本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及腫瘤治療的聯(lián)合用藥。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是目前致死率最大的疾病之一，常規(guī)治療手段如手術(shù)切除、放療和化療等手段較多應(yīng)用于腫瘤治療中，但目前這些手段在治療腫瘤中有其局限性，且很難徹底治愈腫瘤，尤其是一些轉(zhuǎn)移型惡性腫瘤。

化療是目前治療腫瘤的有效手段之一。達(dá)卡巴嗪是化學(xué)名稱為：5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸櫞酸鹽。其在體內(nèi)分解能放出甲基正離子(ch3)+，發(fā)揮烷化作用；同時(shí)又能變成一種與嘌呤生物合成的中間產(chǎn)物相似的物質(zhì)，可能干擾嘌呤的生物合成。目前臨床用于治療黑色素瘤，對肺鱗癌和未分化癌、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等亦有一些治療作用。作為腫瘤化療藥物，其副作用較大，用藥同時(shí)常伴隨有白細(xì)胞減少、血小板減少、食欲不振、惡心、嘔吐、全身不適，肌肉酸痛、高熱等。也可有面部麻木、脫發(fā)，有的病人可有肝腎功能失常。

腫瘤免疫治療一直以來是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。目前腫瘤免疫治療的手段主要有t細(xì)胞過繼療法(adoptivecelltherapy,act)、免疫檢測點(diǎn)阻斷療法(抗pd-1，抗pd-l1和抗ctla-4抗體治療)、腫瘤疫苗以及嵌合抗原受體t細(xì)胞治療(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy)等，這些方法雖然目前都已經(jīng)在臨床研究上取得不錯(cuò)的進(jìn)展，但由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，腫瘤免疫治療目前仍然面臨許多重要障礙。

cd8t細(xì)胞是腫瘤免疫治療的核心，是腫瘤的特異性殺傷細(xì)胞，其殺傷能力強(qiáng)弱以及在腫瘤組織中的浸潤情況直接與腫瘤的預(yù)后直接相關(guān)，而且直接關(guān)系腫瘤免疫治療的成敗。由于腫瘤微環(huán)境是一個(gè)免疫抑制的環(huán)境，cd8t細(xì)胞的功能受到腫瘤微環(huán)境的抑制，目前免疫檢測點(diǎn)阻斷抗體抗pd-1，抗pd-l1和抗ctla-4抗體在治療黑色素瘤的臨床試驗(yàn)中雖然整體效果不錯(cuò)，但單獨(dú)使用時(shí)各自的客觀反應(yīng)率(objectiveresponserate)以及抗pd-1和抗ctla-4抗體聯(lián)合治療客觀反應(yīng)率還是不盡如人意。這意味著急需發(fā)展新的靶點(diǎn)以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤中cd8t細(xì)胞的功能。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝通路包括膽固醇合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及儲(chǔ)存等途徑，其中膽固醇合成通路主要由scap/srebp復(fù)合物以及其下游膽固醇合成限速酶hmgcr調(diào)控；膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的 調(diào)控主要受低密度脂蛋白受體(ldlreceptor)、內(nèi)體(endosome)和溶酶體(lysosome)中npc1/2等蛋白及復(fù)合物的調(diào)控；而膽固醇存儲(chǔ)則受膽固醇的酯化修飾以及去酯化修飾的調(diào)控，關(guān)鍵調(diào)控蛋白包括?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1/2和膽固醇酯水解酶(ceh)。已有研究表明，acat1是一個(gè)治療動(dòng)脈粥樣硬化以及阿爾茨海默病的靶點(diǎn)，并已基于此開發(fā)了一些小分子抑制劑在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，如avasimibe具有很好的臨床安全性。但是現(xiàn)有技術(shù)并沒有披露acat1與腫瘤治療之間的關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供可用于腫瘤治療的聯(lián)合用藥物組合。

本發(fā)明第一方面提供了一種用于腫瘤治療的聯(lián)合用藥物組合，包括有效量的酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和有效量的達(dá)卡巴嗪。

所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的抑制劑是指對于?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果的化合物。

對于?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果包括但不限于：抑制?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1活性，或者抑制?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。

所述的酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑可為sirna、shrna、抗體、小分子化合物。

如本發(fā)明實(shí)施例列舉的，所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑選自：avasimibe、k604、cp113,818，所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑還可選自：purpactins、manassantina、diphenylpyridazinederivatives、glisoprenina、pactimibe、ci976、tmp-153、ym750、geri-bp002-a、sandoz58-035、vulm1457、cl-283,546、ci-999、e5324、ym17e,fr182980、pd132301-2、f-1394、hl-004、f-12511(eflucimibe)、cinnamicacidderivatives、dup128、rp-73163、pyripyropenec、fo-1289、as-183、spc-15549、beaui、beauiii、fo-6979、angelica、ginseng、decursin、terpendolec、beauvericin、spylidone、pentacecilides、cl-283,546、cinnamicderivatives、betulinicacid、shikoninderivatives、esculeogenina和wu-v-23等。

所述聯(lián)合治療藥物組合可以是以下形式中的任意一種：

一)將?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和達(dá)卡巴嗪分別制成獨(dú)立的制劑，制劑的劑型可相同或不同，給藥途徑亦可相同或不同。

二)將?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和達(dá)卡巴嗪配置成復(fù)方制劑。在將?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和達(dá)卡巴嗪采用相同給藥途徑給藥并同時(shí)施加時(shí)，可采用將兩者配置成復(fù)方制劑的形式。

本發(fā)明第二方面提供了一種腫瘤免疫治療聯(lián)合用藥治療方法，為向?qū)ο舐?lián)合施用有效量的?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑，以及有效量的達(dá)卡巴嗪。

