激因子(rhM-CSF)(R&DSystems)的XVivo10培養(yǎng)基)條件下培養(yǎng)6天。在為了評價β-葡聚糖的作用而進行的實驗中，首先將全血與媒介物(檸檬酸鈉緩沖液)或25μg/mL可溶性β-葡聚糖在37℃下溫育2小時，然后分離單核細胞并使其分化。在收集巨噬細胞以供表型分析之前檢查其形態(tài)。收集第6天巨噬細胞培養(yǎng)物(MCM)的培養(yǎng)基，離心(spundown)以除去污染的細胞沉淀，然后冷凍以供隨后通過ELISA進行細胞因子分析或用來建立與CD3和CD28刺激的CD4T細胞的共培養(yǎng)物(MCM-CD4T)以用于評估表面標志物或CD4T細胞增殖。在第6天，利用巨噬細胞建立與CD3和CD28刺激或僅CD3刺激的CD4T細胞(Mac-CD4T)的共培養(yǎng)物，以用于評估表面標志物調(diào)節(jié)或?qū)D4T細胞增殖的影響。對于Mac-CD4T細胞增殖研究，以1:10比例將M1或M2巨噬細胞與CD3和CD28刺激或僅CD3刺激的、CFSE標記的自體CD4T細胞一起培養(yǎng)。在實驗結(jié)束時(第9天至第11天)通過流式細胞術(shù)測量T細胞增殖，并且結(jié)果以圖形表示為CFSE-稀釋峰。始終在第11天進行僅CD3刺激的T細胞的評估。定量結(jié)果被報告為在每個培養(yǎng)條件下針對三個重復孔中的每一個計算的分裂指數(shù)(群體經(jīng)歷的細胞分裂的平均次數(shù))。收集Mac-CD4T共培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液用于隨后的細胞因子分析。為了評估Mac-CD4T細胞表面標志物調(diào)節(jié)，如上所述將M2巨噬細胞與T細胞一起共培養(yǎng)，并在第8天、第9天和第10天收獲細胞以對M2巨噬細胞和T細胞二者進行表面受體染色。對于MCM-CD4T細胞增殖研究，用50％MCM來培養(yǎng)CD3和CD28刺激的CFSE標記的CD4T細胞。如上所述在第11天測量T細胞增殖。收集MCM-CD4T細胞共培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液用于隨后的細胞因子分析。如上所述進行MCM-CD4T細胞表面標志物評估。對于如上所述制備和表征的M1和M2巨噬細胞，表征了A)形態(tài)，B)表型，C)Mac-CD4T細胞增殖的功能評價，和D)共培養(yǎng)物中的細胞因子分析。圖1A-圖1C包括來自5個不同實驗的代表性結(jié)果。根據(jù)文獻所述，M1的形態(tài)似乎更圓，而M2則更類似于細長的成纖維細胞(圖1A)。通過流式細胞術(shù)評估M1/M2特異性標志物的表達。計算了同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表1中。表1與關(guān)于表型的文獻一致，M1巨噬細胞通常表達更高水平的HLA-DR和CD274(PD-L1)，而M2巨噬細胞則表達更高水平的CD163和CD14。此外，如圖1B所示，與體外分化的M2巨噬細胞相比，M1巨噬細胞還明顯有助于CD4T細胞增殖。隨著增殖增強，在M1和CD4T細胞共培養(yǎng)物的上清液中觀察到干擾素γ(IFN-γ)的產(chǎn)生增加(圖1C)。用于體外培養(yǎng)和表征人巨噬細胞的備選方法的步驟(包括M1和M2巨噬細胞的活化(稱為M1a和M2a巨噬細胞))概述如下。該方法在以下一系列實驗中使用。表征了如上所述制備和表征的活化M1a和M2s巨噬細胞的形態(tài)和表型。在此示出了來自5個不同實驗的代表性結(jié)果。圖1D示出了M1a和M2a巨噬細胞的形態(tài)。通過流式細胞術(shù)評估M1a/M2a特異性標志物的表達。計算了同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表2中。表2實施例2β-葡聚糖對M2至M1復極化的影響：如上所述制備來自媒介物處理的或β-葡聚糖處理的全血的M1和M2巨噬細胞。通過流式細胞術(shù)測量一組M1/M2特異性標志物(包括HLA-DR、CD163、CD206、CD209、CD80、CD86和PD-L1)的表達。β-葡聚糖預(yù)處理不影響M1巨噬細胞表型，但的確影響M2巨噬細胞表型。如圖2A所示，CD163的平均熒光強度(MFI)在β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞中下調(diào)。此外，CD86的表面表達以及PD-L1的蛋白質(zhì)和mRNA水平都得到增強(圖2B)。接下來，將媒介物處理的或β-葡聚糖處理的M1或M2巨噬細胞與CD3和CD28刺激的、羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記的自體CD4T細胞一起培養(yǎng)，并在實驗結(jié)束時通過流式細胞術(shù)來測量T細胞增殖，并將結(jié)果定量地報告為分裂指數(shù)(群體已經(jīng)經(jīng)歷的細胞分裂的平均次數(shù))。圖2C是通過將T細胞與β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞共培養(yǎng)而進行的代表性CFSE稀釋T細胞增殖試驗，并且結(jié)果顯示出β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞增強CD4T細胞增殖的能力。