本發(fā)明屬于腫瘤生物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置。

背景技術(shù)：

迄今為止，癌癥仍是世界上最嚴重的公共健康問題。在中國乃至世界范圍內(nèi)癌癥的發(fā)病率及死亡率仍在不斷攀升，惡性腫瘤已經(jīng)成為導致人類死亡的主要疾病之一。

腫瘤發(fā)生是一個復雜的多因素、多階段過程，是個體基因不穩(wěn)定性及包括人類生活方式在內(nèi)的環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果。1971年Folkman等提出實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管生成，進一步地提出以腫瘤血管生成為靶點，通過腫瘤血管生成抑制劑抑制或破壞腫瘤血管生成，切斷腫瘤營養(yǎng)來源而“餓死”腫瘤的癌癥的新療法。

目前針對腫瘤新生血管的研究有兩大方向：抗血管生成劑(angiogenesis inhibitors,AIs)和血管阻斷劑(vascular disrupting agents,VDAs)。VDAs是指一類能選擇性破壞惡性腫瘤新生血管，從而達到治療癌癥目的的藥物。其作用機制是利用惡性腫瘤新生血管與正常血管在病理生理上的不同，選擇性地與惡性腫瘤新生血管相結(jié)合，直接或間接地使腫瘤新生血管發(fā)生閉塞或損壞，造成腫瘤細胞的缺血壞死，從而起到治療惡性腫瘤的作用。一些小分子VDAs的臨床試驗均報道有心血管不良反應如高血壓、心動過速、緩慢性心律失常、心房顫動、心肌梗死等，這些不良反應限制了其在臨床上的廣泛使用。發(fā)明一種新型有效直觀的診斷檢測此技術(shù)對腫瘤微循環(huán)的影響的技術(shù)手段，對于新藥的研發(fā)和臨床應用具有重大的意義。用于治療腫瘤的射頻治療系統(tǒng)、用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置及利用該裝置進行射頻治療的系統(tǒng)均未有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置，利用該裝置可在富勒烯衍生物和納米材料等藥物結(jié)合射頻治療過程中對腫瘤部位邊射頻治療邊觀測，操作簡單，較小的窗口以及嚴格無菌的操作提供穩(wěn)定可視化的觀察窗，實時直觀地觀測腫瘤及正常組織中的微循環(huán)在治療過程中所產(chǎn)生的變化，保證治療射頻的輔助功能穩(wěn)定有效，為需要射頻能量來輔助治療的富勒烯等血管阻斷藥物及此種新的治療方法的療效機理的研究提供有力且可靠的手段和依據(jù)。

本發(fā)明提供的用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置，它包括：

用于實時動態(tài)觀測的腫瘤微環(huán)境變化的背脊皮翼視窗；

用于進行射頻治療的射頻線圈；

用于將所述背脊皮翼視窗和所述射頻線圈進行可拆卸連接的連接裝置；

用于將所述背脊皮翼視窗和所述射頻線圈隔開、所述射頻線圈和所述連接裝置隔開的非導電材料。

上述的裝置中，所述背脊皮翼視窗可采用常規(guī)的背脊皮翼視窗，在本發(fā)明的一個或多個具體的實施例中，所述背脊皮翼視窗包括：

用于固定背脊皮翼的視窗固定片Ⅰ和視窗固定片Ⅱ；所述視窗固定片Ⅰ和視窗固定片Ⅱ為可拆卸連接；所述視窗固定片Ⅰ和所述視窗固定片Ⅱ中至少一個開設有窗口；

用于固定在所述窗口上的視窗玻片。

上述的裝置中，所述背脊皮翼視窗和所述射頻線圈之間的間隔可為1～10厘米，具體可通過設置所述非導電材料的厚度控制所述間隔。

上述的裝置中，所述背脊皮翼視窗適用動物范圍具體可為所有類型的大鼠和小鼠。所述背脊皮翼視窗中窗口的直徑可為10～50毫米，具體可為27毫米、35毫米或46毫米。所述背脊皮翼視窗可用于光學顯微鏡、熒光顯微鏡及磁共振成像等多種觀察手段。所述背脊皮翼視窗的材質(zhì)可為鈦合金和尼龍。

上述的裝置中，所述可拆卸連接可為螺紋連接，具體可由所述背脊皮翼視窗上的螺絲和螺帽進行連接，射頻線圈相應打孔。

上述的裝置中，所述非導電材料具體可為塑料，如采用塑料片將所述背脊皮翼視窗和所述線圈隔開，采用塑料套管將視窗上的螺絲和線圈隔開。所述非導電材料設置可防止干擾射頻線圈所發(fā)出的射頻信號。