所述的對象為哺乳動(dòng)物或所述哺乳動(dòng)物的cd8t細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選為嚙齒目動(dòng)物、偶蹄目動(dòng)物、奇蹄目動(dòng)物、兔形目動(dòng)物、靈長目動(dòng)物等。所述靈長目動(dòng)物優(yōu)選為猴、猿或智人。

所述對象可以是罹患腫瘤的患者或期待提高抗腫瘤免疫力的個(gè)體，或者為罹患腫瘤的患者或期待提高抗腫瘤免疫力的個(gè)體的離體cd8t細(xì)胞。

可以同步的或順序地給予有效量的酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和有效量的達(dá)卡巴嗪。

基于?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)，本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在與達(dá)卡巴嗪聯(lián)合用藥中，兩者可以起到協(xié)同效果，進(jìn)一步增強(qiáng)對于腫瘤的抑制。

所述腫瘤治療針對的腫瘤包括實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤，包括但不限于：鼻腔及鼻竇惡性腫瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺腫瘤、顱內(nèi)腫瘤、甲狀腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、賁門癌、乳腺癌、縱膈腫瘤、胃癌、大腸癌、乙狀結(jié)腸和直腸癌、肝癌、胰腺癌與壺腹周圍癌、膽道癌、小腸腫瘤、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、睪丸惡性腫瘤、陰莖癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、纖維組織細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等。

在部分實(shí)施例中，所述腫瘤治療針對黑色素瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤。

所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑及免疫檢測點(diǎn)阻斷療法藥物可以在接受腫瘤免疫治療前、中、后向?qū)ο笫┯谩?/p>

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)通過一系列體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)acat1在調(diào)控cd8t細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)上起著關(guān)鍵作用，抑制acat1的活性可以增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)其對靶細(xì)胞的殺傷能力，而不影響cd8t細(xì)胞對自身抗原的響應(yīng)；

(2)經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制acat1活性增強(qiáng)cd8t細(xì)胞抗腫瘤能力；

(3)在動(dòng)物水平上，t細(xì)胞特異性基因敲除acat1或者通過抑制劑抑制acat1活性可以增強(qiáng)cd8t細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，在小鼠黑色素瘤模型和小鼠肺癌模型中增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤活性；在與達(dá)卡巴嗪的聯(lián)合治療小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)中，acat1抑制劑 avasimibe可以與達(dá)卡巴嗪協(xié)同促進(jìn)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤活性。

(4)現(xiàn)有技術(shù)雖然論證了?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑的用藥安全性，但是酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑原適應(yīng)癥的臨床效果并不理想。本發(fā)明在腫瘤免疫治療領(lǐng)域給酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑提供了新的臨床應(yīng)用價(jià)值，不僅為其進(jìn)一步的市場應(yīng)用開辟了廣闊的前景，也為腫瘤患者提供了更有效的治療方案。

附圖說明

圖1.acat1敲除增強(qiáng)ot-icd8t細(xì)胞對特異性抗原的免疫應(yīng)答，且并不引發(fā)對自身抗原的免疫應(yīng)答。

a.c57bl/6小鼠來源的脾臟細(xì)胞呈遞外來抗原(n4，a2,t4和g4)或者自身抗原(r4和catnb)后作為抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presentingcell,apc)刺激野生型(wtot-i)或者acat1^ckoot-icd8t細(xì)胞(ckoot-i)。胞內(nèi)染色和流式檢測細(xì)胞因子ifnγ的表達(dá)(n＝4)。

b.c57bl/6小鼠來源的脾臟細(xì)胞呈遞ova抗原(ova257-264)后作為抗原遞呈細(xì)胞刺激野生型(wtot-i)或者acat1^ckoot-icd8t細(xì)胞(ckoot-i)，5天后產(chǎn)生成熟的殺傷型t細(xì)胞(ctls)。為檢測ctl的細(xì)胞殺傷能力，用遞呈ova抗原的el-4作為靶細(xì)胞，與ctl混合培養(yǎng)4小時(shí)后，通過檢測ldh(lacticdehydrogenase,乳酸脫氫酶)的釋放來測定殺傷效率。

c.取3月齡小鼠血清，elisa方法檢測血清中細(xì)胞因子ifnγ和自身抗體抗雙鏈dna抗體水平。

圖2.acat1敲除增強(qiáng)cd8t細(xì)胞抗腫瘤活性。

a-b.野生型小鼠和acat1^cko小鼠中黑色素瘤生長速度以及小鼠的生存曲線分析。腫瘤生長曲線用two-wayanova統(tǒng)計(jì)方法分析，小鼠的生存曲線用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法分析；

c-d.野生型和acat1^cko小鼠在注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞后，在第16天將腫瘤取出，通過流式分析cd8t細(xì)胞中cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達(dá)，同時(shí)對腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過流式檢測cd8/cd4t細(xì)胞比比率以及cd8t細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki-67的表達(dá)；

e.流式檢測腫瘤浸潤cd8t細(xì)胞表面免疫檢測點(diǎn)受體pd-1和ctla-4的表達(dá)；

f.胞內(nèi)染色和流式檢測腫瘤浸潤的treg細(xì)胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例；

g-h.流式檢測引流淋巴結(jié)中cd8t細(xì)胞中cd44、ifnγ的表達(dá)，同時(shí)對cd8t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過流式檢測cd8/cd4t細(xì)胞比比率；

i-k.黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型，在注射黑色素瘤細(xì)胞后第20天，檢測肺臟中腫瘤數(shù)量，同時(shí)繼續(xù)記錄剩余小鼠的生存率和生存時(shí)間，小鼠的生存曲線用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法分析；

l.黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，蘇木精-伊紅染色觀察腫瘤細(xì)胞在肺臟中的浸潤情況；

m.黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，流式檢測肺臟中cd8t細(xì)胞cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達(dá)；

n-p.將體外誘導(dǎo)分化成熟的野生型和acat1^ckoot-ictl尾靜脈注射到荷瘤b16f10-ova(b16f10黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)ovalbumin)的c57bl/6野生型小鼠中，檢測腫瘤的生長以及小鼠的生存率。