還通過ELISA測量了來自CFSE稀釋T細胞增殖試驗(圖2B)的培養(yǎng)上清液的IFN-γ水平。圖2D是IFN-γ水平的代表圖，其顯示出IFN-γ產(chǎn)生的伴隨增加。因此，β-葡聚糖影響M2至M1復極化并驅(qū)動抗腫瘤發(fā)生的Th1極化。實施例3在來自強結(jié)合受試者和弱結(jié)合受試者的細胞中，β-葡聚糖對M2至M1復極化的影響：評估可溶性β-葡聚糖與嗜中性粒細胞和單核細胞的結(jié)合的早期研究揭示，受試者具有不同的結(jié)合能力。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性β-葡聚糖與至少一些強結(jié)合受試者的免疫細胞結(jié)合，并且強結(jié)合受試者還具有更高水平的天然抗β-葡聚糖抗體。功能研究鑒定了結(jié)合的總體截止值和抗體水平，用其將受試者鑒別為強結(jié)合者(對β-葡聚糖具有高反應(yīng))和弱結(jié)合者(對β-葡聚糖具有低反應(yīng))。為此，對來源于可溶性β-葡聚糖處理的來自強結(jié)合者和弱結(jié)合者的單核細胞的M1/M2巨噬細胞進行了評估。隨后評估來自強結(jié)合者和弱結(jié)合者的M1和M2巨噬細胞的A)表型，B)CD4T細胞增殖的增強，和C)IFN-γ和IL-4產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。圖3A-圖3C示出了來自4個不同實驗的代表性結(jié)果。通過流式細胞術(shù)評估了對媒介物處理的和β-葡聚糖處理的、來源于強結(jié)合者的M1和M2巨噬細胞的一組標志物的表達(對CD163評估兩次)。計算了同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表3中。表3-強結(jié)合者通過流式細胞術(shù)評估了媒介物處理的和β-葡聚糖處理的、來源于弱結(jié)合者的M1和M2巨噬細胞的CD163和CD86。計算了同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，結(jié)果示于表4中。表4-弱結(jié)合者關(guān)鍵的結(jié)果是β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞具有更低的CD163表達，CD163是關(guān)鍵的M2標志物之一。有趣的是，該結(jié)果對強結(jié)合者是特異的，因為CD163的表達在媒介物處理的和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞之間保持相同。接下來，評估了來源于可溶性β-葡聚糖處理的來自強結(jié)合者和弱結(jié)合者的單核細胞的M1/M2巨噬細胞增強CD3和CD28刺激的CD4T細胞增殖的能力。圖3A顯示了強結(jié)合者中CD4T細胞增殖試驗的結(jié)果，而圖3B則示出了弱結(jié)合者中的結(jié)果。在強結(jié)合者中與采用媒介物處理的M2巨噬細胞觀察到的相比，β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞具有顯著更高的增強CD3和CD28刺激的CD4T細胞增殖的能力，而在弱結(jié)合者中增殖沒有增強。此外，無論在強結(jié)合者中還是在弱結(jié)合者中，與媒介物處理的M2巨噬細胞相比，β-葡聚糖處理的M1巨噬細胞在該功能能力方面沒有顯示出差異。然后評估了對媒介物處理的和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞的IFN-γ和IL-4產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。隨著增殖增強，在強結(jié)合者(圖3C)而非弱結(jié)合者(圖3D)中的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞和CD4T細胞的共培養(yǎng)物中觀察到IFN-γ產(chǎn)生顯著增加，但IL-4并非如此。因此，來源于β-葡聚糖處理的單核細胞的M2巨噬細胞在強結(jié)合受試者中是M1樣的。實施例4免疫抑制條件下β-葡聚糖對M2至M1復極化的影響：在免疫抑制細胞因子的存在下，對β-葡聚糖處理的M2a巨噬細胞和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞進行了表型和功能評估。如上所述制備M2或M2a巨噬細胞。在第3天，向M2巨噬細胞培養(yǎng)物添加腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)直到占培養(yǎng)物體積的70％，然后在第6天評估CD163表達和功能活性。已證明，來自BxPC3(一種胰腺癌細胞系)的TCM含有若干種免疫抑制細胞因子，包括M-CSF、TGF-β、IL-4等。如上所述在IL-4中培養(yǎng)M2a巨噬細胞。首先評估了在IL-4中培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2a巨噬細胞和在TCM中培養(yǎng)的M2巨噬細胞的CD163和CD86表達。