本發(fā)明進一步提供了一種利用上述裝置進行射頻治療的系統(tǒng)，包括射頻發(fā)生裝置、上述用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置以及納米材料；所述射頻發(fā)生裝置發(fā)射的射頻信號通過所述裝置中的射頻線圈施加到腫瘤部位，使富集在腫瘤血管中的納米材料發(fā)生運動破壞腫瘤血管，治療腫瘤。

上述的系統(tǒng)中，所述射頻發(fā)生裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的射頻發(fā)生裝置，可調(diào)節(jié)所述射頻發(fā)生裝置的射頻頻率、射頻功率等。所述射頻發(fā)生裝置具體可包括：一用于發(fā)射出射頻信號的射頻信號發(fā)生器；一用于放大所述射頻信號并整合輸出所需頻率的射頻信號的信號放大器。所述系統(tǒng)還可包括用于檢測所述射頻線圈的功率密度的頻譜儀。所述頻譜儀可為腫瘤治療條件提供參照。

上述的系統(tǒng)中，所述納米材料為具備有以下性質(zhì)的納米材料：(1)表面為親水性和/或表面帶有電負性；(2)該材料具有剛性，使其不易通過腫瘤血管壁孔洞而被卡在所述孔洞；(3)能夠吸收外界輻射能量并在內(nèi)部轉(zhuǎn)化成為熱能，同時將所述熱能蓄積，使得所述納米材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化。

所述納米材料可以是水溶性單質(zhì)金屬、水溶性非金屬納米材料或水溶性復合納米材料，具體可為水溶性富勒烯納米顆粒、水溶性金屬富勒烯納米顆粒、水溶性貴金屬納米顆粒，如金納米顆粒，鉑納米顆粒等，水溶性氧化鐵納米顆粒，水溶性鐵酸錳納米顆粒，水溶性鐵酸鈷納米顆粒等等。在本發(fā)明的一個或多個具體的實施例中，所述納米材料可為水溶性Gd金屬富勒烯納米顆粒(如金屬富勒烯羥基化衍生物Gd@C82(OH)n)。

為了使所述材料不易通過腫瘤血管壁孔洞而被卡在所述孔洞，所述納米材料的粒徑可為50～250nm，如100～200nm。

所述納米材料可以水溶液的形式存在，所述納米材料的水溶液的濃度可為0.1～10mM，如5mM。

上述的系統(tǒng)中，所述射頻線圈與不同的治療藥物相匹配；所述射頻線圈的發(fā)射射頻參數(shù)能夠在下述范圍內(nèi)調(diào)節(jié)：發(fā)射射頻頻率為10～300兆赫茲；功率為0～100毫瓦。所述發(fā)射射頻頻率具體可為10兆赫茲、100兆赫茲、200兆赫茲或300兆赫茲。所述的射頻線圈發(fā)射射頻功率具體可為1毫瓦、10毫瓦或15毫瓦。

上述的系統(tǒng)中，所述系統(tǒng)還包括成像系統(tǒng)，具體可為光學顯微鏡或熒光顯微鏡。實時動態(tài)觀測可采用照片或視頻采集的任何手段記錄；所述照片或視頻采集信息可通過任何的成像系統(tǒng)得到觀測腫瘤微環(huán)境時可采用正常組織的血管微環(huán)境作為對照進行觀測；所述腫瘤和正常組織的血管微環(huán)境的變化包括腫瘤血管形態(tài)數(shù)量、血液循環(huán)和腫瘤組織的變化，具體可為血管破裂、出血、血流減少或組織顏色變化。

本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明將動物背脊皮翼視窗模型和射頻治療線圈巧妙結(jié)合，設計不同治療頻率和與不同材質(zhì)的背脊皮翼視窗相匹配的射頻線圈，保證富勒烯類和特定的納米材料等藥物有效的射頻治療效果，同時在射頻治療過程中觀察直觀、操作簡便、可及時并準確地判斷研究治療過程中腫瘤血管和正常血管的情況，為觀察和研究射頻藥物對腫瘤血管的阻斷過程和機理，為評價抗腫瘤特別是射頻作用下腫瘤血管阻斷藥物提供了有效且可靠的手段。

附圖說明

圖1為實施例中小鼠背脊皮翼視窗模型圖。

圖2為實施例中小鼠背脊皮翼視窗模型與射頻線圈結(jié)合后的裝置圖。圖中，各標記如下：1背脊皮翼視窗、2射頻線圈、3螺絲。

圖3為實施例中光學顯微鏡下觀測小鼠背脊皮翼視窗中腫瘤微環(huán)境裝置圖。

圖4為實施例中不同治療時間下小鼠腫瘤血管微環(huán)境成像圖。

圖5為實施例中不同治療時間下小鼠正常組織血管微環(huán)境成像圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置