圖3.acat抑制劑avasimibe處理增強(qiáng)cd8t細(xì)胞抗腫瘤能力。

a.野生型cd8t細(xì)胞用avasimibe處理(37℃，6小時(shí)，即于rpmi1640完全培養(yǎng)基中加藥后，37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理6小時(shí)，處理完之后用培養(yǎng)基或pbs離心清洗3次)，隨后通過鋪板抗體α-cd3(5μg/ml)+α-cd28(5μg/ml)刺激24小時(shí)，然后胞內(nèi)染色和流式檢測顆粒酶b，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)；

b.avasimibe處理ot-ictl(37℃，6小時(shí))處理方式同a,通過檢測ldh的釋放分析ot-ictl對靶細(xì)胞el-4的殺傷效率；

c.mts方法檢測avasimibe處理對黑色素瘤細(xì)胞b16f10細(xì)胞活率的影響；

d-f.avasimibe處理b16f10黑色素瘤荷瘤的c57bl/6野生型小鼠，檢測腫瘤生長曲線和小鼠生存率；

g-h.在注射腫瘤后第18天將腫瘤取出，通過流式分析腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞中cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達(dá)，同時(shí)對腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過流式檢測cd8/cd4t細(xì)胞比比率以及cd8t細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki-67的表達(dá)；

i.流式檢測腫瘤浸潤cd8t細(xì)胞表面免疫檢測點(diǎn)受體pd-1和ctla-4的表達(dá)；

j.胞內(nèi)染色和流式檢測腫瘤浸潤的treg細(xì)胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例；

k.流式檢測腫瘤組織中mdsc細(xì)胞(gr1⁺cd11b⁺cd45⁺)的比例。

圖4.avasimibe處理上調(diào)cd8t細(xì)胞質(zhì)膜上膽固醇水平，促進(jìn)tcr微簇和免疫突觸形成，增強(qiáng)tcr信號(hào)通路的活化。

a-b.avasimibe處理cd8t細(xì)胞(37℃，6小時(shí))，filipiniii染色檢測cd8t細(xì)胞游離膽 固醇的分布；細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇的相對定量結(jié)果通過leicalasaf軟件處理獲取；

c.avasimibe處理cd8t細(xì)胞后，通過storm對cd8t細(xì)胞質(zhì)膜表面tcr的分布進(jìn)行分析；

d-e.對圖c獲得的成像信息進(jìn)行ripley’kfunction分析，r代表tcr微簇的大小，l(r)-r代表tcr微簇形成的程度；

f-g.avasimibe處理cd8t細(xì)胞后，通過tirfm檢測cd8t細(xì)胞免疫突觸的形成；

h.avasimibe處理ot-ictl細(xì)胞后，用2μg/mlα-cd3和2μg/mlα-cd28激活ctl，然后western-blotting檢測tcr近端信號(hào)通路和下游信號(hào)通路的活化情況；

i-k.storm對腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞進(jìn)行成像以及ripley’kfunction分析。

圖5.acat1基因敲除和avasimibe抑制小鼠llc肺癌發(fā)展進(jìn)程。

a-c.llc肺癌在野生型小鼠和acat1基因敲除小鼠中的進(jìn)程，小鼠生存曲線用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析；

d-g.avasimibe處理llc(lewislungcarcinoma)肺癌荷瘤的小鼠，評估avasimibe在治療小鼠肺癌中的功效，給藥路徑、給藥天數(shù)及每日劑量見圖d，小鼠生存曲線用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析；

圖6.acat抑制劑增強(qiáng)人pbmc中cd8⁺t細(xì)胞的效應(yīng)功能

*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖7.avasimibe與化療藥dacarbazine聯(lián)合用藥抑制小鼠黑色素瘤發(fā)展進(jìn)程。

a-c.對b16f10黑色素瘤荷瘤的野生型c57bl/6小鼠進(jìn)行avasimibe與化療藥dacarbazine聯(lián)合用藥治療，檢測腫瘤生長曲線和小鼠生存率，比較聯(lián)合治療與單一療法效果的差異，給藥路徑、給藥天數(shù)及每日劑量見圖a，小鼠生存曲線用log-rank(mantel-cox)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。

i.g.-灌胃給藥，i.p.-腹腔注射給藥

具體實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抑制?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1可以增強(qiáng)cd8t細(xì)胞對腫瘤的殺傷活性。因此認(rèn)為?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑可用作腫瘤免疫治療劑與其他腫瘤免疫治療劑聯(lián)合使用以提高腫瘤免疫治療療效。進(jìn)一步的研究表明，在與抗pd-l1抗體聯(lián)合用藥中，兩者可以起到協(xié)同效果，可進(jìn)一步增強(qiáng)對于腫瘤的抑制。

?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat

酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的平衡的一種酶，在生物體內(nèi)催化膽固醇與長鏈脂肪酸形成膽固醇酯。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)兩種同工異構(gòu)酶acat1和acat2。acat1選擇性地在組織與細(xì)胞中表達(dá)，與細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝平衡有關(guān)；而acat2則廣泛存在于肝臟、胃腸道等細(xì)胞中，主要參與飲食中膽固醇的吸收和載脂蛋白的裝配。

酰基輔酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑

是指對于?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果的化合物。對于酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1活性，或者抑制?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。

所述的?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑包括但不限于為sirna、shrna、抗體、小分子化合物。

所述?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑可以是對acat1與acat2沒有選擇性的acat抑制劑，已知的例如purpactins，manassantina,diphenylpyridazinederivatives,glisoprenina，cp113,818,avasimibe,pactimibe等，也可以是對acat1具有選擇性抑制的抑制劑如k604等。