通過流式細胞術(shù)評估CD163和CD86，并計算同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表5中。表5-免疫抑制條件如在先前使用M-CSF的M2分化實驗中所見，在TCM中培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的單核細胞也顯示出CD163的顯著下調(diào)。此外，β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞具有更高的HLA-DR表達(數(shù)據(jù)未示出)。然后通過CD4T細胞增殖試驗(每個條件重復三次或六次)對調(diào)節(jié)CD4T細胞增殖的能力進行功能評估。與采用媒介物處理的M2和M2a巨噬細胞觀察到的相比，在TCM中培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞和在IL-4中培養(yǎng)的M2a巨噬細胞保持增強CD4T細胞增殖的能力。隨著增殖增強，在巨噬細胞和CD4T細胞的共培養(yǎng)物中觀察到IFN-γ產(chǎn)生的顯著增加(圖4)。上述實施例證明，如通過CD163表達降低、CD86表達增加以及通過M2抑制CD4T細胞增殖的能力受到抑制所證明的，可溶性β-葡聚糖具有抑制M2極化并誘導更類似于M1的細胞的能力。即使在通過存在IL-4與M-CSF或腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)的組合而模擬的免疫抑制條件下，可溶性β-葡聚糖也能夠抑制M2極化并增強其幫助CD4T細胞增殖的能力。M2-可溶性β-葡聚糖對CD4T細胞增殖的增強伴隨著促炎性Th1極化細胞因子IFN-γ的增加，而免疫抑制性細胞因子IL-4的產(chǎn)生沒有變化。實施例5在Treg的存在下β-葡聚糖對CD4/CD8T細胞增殖和活化的影響：為獲得血漿，用25μg/mLβ-葡聚糖或媒介物處理全血6小時、離心并取出血漿。在50,000個T細胞活化CD3/28珠子(用于T細胞擴充和活化的DYNABEADS人T-激活劑CD3/CD28)的存在下，將50,000個自體CFSE標記的PBMC于處理的血漿中培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)結(jié)束時，用CD4和CD8將PBMC染色，并通過CFSE稀釋測量T細胞增殖。如圖5A中的代表性CFSE稀釋圖所示，與媒介物處理的對照相比，來自β-葡聚糖處理的全血的血漿提供了CD4和CD8兩者增殖的顯著增強。接下來，為了顯示可溶性β-葡聚糖對CD4和CD8細胞活化的影響，再次進行了上述的T細胞增殖試驗。但是在第3天，針對包括粒酶B產(chǎn)生和CD25上調(diào)在內(nèi)的激活標志將細胞染色。圖5B中示出的圖形證明，β-葡聚糖處理的血漿增強了CD4和CD8細胞活化。當在血漿分離前將全血處理6小時的溫育期時，對增殖的增強最大，表明對T細胞增殖的這種影響是間接機制(即由先天性免疫細胞的細胞因子釋放)的結(jié)果。為了確定β-葡聚糖對T細胞增殖的增強是直接還是間接的，除了在添加至自體PBMC之前將來自未處理的(媒介物)全血的血漿用β-葡聚糖或媒介物處理之外，如上所述進行T細胞增殖試驗。利用FLOWJO軟件通過分裂指數(shù)對CFSE稀釋進行定量，并以相對于媒介物對照的倍數(shù)變化作圖。圖5C中所示的結(jié)果表明，β-葡聚糖的增強效應(yīng)由間接機制造成。由于這些PBMC培養(yǎng)物含有Treg，因此Treg的抑制能力似乎在可溶性β-葡聚糖的存在下而改變，并進行研究以確定β-葡聚糖是否影響了Treg抑制。將來自β-葡聚糖處理的或媒介物處理的全血的血漿(如上所述)與數(shù)目逐漸增加的分離的自體Treg(CD4+CD25+)一起添加至25,000個分離的CFSE標記的自體CD4T細胞(CD4+CD25-)，產(chǎn)生具有逐漸提高的比例的孔。然后用50,000個T細胞活化CD3/28珠子刺激細胞3天。隨后通過CFSE稀釋測量增殖，并通過分裂指數(shù)將其定量，該分裂指數(shù)用來計算共培養(yǎng)物中Treg的％抑制。％抑制＝100-(Treg孔的分裂指數(shù)/1:0孔的分裂指數(shù))/100。結(jié)果示于圖5D中。與來自媒介物處理的全血的血漿相比，來自β-葡聚糖處理的全血的血漿顯示出Treg的抑制能力的顯著降低。β-葡聚糖對Treg的抑制還導致增強的IFN-γ產(chǎn)生。如上所述進行Treg抑制試驗，并且在共培養(yǎng)3天后，分析上清液的IFN-γ產(chǎn)生。圖5E顯示了來自以8:1的T細胞:Treg比培養(yǎng)的孔的IFN-γ產(chǎn)生的結(jié)果。總之，這些結(jié)果顯示，β-葡聚糖影響CD4和CD8增殖以及Treg功能，導致抗腫瘤適應(yīng)性效應(yīng)子功能的增強。實施例6體外培養(yǎng)的人未成熟單核細胞來源的樹突細胞(imMoDC)和成熟單核細胞來源的樹突細胞(mMoDC)的建立和表征：鑒于巨噬細胞和樹突細胞是將先天性和適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來的兩種關(guān)鍵的抗原呈遞細胞類型，因此還在人單核細胞來源的樹突細胞(MoDC)上評估了可溶性β-葡聚糖的表型效果和功能效果。