本發(fā)明提供的一種用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置(圖2所示)，它包括用于實時動態(tài)觀測腫瘤微環(huán)境變化的背脊皮翼視窗(圖1所示)，該背脊皮翼視窗包括用于固定背脊皮翼的視窗固定片Ⅰ和視窗固定片Ⅱ；視窗固定片Ⅰ和視窗固定片Ⅱ中間均開設有窗口；以及用于固定在窗口上的視窗玻片；

用于進行射頻治療的射頻線圈；

用于將視窗固定片Ⅰ、視窗固定片Ⅱ和射頻線圈進行螺紋連接的螺絲和螺帽；

用于將背脊皮翼視窗和射頻線圈隔開、射頻線圈和螺帽隔開的塑料墊片和塑料套管。塑料墊片的厚度使得射頻線圈與背脊皮翼視窗模型窗口相隔1～10厘米。

本發(fā)明裝置在使用時，

首先，拉起背部皮膚，將背脊皮翼視窗固定在腫瘤部位的皮膚上，具體操作如下：將視窗固定片Ⅰ縫合在皮窗固定區(qū)域(腫瘤部位)上，將窗口部分的皮膚剪掉，放入視窗玻片。將視窗固定片Ⅱ放在上面，與背面固定好的固定片Ⅰ對齊，用手術(shù)縫合針縫合。

其次，使視窗背面朝上，擰開背脊皮翼視窗螺帽，將塑料套管套在視窗的螺絲上，將射頻線圈裝在視窗背面的螺絲上，夾取塑料墊片，擰緊螺帽即可。

實施例2、一種可實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的腫瘤治療系統(tǒng)

本發(fā)明提供的一種用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的腫瘤治療系統(tǒng)，它包括射頻發(fā)生裝置、實施例1中的用于實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化的裝置以及Gd@C82的羥基化衍生物(Gd@C82(OH)n)；射頻發(fā)生裝置包括：用于發(fā)射出射頻信號的射頻信號發(fā)生器；用于放大所述射頻信號并整合輸出所需頻率的射頻信號的信號放大器。該系統(tǒng)還可包括用于檢測射頻線圈的功率密度的頻譜儀以及用于觀察腫瘤微環(huán)境變化的光學顯微鏡或熒光顯微鏡。射頻發(fā)生裝置發(fā)射出的射頻信號通過裝置中的射頻線圈施加到腫瘤部位，使富集在腫瘤血管中的Gd@C82的羥基化衍生物(Gd@C82(OH)n)發(fā)生運動破壞腫瘤血管，治療腫瘤。

用于射頻治療腫瘤的藥物Gd@C82的羥基化衍生物(Gd@C82(OH)n)，具體可按照文獻Mingming Zhen,Chunying Shu,Jie Li,et al,Science China materials.2015,58,799中公開的方法制備得到，粒徑為100-200nm。

實施例3、利用本發(fā)明裝置及系統(tǒng)進行射頻治療并實時動態(tài)觀測射頻治療中腫瘤微環(huán)境變化

一、建立背脊皮翼視窗

(1)手術(shù)前準備

準備所需工具及試劑：鈦合金背脊皮翼視窗、手術(shù)剪、眼科鑷、縫合針線、止血鉗、蓋玻片、棉簽、無菌生理鹽水、抗生素、75％酒精及碘伏等，術(shù)前和超凈臺一同紫外殺菌消毒。

(2)移植背脊皮翼視窗手術(shù)

戊巴比妥鈉對實驗小鼠腹腔注射，進行麻醉。待小鼠已基本麻醉，用棉花棒蘸取碘伏，涂抹消毒背部裸露皮膚。拉起小鼠背部皮膚，拉起小鼠背部皮膚，對準光線選取有豐富的血管分布作為皮窗固定區(qū)域。用帶線縫合針縫合夾緊小鼠皮膚的視窗固定片。讓小鼠側(cè)躺，使沒有固定片的側(cè)面朝上，可在下面墊上器械使視窗區(qū)域保持水平，用鑷子小心拉起背部皮膚，開始剪皮，根據(jù)裝入的視窗玻片大小修理皮膚開口，使開口大小略小于玻片。在皮膚開口處滴上含有抗生素的無菌生理鹽水，以防放置視窗玻片時出現(xiàn)氣泡，將視窗玻片小心嵌入皮膚開口，切勿出現(xiàn)氣泡。將另一片視窗固定片放在上面，與背面固定好的固定片對齊，用手術(shù)縫合針縫合。手術(shù)后的小鼠會身份虛弱且容易感染，保證其飲食和生活環(huán)境的整潔。手術(shù)后第一時間用小塊紗布包裹小鼠幫助其保暖。飲食方面，保證每日以雞蛋黃喂食小鼠，飲用水為含有抗生素的無菌水，以防其傷口發(fā)炎。墊料也需要每兩日更換一次，每天堅持觀察小鼠。