抑制?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1活性是指使?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1酶活力下降。優(yōu)選的，相比抑制前，?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1酶活力降低至少10％，較佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)是指：使?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因不轉(zhuǎn)錄，或降低酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因的轉(zhuǎn)錄活性，或者使酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因不表達(dá)，或降低?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1的基因的表達(dá)活性。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法對acat1基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，如基因敲除、同源重組，干擾rna等。

?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的抑制可以通過pcr及westernblot檢測表達(dá)量驗(yàn)證。

優(yōu)選地，與野生型相比，acat1基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)降低至少10％，較佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地acat1基因完全沒有表達(dá)。

小分子化合物

本發(fā)明中指由幾個(gè)或幾十個(gè)原子組成，分子質(zhì)量在1000以下的化合物。

avasimibe(ci-1011)

化學(xué)名稱：2,6-diisopropylphenyl2-(2,4,6-triisopropylphenyl)acetylsulfamate

分子式：c29h43no4s

ic50:acat,3.3μm；cyp2c9,2.9μm；cyp1a2,13.9μm；cyp2c19,26.5μm

casno.166518-60-1

結(jié)構(gòu)式如下

k604

化學(xué)名稱：

2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-n-[2,4-bis(methylthio)-6-methyl-3-pyridyl]acetamide

ic50:acat1,0.45μm；acat2,102.85μm

結(jié)構(gòu)式：

在文獻(xiàn)ikenoya,m.etal.aselectiveacat-1inhibitor,k-604,suppressesfattystreaklesionsinfat-fedhamsterswithoutaffectingplasmacholesterollevels..atherosclerosis191,290-297,

doi:10.1016/j.atherosclerosis.2006.05.048(2007)中公開。

cp113,818

化學(xué)名稱：(-)-n-(2,4-bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoicamide

ic50:17-75nm

結(jié)構(gòu)式：

在文獻(xiàn)hutter-paier,b.etal.theacatinhibitorcp-113,818markedllyreducesamyloidpathologyinamousemodelofalzheimer'sdisease.neuron44,227-238,

doi:10.1016/j.neuron.2004.08.043(2004)中公開

u18666a

casno.3039-71-2

ci976

化學(xué)名稱：2,2-dimethyl-n-(2,4,6-trimethoxyphenyl)dodecanamide

分子式：c23h39no4

casno.114289-47-3；

ic50:soat1:ic50＝73nm(human)；acylcoenzymea:cholesterolacyltransferase1:ic50＝73nm(rat)；sterolo-acyltransferase,soat:ic50＝110nm(rat)；foamcellformation:ic50＝3.8μm(ratperitonealmacrophages)；golgi-associatedlpatactivity:ic50＝15μm

結(jié)構(gòu)式

tmp-153

分子式：c24h18cif2n3o

casno.128831-46-9

ic50:cholesterolacyltransferase(acat):ic50＝5-10nm；acylcoenzymea:cholesterolacyltransferase1:ic50＝5.8nm(rattusnorvegicus)

ym750

分子式：c31h36n2o

casno.138046-43-2

ic50:0.18μm

geri-bp002-a

化學(xué)名稱：2,2'-methylenebis(6-tert-butyl-4-methyl-phenol)；

分子式c23h32o2

casno.119-47-1

sandoz58-035

化學(xué)名稱：

3-[decyldimethylsilyl]-n-[2-(4-methylphenyl)-1-phenethyl]propanamiide

sa58-035

分子式：c30h47nosi

casno.78934-83-5

ic50:acat1,0.3μm(rat)

vulm1457

化學(xué)名稱：

n-[2,6-bis(1-methylethyl)phenyl]-n”-[4-[(4-nitrophenyl)thio]phenyl]urea；

分子式：c25h27n3o3s

casno.228544-65-8

ctl細(xì)胞

ctl細(xì)胞即為細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte,ctl)，是一種終末分化的cd8t細(xì)胞，可以通過其tcr識(shí)別相應(yīng)抗原并對表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞或者受感染的細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

cd8t細(xì)胞

cd8t細(xì)胞即為cd8陽性t細(xì)胞。cd8(群集分化8)是作為協(xié)同受體的t細(xì)胞受體(tcr)的跨膜糖蛋白。

聯(lián)合治療藥物組合和施用方法

所述聯(lián)合治療藥物組合可以是以下形式中的任意一種：

一)將?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和達(dá)卡巴嗪分別制成獨(dú)立的制劑，制劑的劑型可相同或不同，給藥途徑亦可相同或不同。使用時(shí)，可兩種藥同時(shí)使用，也可兩種藥先后使用。先后給藥時(shí)，應(yīng)當(dāng)在先用藥物仍對機(jī)體有效的期間內(nèi)向機(jī)體施加其他藥物。

二)將?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和達(dá)卡巴嗪配置成復(fù)方制劑。在將?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和達(dá)卡巴嗪采用相同給藥途徑給藥并同時(shí)施加時(shí)，可采用將兩者配置成復(fù)方制劑的形式。

達(dá)卡巴嗪常用的用藥方法為靜脈注射、靜脈滴注或動(dòng)脈灌注。其用法用量可參考現(xiàn)有技術(shù)。

小分子化合物常用的用藥方法可以是胃腸道給藥或者是胃腸外給藥。sirna、shrna、抗體則一般采用胃腸外給藥。可以是局部給藥亦可以為全身給藥。avasimibe為已知用于治療動(dòng)脈粥樣硬化以及阿爾茨海默病的藥物，其用法用量可參考現(xiàn)有技術(shù)，其他?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑的用法用量亦可參考avasimibe。