將從可溶性β-葡聚糖處理的或媒介物處理的全血中富集的單核細胞在含有適當細胞因子GM-CSF加IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以供樹突細胞的分化。用于體外培養(yǎng)和表征人MoDC的方法中包括的步驟概述如下。如上所述制備的imMoDC和mMoDC于圖6A中示出。mMoDC形態(tài)的特征在于存在長突起或樹突。通過流式細胞術(shù)對mMoDC的CD80、CD83、CD86和HLA-DR表達進行了評估，并計算了同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表6中。表6mMoDC顯示成熟和共刺激標志物CD80、CD83、CD86以及HLA-DR的表面表達增加。此外，這些mMoDC還在同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)中顯示出免疫原性(每個條件重復四次)，觸發(fā)CD4和CD8T細胞擴充的增加(圖6B)。實施例7β-葡聚糖對MoDC成熟的影響：進行了由可溶性β-葡聚糖處理的強結(jié)合者和弱結(jié)合者的全血制備的mMoDC的表型和功能評估。如上所述制備來自強結(jié)合者和弱結(jié)合者的mMoDC。通過流式細胞術(shù)對mMoDC的CD80、CD83、CD86和HLA-DR表達進行了評估，并計算了同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表7中。表7-mMoDCβ-葡聚糖處理的來源于強結(jié)合者的mMoDC上CD80、CD86、CD83和HLA-DR的表達增加表明這些mMoDC比來源于弱結(jié)合者的那些更成熟。β-葡聚糖處理的來源于強結(jié)合者的mMoDC還在allo-MLR中顯示出免疫原性的增加(每個條件重復四次)，從而再次觸發(fā)相對于來源于弱結(jié)合者的細胞(圖7B)增加的CD4和CD8T細胞擴充(圖7A)。此外，相對來源于弱結(jié)合者的細胞和媒介物處理的mMoDC，β-葡聚糖處理的來源于強結(jié)合者的mMoDC能夠調(diào)節(jié)IFN-γ產(chǎn)生(圖7C)。來源于β-葡聚糖處理的單核細胞的MoDC即使在免疫抑制條件下也是更成熟的。如上所述制備MoDC。在第0天添加TCM直到占培養(yǎng)物體積的70％，并且TCM在整個培養(yǎng)期間都存在。隨后評估在TCM存在下培養(yǎng)的mMoDC的表型改變。計算同種型對照染色和表面抗原染色的MFI中值，該結(jié)果示于表8中。表8-免疫抑制條件實施例8細胞-細胞接觸和可溶性因子增加由β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞引起的CD4T細胞增殖：利用CD4T細胞增殖作為讀出(read-out)，研究了在由β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞引發(fā)增殖中對細胞-細胞接觸或可溶性因子的要求。為了研究巨噬細胞與T細胞之間的細胞-細胞接觸，當在不存在CD28共刺激的情況下與β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞共培養(yǎng)時測量了CD4T細胞增殖，并在共培養(yǎng)物中的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞和T細胞二者上研究了表面活化標志物的調(diào)節(jié)。細胞-細胞接觸的評估如下進行：將媒介物處理的和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞以及CD3和CD28刺激與僅CD3刺激的CD4T細胞共培養(yǎng)物用于測量CD4T細胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生。如圖8A所示，在不存在外源CD28抗體的情況下與CD4T細胞一起培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞表現(xiàn)出顯著更高的增強CD4T細胞增殖的能力。隨著增殖增強，在β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞與CD4T細胞的共培養(yǎng)物中觀察到顯著增加的IFN-γ產(chǎn)生(圖8B)。還測量了巨噬細胞以及CD3和CD28刺激的T細胞二者上表面標志物表達的變化。通過流式細胞術(shù)評估了來自共培養(yǎng)物的媒介物處理的和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞和CDT細胞對于共刺激分子或共抑制分子的調(diào)節(jié)。圖8C和表9為來自2個不同實驗的代表性結(jié)果。表9表面標志物巨噬細胞上MFI的變化*T細胞上MFI的變化*HLA-DR無變化NACD86增加NACD80無變化NACD28NA無變化CTLA-4NA無變化CD40無變化NACD40LNA無變化4-1BBL無變化NA4-1BBNA無變化OX40無變化NAPD1(CD279)NA增加PD-L1(CD274)增加NACD209無變化NACD172無變化NA*β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞/T細胞上的MFI相對于在媒介物處理的M2巨噬細胞/T細胞中觀察到的MFI的變化在所有測試的表面標志物中，與媒介物處理的M2巨噬細胞上所觀察到的相比，在β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞的表面上觀察到CD86(第8天)和PD-L1(第9天)的表面表達的相對增加。