(3)背脊皮翼視窗模型接種腫瘤

取正常的小鼠H22腹水，吹打均勻后進行細胞計數(shù)。經(jīng)計算后，細胞密度為每毫升1×10⁷-7.5×10⁷個細胞，用微量進樣針吸取10微升，將小鼠側(cè)臥(視窗的非玻片側(cè)向上)放置在左手，右手掌握微量進樣針從視窗區(qū)域外緊貼皮膚將針頭慢慢推入，讓針頭進入皮膚與視窗玻片之間的間隙，要注意不要穿破皮膚。將細胞慢慢注射在觀察區(qū)的中央，同時漸漸旋轉(zhuǎn)針頭從間隙中抽離出來，完成注射。通常H22腫瘤出現(xiàn)時間大概為術(shù)后4-5天，長出淡粉色腫瘤后即可進行觀察，如圖1所示。在H22腫瘤明顯長出以后，用2％異氟烷氧氣混合氣體對小鼠進行麻醉。用酒清棉簽清潔視窗玻片即可。

二、連接背脊皮翼視窗與射頻線圈

用2％異氟烷氧氣混合氣體保持實驗小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。小鼠側(cè)躺，視窗背面朝上，輕輕擰開背脊皮翼視窗三個螺帽，用鑷子將塑料套管套在視窗的螺絲上，輕輕將對應的200兆赫茲射頻線圈裝在視窗背面的三個螺絲上，用鑷子分別夾取三個塑料墊片，保持視窗平行于桌面，分別輕輕擰緊螺帽即可，如圖2所示。

三、射頻治療下實時動態(tài)觀測射頻治療時腫瘤微環(huán)境

(1)固定裝置于光學顯微鏡鏡臺

用2％異氟烷氧氣混合氣體保持實驗小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。將小鼠視窗窗口朝上側(cè)臥，保持與桌面平行，用專用螺絲將已連接的射頻線圈與平板裝置固定，擰緊后將其放于光學顯微鏡樣品臺并用固定夾夾緊平板裝置，此時保證視窗窗口平面與樣品臺平行，如圖3所示。

(2)施加射頻治療

將射頻線圈接口與射頻發(fā)生裝置連接，設置射頻發(fā)生裝置參數(shù)，射頻頻率為200兆赫茲，射頻功率為10毫瓦，并用頻譜儀檢測視窗窗口處實際射頻功率是否相符。

小鼠靜脈注射給藥5mM的Gd@C82的羥基化衍生物(Gd@C82(OH)n)(粒徑為100-200nm)的水溶液，劑量為15mg/kg，15分鐘后，施加射頻治療1小時。

(3)實時采集圖片進行觀測

用2％異氟烷氧氣混合氣體保持實驗小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)，將其平行固定于顯微鏡樣品臺，用光學顯微鏡4倍鏡頭對窗口內(nèi)腫瘤血管和周圍正常血管進行拍照觀測。拍照時間為治療前、治療30分鐘和1小時。

(4)分析整理數(shù)據(jù)

調(diào)節(jié)不同時間點不同部位拍攝的照片的亮度和對比度，比較同一位置不同時間的變化。

如圖4所示，治療前、治療30分鐘和60分鐘時H22腫瘤血管的變化過程。治療前，腫瘤血管豐富清晰完整；治療30分鐘時，腫瘤血管周圍出現(xiàn)出血點；治療60分鐘時，腫瘤血管周圍出血點面積逐漸變大，血管出現(xiàn)斷裂。說明Gd@C82氨基酸衍生化藥物在此射頻條件下，起到了阻斷H22腫瘤血管的作用，在治療30分鐘時起效并破壞H22腫瘤微環(huán)境，從而達到破壞抑制腫瘤的生長作用，驗證了此藥物在射頻下阻斷腫瘤血管的治療機理。

如圖5所示，治療前、治療30分鐘和60分鐘時正常組織血管的變化過程。在治療前腫瘤周圍正常血管有序清晰完整，隨著治療的進行，在腫瘤血管遭到藥物阻斷治療作用的同時，正常組織的血管并沒有產(chǎn)生變化，沒有被破壞或阻斷。說明此阻斷腫瘤血管的治療對正常組織的血管不產(chǎn)生破壞作用，從而對正常組織不產(chǎn)生毒性或破壞，在治療腫瘤過程中對正常組織器官無毒副作用，驗證了此藥物在射頻下靶向治療腫瘤作用。