可以同步的或順序地給予有效量的?；o酶a：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶acat1抑制劑和有效量的達(dá)卡巴嗪。在部分實(shí)施例中，酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑采用胃腸道給藥劑型，達(dá)卡巴嗪采用胃腸外給藥劑型?；蛘撸；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑及達(dá)卡巴嗪均采用胃腸外給藥劑型?；蛘撸；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑對離體的ctl細(xì)胞進(jìn)行處理，并在體外擴(kuò)大培養(yǎng)ctl細(xì)胞后回輸機(jī)體，而達(dá)卡巴嗪直接對機(jī)體采用胃腸外給藥。使用時(shí)，可兩種藥同時(shí)使用，也可兩種藥先后使用。先后給藥時(shí)，應(yīng)當(dāng)在先用藥物仍對生物體有效的期間內(nèi)向生物體施加其他藥物。

以?；o酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑為主要活性成分或主要活性成分之一制備藥物。通常，藥物中除了有效成分外，根據(jù)不同劑型的需要，還會(huì)包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。

“藥學(xué)上可接受的載體或輔料”應(yīng)當(dāng)與酰基輔酶a：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶acat1抑制劑相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或輔料的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末； 麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。這些物質(zhì)根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產(chǎn)生可接受的口感或氣味。

本發(fā)明中，除非特別說明，藥物劑型并無特別限定，可以被制成針劑、口服液、片劑、膠囊、滴丸、噴劑等劑型，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物劑型的選擇應(yīng)與給藥方式相匹配。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

1.材料和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基(dmem)、胎牛血清(fbs)購自lifetechnologies；filipiniii,mβcd,mβcd-cholesterol購自sigma；α-cd3和α-cd28購自biolegend；流式分析抗體α-mcd4(rm4-5), α-mcd8(53-6.7),α-mcd3ε(145-2c11),α-ifn-γ(xmg1.2),α-tnf-α(mp6-xt22),α-granzymeb(ngzb),α-cd44(im7),α-cd69(h1.2f3),α-pd-1(j43),α-ctla-4(uc10-4b9),α-ki67(16a8),α-foxp3(fjk-16s),α-gr1(rb6-8c5),α-cd11b(m1/70)和α-cd45(30-f11)購自ebioscience；western-blotting抗體α-pcd3ζ購自abcam,α-cd3ζ購自santacruze,α-pzap70,α-zap70,α-plat,α-lat,α-perk1/2和α-erk1/2購自cellsignaling；mts檢測試劑盒購自promega；avasimibe購自selleck；k604由中科院上海藥物研究所合成；cp113,818由pierrefabre提供；b16f10細(xì)胞系和llc(lewislungcarcinoma)細(xì)胞系最初來源于atcc,由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

c57bl/6小鼠購自slac；ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠來自jackson實(shí)驗(yàn)室；cd4^cre轉(zhuǎn)基因小鼠由中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所劉小龍研究組提供(jaxmice亦有該小鼠提供)；acat1^flox/flox來自ingeneiouslabs，該試驗(yàn)動(dòng)物在acat1基因的14號(hào)外顯子毗鄰的兩個(gè)內(nèi)含子上分別有一個(gè)loxp位點(diǎn)，該外顯子編碼有his460位點(diǎn)，該位點(diǎn)是acat1的酶活所必需的，acat1^flox/flox可采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)中所有的動(dòng)物都飼養(yǎng)在spf設(shè)施中。

3.t細(xì)胞分離，培養(yǎng)和流式檢測

t細(xì)胞來自小鼠脾臟和淋巴結(jié)，通過cd8或者cd4陰性篩選磁珠(stemcell)進(jìn)行分離得到。對于腫瘤浸潤t細(xì)胞的分離，小鼠在注射腫瘤后14-18天，將腫瘤取出，剪成1-2mm碎片，膠原酶iv(sigma)消化1小時(shí)，然后通過40–70％percoll(ge)密度梯度離心得到腫瘤浸潤白細(xì)胞群。為進(jìn)一步得到腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞，進(jìn)一步用cd8陽性磁珠分選試劑盒(stemcell)進(jìn)行分離。

分離得到的細(xì)胞用含50μmβ-巰基乙醇的rpmi1640完全培養(yǎng)基在37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。為進(jìn)一步分析t細(xì)胞的功能表型，針對細(xì)胞表面標(biāo)志物如cd8,cd44,cd69，細(xì)胞離心后直接用percp-α-cd8，fitc-α-cd44，pe-α-cd69進(jìn)行染色，然后流式檢測；而針對胞內(nèi)顆粒酶和細(xì)胞因子的檢測，分離到的細(xì)胞繼續(xù)用1μmionomycin和50ng/mlpma刺激培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，在培養(yǎng)過程中加入5μg/mlbfa，以阻斷顆粒酶和細(xì)胞因子向胞外分泌。刺激結(jié)束后，4％多聚甲醛(pfa)室溫固定10分鐘，然后胞內(nèi)染色檢測胞內(nèi)顆粒酶和細(xì)胞因子的水平。

4.膽固醇定量

a.filipin染色和激光共聚焦成像技術(shù)對細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇進(jìn)行相對定量

filipiniii溶于甲醇中至5mg/ml。t細(xì)胞用4％pfa固定，然后用50μg/mlfilipiniii于4℃染色30分鐘，然后pbs洗5次以去除游離filipin。成像圖片由leicasp8激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)獲取，相對定量結(jié)果由leicalasaf軟件分析得到。

b.基于膽固醇氧化的膽固醇定量方法

細(xì)胞經(jīng)0.1％戊二醛固定15分鐘后，pbs洗3次，然后用2u/ml膽固醇氧化酶室溫處理15分鐘以氧化細(xì)胞質(zhì)膜上游離膽固醇；氧化反應(yīng)結(jié)束后pbs洗3次以去除殘留的膽固醇氧化酶，細(xì)胞內(nèi)未被氧化的游離膽固醇用甲醇/氯仿(v:v＝1:2)提取，然后用amplexredcholesterol檢測試劑盒(lifetechnology)對游離膽固醇進(jìn)行定量。細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇的含量由未被氧化酶處理的樣品膽固醇含量減去氧化酶處理過的樣品膽固醇含量得到。