在與β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞共培養(yǎng)的T細胞的表面上觀察到PD-1(第9天)表達的增加。為了確定是否需要由β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞分泌的可溶性因子，對與β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞MCM(50％體積)共培養(yǎng)的CD4T細胞增殖進行了測量，并觀察了與MCM一起溫育的T細胞上的表面活化標志物調(diào)節(jié)。圖9代表2個不同的實驗。當通過CD4T細胞增殖試驗評估時，與媒介物處理的M2巨噬細胞MCM相比，與CD4T細胞一起培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞MCM表現(xiàn)出顯著更高的增強CD4T細胞增殖的能力(圖9)。此外，評估了在媒介物處理的和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞MCM中培養(yǎng)的CD4T細胞對共刺激或共抑制分子(CD80、CD28、CTLA-4、4-1BB和PD-1)的調(diào)節(jié)。令人驚訝的是，未觀察到任何T細胞標志物的變化(數(shù)據(jù)未示出)。實施例9強結(jié)合者與弱結(jié)合者中β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞的分析：如前所述，已顯示，受試者中的抗β-葡聚糖抗體(ABA)閾值對β-葡聚糖免疫療法是重要的。因此，研究了ABA閾值對β-葡聚糖調(diào)節(jié)M1/M2極化的能力的重要性。通過表型評估和功能評估確定了β-葡聚糖調(diào)節(jié)強結(jié)合者與弱結(jié)合者中的M1/M2極化的能力。制備了來自4位強結(jié)合者和4位弱結(jié)合者的M2巨噬細胞，并評估了它們調(diào)節(jié)CD4T細胞增殖的能力。通過ELISA來測量來自各種CD4T細胞增殖條件的上清液的IFN-γ。圖10所示的結(jié)果是來自4個不同實驗的代表。針對4位供體中的每一位，以相對于在媒介物處理的M2巨噬細胞和CD4T細胞的共培養(yǎng)物中產(chǎn)生的IFN-γ水平的倍數(shù)變化進行繪圖。在弱結(jié)合者中，β-葡聚糖在M1/M2極化條件下未調(diào)節(jié)單核細胞來源的巨噬細胞上的任何表型標志物(數(shù)據(jù)未示出)，并且在通過CD4T細胞增殖試驗對弱結(jié)合者的功能評估中，β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞既未增強CD4T細胞增殖也未增加IFN-γ產(chǎn)生。實施例10血清交叉研究：因為β-葡聚糖未能在弱結(jié)合者中顯示出M1/M2極化的調(diào)節(jié)，所以在含有更高水平ABA的血清的存在下(來自強結(jié)合者的血清交叉)，評估了采用來自弱結(jié)合者的單核細胞由β-葡聚糖引起的調(diào)節(jié)。為檢驗這一點，在進行了少許修改的情況下如上所述制備M2巨噬細胞。將弱結(jié)合者的全血離心以去除血漿，然后用從強結(jié)合者中獲得的血清來重建細胞。在37℃下用媒介物或β-葡聚糖(25μg/mL)將重建的血液處理2小時。通過采用抗β-葡聚糖特異性單克隆抗體及隨后采用流式細胞術(shù)來評估單核細胞的結(jié)合。然后分離全血中媒介物處理的或β-葡聚糖處理的單核細胞，并使其分化成M2巨噬細胞，并且采用上述方法使用M2細胞(數(shù)據(jù)未示出)或MCM來評估它們增強CD4T細胞增殖(每個條件重復六次)和增加IFN-γ產(chǎn)生的能力。弱結(jié)合者的全血中的單核細胞未與β-葡聚糖結(jié)合，但當將含有更高水平ABA的強結(jié)合者的血清添加至弱結(jié)合者的全血中時，顯示出顯著更高的結(jié)合(圖11A)。此外，與采用媒介物處理的M2巨噬細胞上所觀察到的相比，來自與強結(jié)合者的血清交叉的β-葡聚糖處理的弱結(jié)合者M2巨噬細胞的MCM具有顯著更高的增強CD4T細胞增殖的能力。隨著增殖增強，在β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞與CD4T細胞的共培養(yǎng)物中觀察到顯著增加的IFN-γ產(chǎn)生(圖11B)。實施例11在免疫抑制細胞因子(TCM)的存在下培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞上的PD-L1上調(diào)：如上所述制備單核細胞或M2巨噬細胞。在第3天，添加TCM直到占培養(yǎng)物體積的70％，然后評估TCM下的PD-L1表達，然后在與CD4T細胞共培養(yǎng)時再次評估PD-L1表達。