5.ova抗原激活ot-icd8t細(xì)胞

將c57bl/6小鼠脾臟細(xì)胞中的t細(xì)胞用t細(xì)胞陽性磁珠分選試劑盒(miltenyibiotech)去除，然后分別遞呈ova抗原ova257-264(siinfekl，簡稱n4)，及突變體sainfekl(簡稱a2)，siitfekl(簡稱t4)，siigfekl(簡稱g4)以及自身抗原rtytyekl(簡稱catnb)和陽性選擇抗原siirfekl(簡稱r4)作為抗原遞呈細(xì)胞(apc)。具體的，為分別將ova抗原ova257-264，a2，t4，g4，r4和自身抗原catnb與前述處理后的小鼠脾臟細(xì)胞一起在37℃孵育以得到抗原呈遞細(xì)胞，同時(shí)；將陰性磁珠分選得到的ot-icd8t細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞共同培養(yǎng)(1：5)24小時(shí)，在培養(yǎng)的最后4小時(shí)加入5μg/mlbfa(是布雷菲德菌素a)，以阻止細(xì)胞因子向胞外分泌，最后通過胞內(nèi)染色和流式檢測細(xì)胞因子的表達(dá)。

6.檢測cd8t細(xì)胞(ctl)的細(xì)胞殺傷能力。

分離ot-i轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后用5nmova257-264(n4)刺激，并在培養(yǎng)基中加入10ng/mlil-2，3天后換液補(bǔ)加il-2并繼續(xù)培養(yǎng)2天得到分化成熟的殺傷性cd8t細(xì)胞(ctl)。將el-4小鼠淋巴瘤細(xì)胞分別與2nm抗原肽ova257-264及其突變體a2，t4，g4，r4和自身抗原catnb在37℃孵育30分鐘以遞呈相關(guān)抗原，pbs洗3次后將遞呈抗原的el-4細(xì)胞和ctl重懸在無酚紅rpmi1640培養(yǎng)基(含2％fbs)中，然后以1：1，1：2，1：5比例混合(el-4細(xì)胞數(shù)量為1×10⁵)加入96孔板中，200g離心2分鐘。37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，200g離心5分鐘，取培養(yǎng)上清液，通過cytotox96non-radioactivecytotoxicity試劑盒(promega)檢測培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶ldh的釋放以計(jì)算ctl對靶細(xì)胞的殺傷效率。

7.小鼠b16黑色素瘤模型

b16f10黑色素瘤細(xì)胞用胰酶消化后，pbs洗3次后過40μm濾網(wǎng)，計(jì)數(shù)用pbs稀釋至2×10⁶/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左側(cè)(100μl體積)，從第10天開始，游標(biāo)卡尺 測量腫瘤大小，每兩天測一次，腫瘤大?。介L度×寬度。當(dāng)腫瘤其最長軸超過20mm時(shí)，將小鼠安樂死，并記錄死亡時(shí)間點(diǎn)。

8.小鼠黑色素瘤t細(xì)胞過繼治療

表達(dá)雞卵清蛋白o(hù)valbumin的b16f10-ova黑色素瘤細(xì)胞(ref)(可參考文獻(xiàn)：yangjetal.,kuper-typeimmunologicalsynapsecharacteristicsdonotpredictanti-braintumorcytolytict-cellfunctioninvivo.procnatlacadsciusa.2010.197(10):4716-21；獲zhoupetal.,invivodiscoveryofimmunotherapytargetsinthetumourmicroenvironment.nature.2014,506(7486):52-7獲得)用胰酶消化后，pbs洗3次后過40μm濾網(wǎng)，計(jì)數(shù)用pbs稀釋至2×10⁶/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左側(cè)(100μl)。在注射腫瘤細(xì)胞后第10天，將成瘤且腫瘤大小一致的小鼠隨機(jī)分成3組，以尾靜脈注射(i.v.)的方式分別注射200ulpbs，野生型ot-ictl和acat1基因敲除的ot-ictl(1.5×10⁶)，3天后開始測量腫瘤大小，每兩天測一次。當(dāng)腫瘤其最長軸超過20mm時(shí)，將小鼠安樂死，并記錄死亡時(shí)間點(diǎn)。

acat1基因敲除的ot-i小鼠的獲得：cd4^cre小鼠與acat1^flox/flox小鼠交配獲得cd4^cre-acat1^flox/flox,然后與otitcr轉(zhuǎn)基因小鼠交配，最終獲得ot-i-cd4^cre-acat1^flox/flox小鼠和相應(yīng)的對照小鼠ot-i-^e-acat1^flox/flox小鼠。

ctl的誘導(dǎo)方法是：取野生型或acat1基因敲除的oti小鼠脾臟，分別用10nm的ova257-264(n4)肽段刺激，并提供10ng/mlil-2，刺激2天后，在第3天換無n4肽段的培養(yǎng)基(含10ng/mlil-2)繼續(xù)培養(yǎng)2天即可獲得成熟的ctl。

9.小鼠llc肺癌模型

llc(lewislungcarcinoma)肺癌細(xì)胞用胰酶消化后，pbs洗3次后過40μm濾網(wǎng)，計(jì)數(shù)用pbs稀釋至10⁷/ml，然后尾靜脈注射(i.v.)到8-10周雄鼠體內(nèi)(200μl體積)。在注射腫瘤細(xì)胞后第11天，將荷瘤小鼠隨機(jī)分成2組，以腹腔注射(i.p.)的方式給小鼠注射avasimibe，劑量為15mg/kg，3天注射一次，連續(xù)給藥9次。在注射腫瘤細(xì)胞后7周，取部分小鼠的肺臟，對腫瘤斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以評估腫瘤治療效果，同時(shí)記錄剩余小鼠的死亡時(shí)間點(diǎn)。

10.超高分辨率隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡storm(super-resolutionstochasticalopticalreconstructionmicroscopy)檢測細(xì)胞質(zhì)膜上tcr(抗原受體)的分布。

超高分辨率隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡storm成像在nikonn-storm成像系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)配有eclipseti-e電動(dòng)相差顯微鏡，apochromat100倍tirf油鏡和emccd。熒光染料選用alexa647，通過647nm連續(xù)可見光激光器(200mw)和450nm二極管激光器激發(fā)熒光染料。成像時(shí)tirf角度參數(shù)在3900-4000，以保證樣品成像深度在1μm左右。cd8t細(xì)胞和激 活的cd8t細(xì)胞(10μg/mlα-cd3抗體37℃刺激10分鐘)通過多聚賴氨酸貼在ibidi35mmμ-dish上，然后4％pfa固定；pbs洗3次后用2μg/mlalexa647-α-cd34℃標(biāo)記2小時(shí)。成像前，將pbs替換成成像緩沖液(tbs，含100mmmea)。成像速度保持在90-95幀/秒，重構(gòu)的圖像用niselementsar獲取，圖像信息由20,000-25,000幀圖片組成。

為了分析tcr在質(zhì)膜上的成簇情況，對圖片中tcr微簇的位置信息用ripley’skfunction和matlab分析，l(r)-r值代表在一定半徑(r)內(nèi)分子聚集的概率，而l(r)-r最大值對應(yīng)的r即分析選定區(qū)域內(nèi)tcr微簇的半徑。

11.全內(nèi)反射熒光顯微成像tirfm(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy，)方法動(dòng)態(tài)檢測t細(xì)胞免疫突觸形成過程。

dopc(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)與生物素標(biāo)記的dope(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-cap-biotin)以25:1的摩爾比混合，超聲形成脂質(zhì)體。使用no.1.5h厚度玻璃底的細(xì)胞培養(yǎng)皿，食人魚酸液處理玻璃底表面并用雙蒸水清洗干凈。用濃度0.1mm的生物素標(biāo)記的脂質(zhì)體孵育玻片20分鐘。pbs充分清洗后，用鏈霉親和素(streptavidin)孵育30分鐘。pbs充分清洗后，用生物素標(biāo)記的小鼠cd3ε抗體(bionylatedα-mcd3ε,145-2c11)孵育30分鐘。pbs充分清洗后，用1％酪蛋白封閉20分鐘。pbs充分清洗，平面脂雙分子層準(zhǔn)備完畢。

α-mtcrβ抗體(biolegend)進(jìn)行熒光染料標(biāo)記(alexafluor568nhsester，lifetechnologies),經(jīng)脫鹽柱脫鹽后使用papain蛋白酶酶切(piercefabmicropreparationkit,thermoscientific),最后經(jīng)proteina柱分離(proteinaplusspincolumn,thermoscientific)得到alexa568-α-mtcrβ-fab。

新鮮分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞用alexa568-α-mtcrβ-fab和fitc-α-mcd8a(ebioscience)冰上染色，pbs清洗2次。重懸的細(xì)胞加入如上所述的鋪有平面脂雙分子層的培養(yǎng)皿，置于37℃加熱臺(tái)，以3秒每幀的速度拍攝，進(jìn)行活細(xì)胞全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像?；蛘咧貞业募?xì)胞加入上文所述鋪有平面脂雙分子層的培養(yǎng)皿，置于37℃培養(yǎng)箱，刺激一定時(shí)間后用4％pfa固定，全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像。fitc陽性的cd8t細(xì)胞用imageproplussoftware(mediacybernetics)、imagej(nih)和matlab(mathworks)軟件經(jīng)行數(shù)據(jù)分析。

12.mts方法檢測腫瘤細(xì)胞活率。

b16f10細(xì)胞(5×10³)重懸于100μl含有1μmavasimibe或dmso對照的培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)24、48、或72小時(shí)。加入20μlmts試劑(promega)，孵育1-3小時(shí)后，測量490nm吸光度。 490nm處的吸光值與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。avasimibe對細(xì)胞活性的影響通過以dmso處理的細(xì)胞為對照組進(jìn)行歸一化處理得到，設(shè)定dmso處理組的細(xì)胞活性為1。

13.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

除在圖釋中特別注明外，本文所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)都是用graphpadprism(graphpadsoftware,inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法采用two-tailedunpairedstudent’st-test；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns：無顯著差異(nosignificantdifference)。

14.t細(xì)胞特異性敲除acat1小鼠的構(gòu)建及acat1^ckocd8t、acat1^ckocd4t細(xì)胞的獲得

將acat1^flox/flox小鼠與cd4^cre小鼠交配，獲得的小鼠經(jīng)pcr及westernblot檢測表達(dá)量驗(yàn)證為t細(xì)胞特異性敲除acat1小鼠(cd4^cre-acat1^flox/flox,簡稱acat1^cko)。

acat1^ckocd8t細(xì)胞的獲得：采用cd8磁珠分選得到(分選試劑盒來自stemcell)

acat1^ckocd4t細(xì)胞的獲得：采用cd4磁珠分選得到(分選試劑盒來自stemcell)

15.cd8t細(xì)胞活化方法

通過磁珠分選得到的新鮮t細(xì)胞，重懸于rpmi1640完全培養(yǎng)基中，α-cd3(5μg/ml)和α-cd28(5μg/ml)鋪板刺激,37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激24小時(shí),為進(jìn)一步用胞內(nèi)染色-流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子的表達(dá)，在最后4小時(shí)補(bǔ)加5mg/mlbrefeldina以阻斷細(xì)胞因子向細(xì)胞外分泌。