在TCM中培養(yǎng)的β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞具有更高的PD-L1表面表達(圖12A)。在與CD4T細胞共培養(yǎng)時，表達也增加(圖12B)。利用上述系統(tǒng)，如通過關(guān)鍵M2標志物CD163的表達降低以及通過M2抑制CD4T細胞增殖的能力受到抑制所證明的，確定了β-葡聚糖具有抑制M2極化的能力。即使在通過存在IL-4與M-CSF(數(shù)據(jù)未示出)或腫瘤條件培養(yǎng)基(TCM)的組合而模擬的免疫抑制環(huán)境下，β-葡聚糖也能夠抑制M2極化并增強其幫助CD4T細胞增殖的能力。M2-β-葡聚糖對CD4T細胞增殖的增強伴隨著促炎性Th1極化細胞因子IFN-γ的增加，而免疫抑制性細胞因子IL-4的產(chǎn)生沒有變化。如隨著T細胞活化和IFN-γ產(chǎn)生增加所預(yù)期的，觀察到PD-L1在β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞上的表面表達和PD-1在T細胞上的表面表達的增加。β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞本身以及由該細胞分泌的可溶性因子對于增強CD4T細胞增殖是重要的。最后，β-葡聚糖僅在來自具有更高水平ABA的健康供體的細胞中抑制M2極化。實施例12MiaPaCa中的PD-L1上調(diào)：用強結(jié)合者血清和弱結(jié)合者血清培養(yǎng)β-葡聚糖處理的和媒介物處理的M2巨噬細胞和β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞+ABA，以評估腫瘤細胞上的PD-L1表達。圖13顯示，β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞使強結(jié)合者中的腫瘤細胞上的PD-L1表達增加，并且隨著ABA的添加，β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞還使弱結(jié)合者中的腫瘤細胞上的PD-L1表達增加。實施例13可溶性β-葡聚糖對骨髓來源的抑制細胞(MDSC)的影響：MDSC積聚在大多數(shù)患有癌癥的患者和實驗動物的血液、淋巴結(jié)和骨髓中以及腫瘤部位處，并且既抑制適應(yīng)性免疫又抑制先天性免疫。MDSC由腫瘤分泌的因子和宿主分泌的因子誘導，其中許多因子都是促炎分子。促炎介質(zhì)對MDSC的誘導產(chǎn)生以下假說：炎癥促進使免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫下調(diào)的MDSC的積聚，從而促進腫瘤生長。在不同時間從進行MPRIMEPGG治療的病例研究受試者中抽取血液，并分析MDSC的存在。第一次抽血在輸注前，第8循環(huán)，第1天進行。如圖14A所示，外周血中存在大量的CD33+MDSC。第二次抽血在輸注后，第8循環(huán)，第1天進行。如圖14A中的第二幅圖所示，在輸注后的幾小時內(nèi)，MDSC短暫消失。最后一個血液樣品在在輸注前，第8循環(huán)，第15天抽取。CD33+MDSC再次出現(xiàn)在外周血中。在另一項研究中，將人臍帶血經(jīng)針對CD34+細胞進行富集，并培養(yǎng)9天以產(chǎn)生CD33+CD11b+細胞(MDSC)。然后用可溶性β-葡聚糖或檸檬酸鹽緩沖液(對照)處理MDSC，并評估其抑制T細胞增殖的能力。在CD8T細胞與處理或未處理的MDSC的比例為2:1的條件下進行T細胞增殖試驗。如圖14B所示，β-葡聚糖處理的MDSC對T細胞增殖的抑制性較低。這些結(jié)果表明，β-葡聚糖調(diào)節(jié)MDSC群體，使它們短暫地離開外周血液循環(huán)并且對T細胞增殖的抑制性較低。因此，如果一種或多種癌癥免疫治療藥物或化療藥物與可溶性β-葡聚糖聯(lián)合施用(特別是在CD33+細胞群體短暫缺失期間)，那么該療法將對腫瘤更加有效。實施例14來自β-葡聚糖處理的M2巨噬細胞/MoDC和T細胞共培養(yǎng)物的上清液誘導腫瘤細胞上的PD-L1表達：M2巨噬細胞和MoDC如上所述制備。隨后將巨噬細胞和MoDC如前所述用于T細胞增殖試驗。收獲來自這些增殖試驗的上清液，并將其與包括NSCLC、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和B細胞淋巴瘤在內(nèi)的各種腫瘤細胞系一起溫育。在48小時后通過流式細胞術(shù)評估PD-L1在這些腫瘤細胞系上的表達。圖15示出了來自3個不同實驗的代表性結(jié)果。T細胞的效應(yīng)機理需要三種信號。信號1是在抗原呈遞細胞(APC)上的MHC分子的背景下呈遞的抗原，信號2由APC上的膜共刺激分子提供，而信號3則為在效應(yīng)子功能的環(huán)境中產(chǎn)生的細胞因子。共抑制分子如PD-L1可以抑制T細胞的效應(yīng)子功能。來源于β-葡聚糖處理的單核細胞的巨噬細胞和樹突細胞在體外具有更高的PD-L1表達水平，但該處理也增加了共刺激分子CD86(信號2)和細胞因子(信號3)的表達，從而使得T細胞效應(yīng)子功能增強。由β-葡聚糖引起的更廣泛的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答也增強了腫瘤細胞系上的PD-L1表達。這些結(jié)果證明，免疫細胞和腫瘤細胞兩者上由β-葡聚糖誘導的PD-L1表達上調(diào)使其成為檢查點抑制劑癌癥免疫療法的有希望的組合配偶體。同樣重要的是注意到，β-葡聚糖還具有通過補償機制如增加共刺激分子的表達和免疫刺激性細胞因子的產(chǎn)生而抵消對PD-L1上調(diào)的抑制作用的能力。實施例15可溶性β-葡聚糖與抗血管生成劑組合對TME的影響：腫瘤血管生成改變TME中的免疫功能，從而導致免疫抑制環(huán)境。已經(jīng)證明抗血管生成劑如抗VEGFR2抗體DC101(小鼠雷莫蘆單抗(ramucirumab)在癌癥治療中有用。因為可溶性β-葡聚糖可使TME傾向于更為抗腫瘤的環(huán)境，所以將其與DC101組合用于治療小鼠中的NCI-H441非小細胞肺癌(NSCLC)皮下異種移植物，以增加DC101抗體的有效性。6至8周齡的雌性無胸腺裸鼠在脅腹皮下注射0.2ml體積的5×106個H441腫瘤細胞。當平均腫瘤體積達到約150mm3時，每兩周一次給予小鼠以下藥劑：·0.2ml/小鼠媒介物·1.2mg/小鼠IMPRIMEPGG(Biothera,Inc.)·10mg/kg或20mg/kgDC101(克?。篋C101目錄號：BE0060)在第10天和最后一次給藥后2小時收集血液樣品。處理組包括媒介物(PBS對照)、單獨的IMPRIMEPGG、單獨的DC101和DC101+IMPRIMEPGG。一旦腫瘤大小達到組平均值150mm3，則將腫瘤隨機分入處理組。10mg/kg處理組的結(jié)果在圖16中示出。從圖中可見，IMPRIMEPGG+DC101(補體激活性、非腫瘤靶向性抗體)協(xié)同作用而使腫瘤的生長降至最低。因此，可溶性β-葡聚糖與抗血管生成劑(其可以是或可以不是補體激活性、非腫瘤靶向性抗體)組合是有效的癌癥療法。實施例16可溶性β-葡聚糖與抗PD-L1抗體組合提高無腫瘤存活率：在另一項動物研究中，向小鼠注射MC38腫瘤細胞并將其隨機分入處理組。8至12周齡的雌性C57BL/6小鼠在脅腹皮下注射0.1ml體積的1×106個MC38腫瘤細胞(表達低水平PD-L1的結(jié)腸腺癌)。在第3天開始每兩周一次給予小鼠以下藥劑：·0.2ml/小鼠媒介物·1.2mg/小鼠IMPRIMEPGG(Biothera,Inc.)·100μg/小鼠抗-PDL-1克隆：10F.9G2BioXcell目錄號：BE0101在第1次給藥前1小時、第3次給藥后2小時、終點和最后一次給藥后2小時(第20天)收集血液樣品。處理組包括媒介物(PBS對照)、單獨的IMPRIMEPGG、單獨的抗PD-L1抗體和抗PD-L1+IMPRIMEPGG。一旦腫瘤大小達到組平均值150mm3，則將腫瘤隨機分入處理組。該結(jié)果示于表10中。表10處理組無腫瘤存活者(第29天)媒介物1/18IMPRIMEPGG2/18抗-PD-L16/18抗-PD-L1+IMPRIMEPGG14/17再次，抗PD-L1抗體+可溶性β-葡聚糖的組合協(xié)同作用，以有效地提高無腫瘤存活率。還應(yīng)注意，腫瘤上的PD-L1表達是抗PD-1抗體反應(yīng)性的生物標志。因此，由于可溶性β-葡聚糖誘導腫瘤上的PD-L1表達，因此可溶性β-葡聚糖還將增強抗PD-1抗體的有效性。這通過上述可溶性β-葡聚糖處理誘導的PD-1表達增加而得到證實。實施例17可溶性β-葡聚糖和抗血管生成劑對TME的體內(nèi)影響：如上文針對其他小鼠研究所描述的，向攜帶H1299NSCLC腫瘤的小鼠施用貝伐珠單抗(bevacizumab)(一種抗血管生成抗體)和IMPRIMEPGG。如圖17A所示，施用貝伐珠單抗與IMPRIMEPGG的組合的處理組顯示出PD-L1表達的增加，圖17B顯示精氨酸酶1的下調(diào)，而圖17C顯示與單獨施用貝伐珠單抗的組相比，TME的C11b陽性先天性免疫浸潤物中的iNOS表達增加。iNOS增加和精氨酸酶1減少是指示M1免疫刺激環(huán)境的標志。該數(shù)據(jù)清楚地說明，可溶性β-葡聚糖增強了抗血管生成劑的有效性并在體內(nèi)調(diào)節(jié)TME。本文引用的所有專利、專利申請和出版物以及可通過電子方式獲得的材料(例如，包括例如GenBank和RefSeq形式的核苷酸序列提交材料，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB形式的氨基酸序列提交材料，以及GenBank和RefSeq形式的來自注釋編碼區(qū)的翻譯)的完整公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。在本申請的公開內(nèi)容與通過引用而并入本文的任何文獻的公開內(nèi)容之間存在任何不一致的情況下，應(yīng)以本申請的公開內(nèi)容為準。前面的詳述和實施例僅僅是為了清楚理解的目的而提供的。不應(yīng)從中得出不必要的限制。本發(fā)明不限于所示出和描述的確切細節(jié)，因為對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化將包括在由權(quán)利要求限定的發(fā)明內(nèi)。除非另有說明，否則在說明書和權(quán)利要求書中使用的表示組分的量、分子量等的全部數(shù)字應(yīng)被理解為在所有情況下均被術(shù)語“約”修飾。因此，除非另有相反的指示，否則說明書和權(quán)利要求書中所述的數(shù)值參數(shù)為近似值，其可以根據(jù)本發(fā)明所尋求獲得的預(yù)期性質(zhì)而變化。至少，并且并非試圖將等同原則限制于權(quán)利要求的范圍，每個數(shù)值參數(shù)均應(yīng)當至少根據(jù)所報告的有效數(shù)字的位數(shù)以及通過應(yīng)用普通的舍入技術(shù)來解釋。盡管闡述本發(fā)明的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實施例中闡述的數(shù)值是盡可能精確地報告的。然而，所有數(shù)值都固有地包括必定由在其各自的測試量度中出現(xiàn)的標準偏差導致的范圍。所有標題均是為了方便讀者，并且不應(yīng)被用來限制標題后的正文的含義，除非是如此規(guī)定的。權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種組合物，其包含：可溶性β-葡聚糖；以及減輕免疫抑制的抗癌劑。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述減輕免疫抑制的抗癌劑為檢查點抑制劑。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述檢查點抑制劑為抗-PD-L1抗體。4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其進一步包含：增強免疫共刺激的非腫瘤靶向性抗體。5.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其進一步包含：抗血管生成劑。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述抗血管生成劑為抗血管生成抗體。7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的組合物，其中所述可溶性β-葡聚糖來源于酵母。8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述可溶性β-葡聚糖包含β-1,3/1,6葡聚糖。9.在單一制劑中提供的任何前述權(quán)利要求的組合物。10.如任何前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述可溶性β-葡聚糖組分和所述減輕免疫抑制的抗癌劑組分在分開的制劑中提供。11.可溶性β-葡聚糖和抗-PD-L1抗體在可溶性β-葡聚糖免疫療法中的用途。12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述抗-PD-L1抗體為非補體激活性抗體。13.如權(quán)利要求11-12中任一項所述的用途，其進一步包括增強免疫共刺激的非腫瘤靶向性抗體。14.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖來源于酵母。15.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖包含β-1,3/1,6葡聚糖。16.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖和抗-PD-L1抗體協(xié)同作用以提高無腫瘤存活率。17.可溶性β-葡聚糖和抗-VEGFR2抗體在可溶性β-葡聚糖免疫療法中的用途。18.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述抗-VEGFR2抗體為非補體激活性抗體。19.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖和抗-VEGFR2抗體協(xié)同作用以使腫瘤生長降至最低。20.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖來源于酵母。21.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖包含β-1,3/1,6葡聚糖。22.如權(quán)利要求17所述的用途，其中所述可溶性β-葡聚糖包含β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖。23.一種治療癌癥的方法，該方法包括共施用包含可溶性β-葡聚糖和減輕免疫抑制的抗癌劑的組合物。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖和所述減輕免疫抑制的抗癌劑同時共施用。25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖和所述減輕免疫抑制的抗癌劑在不同時間共施用。26.如權(quán)利要求23-25中任一項所述的方法，其中與所述癌癥有關(guān)的腫瘤細胞在所述組合物共施用之前表達低水平的PD-L1。27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述減輕免疫抑制的抗癌劑為抗-PD-L1抗體。28.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述癌癥為非小細胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、B細胞淋巴瘤、黑素瘤和腎細胞癌中的一種。當前第1頁1 2 3