實(shí)施例1acat1基因敲除不會(huì)引發(fā)cd8t細(xì)胞對自身抗原產(chǎn)生反應(yīng)和自身免疫

本實(shí)施例的目的是為了研究去除acat1功能后cd8t細(xì)胞獲得增強(qiáng)的效應(yīng)功能是否會(huì)使得cd8t細(xì)胞對自身抗原產(chǎn)生反應(yīng)從而誘發(fā)自身免疫病。為了研究這一點(diǎn)，將acat1^cko小鼠進(jìn)一步與ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠(jaxmice)進(jìn)行交配，獲得ot-i背景的acat1特異性基因敲除小鼠(ot-iacat1^cko)和相應(yīng)的對照小鼠(ot-i)。ot-i轉(zhuǎn)基因小鼠的絕大部分t細(xì)胞為ot-icd8t細(xì)胞，其tcr特異性識(shí)別h2k^b遞呈的ovalbumin(ova257-264)抗原(簡稱n4)，并產(chǎn)生相應(yīng)的cd8t細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；同時(shí)ot-itcr除了識(shí)別其野生型抗原(n4)外，也可識(shí)別一系列的ova突變體(a2,t4,g4,r4)，并產(chǎn)生相應(yīng)的強(qiáng)弱免疫應(yīng)答反應(yīng)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，acat1缺陷除了能促進(jìn)ot-icd8t細(xì)胞對強(qiáng)弱抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，具體表現(xiàn)為細(xì)胞因子ifnγ的分泌量增加以及對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)(圖1a,b)。但是acat1缺陷不會(huì)引起ot-icd8t細(xì)胞對自身抗原catnb(β-catenin片段，可以被h2k^b呈遞)以及類自身抗原r4產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這個(gè)結(jié)果表明acat1基因敲除不影響t細(xì)胞對抗原親和力(affinity)識(shí)別能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證acat1基因敲除后小鼠自身免疫情況，用elisa方法檢測了小鼠血 清中細(xì)胞因子ifnγ和自身抗體抗雙鏈dna抗體。結(jié)果顯示，與對照小鼠相比，這兩項(xiàng)指標(biāo)沒有任何改變(圖1c)，表明acat1基因敲除并不引起自身免疫反應(yīng)，進(jìn)一步表明acat1作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的安全性。

實(shí)施例2利用三種黑色素瘤模型研究acat1基因敲除促進(jìn)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤活性

免疫治療是當(dāng)前治療腫瘤的熱點(diǎn)，而cd8t細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力直接關(guān)系到腫瘤免疫治療的效果。為了驗(yàn)證acat1敲除對cd8t細(xì)胞的抗腫瘤能力的影響，本實(shí)施例首先建立了皮下黑色素瘤模型，在acat1^cko小鼠和野生型小鼠中皮下注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)黑色素瘤，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)acat1^cko小鼠黑色素瘤的進(jìn)程被顯著延緩，表現(xiàn)為腫瘤生長更慢，小鼠的生存率和生存期更長(圖2.a,b)。對荷瘤小鼠的t細(xì)胞的表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在acat1^cko小鼠中，腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞活性更強(qiáng)，表現(xiàn)為acat1^cko小鼠腫瘤浸潤cd8t細(xì)胞中，cd44高表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞更多，表達(dá)顆粒酶b和細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的比例也更高；而且acat1^cko小鼠腫瘤浸潤cd8t細(xì)胞的數(shù)量、cd8/cd4細(xì)胞的比例也要高于野生型、細(xì)胞增殖的標(biāo)志物ki-67的表達(dá)水平也更高(圖2.c,d)。免疫檢測點(diǎn)受體如pd-1和ctla-4目前是腫瘤免疫治療的熱門靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)也檢測了腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞表面pd-1和ctla-4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在acat1^cko和野生型小鼠中沒有明顯差異(圖2.e)；同時(shí)實(shí)驗(yàn)也檢測了腫瘤中cd4t細(xì)胞中treg細(xì)胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例,發(fā)現(xiàn)acat1敲除并不改變treg細(xì)胞在cd4t細(xì)胞中的比例(圖2.f)。以上結(jié)果表明acat1敲除使cd8t細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)功能增強(qiáng)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證cd8t細(xì)胞在該腫瘤模型中的應(yīng)答反應(yīng)受acat1的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)在皮下注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞后第7天，將acat1^cko和野生型小鼠的引流淋巴結(jié)(draininglymphnode)取出，分析其中t細(xì)胞的表型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)acat1^cko小鼠引流淋巴結(jié)中的cd8t細(xì)胞cd44水平和細(xì)胞因子ifnγ的表達(dá)上升(圖2.g)，而且cd8t細(xì)胞的數(shù)量以及cd8/cd4的比率也顯著升高(圖2.h)，表明acat1缺陷促進(jìn)cd8t細(xì)胞的初始免疫應(yīng)答反應(yīng)。

相比較與皮下實(shí)體瘤，轉(zhuǎn)移型腫瘤的進(jìn)程更為復(fù)雜，其治療更為艱難。為進(jìn)一步檢測acat1缺陷是否影響cd8t細(xì)胞對轉(zhuǎn)移瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)建立了黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，向acat1^cko和野生型小鼠尾靜脈注射b16f10黑色素瘤細(xì)胞，然后檢測肺臟中黑色素瘤的發(fā)展進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在acat1^cko小鼠中，與野生型對照小鼠相比，其肺臟腫瘤數(shù)量明顯減少，而且小鼠的生存率和生存期更長(圖2.i-k)。通過蘇木精-伊紅(h&e)對肺臟組織進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)acat1基因敲除后，黑色素瘤在肺臟中的浸潤明顯減弱(圖2.l)。對肺臟t 細(xì)胞的表型進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)acat1^cko小鼠cd8t細(xì)胞中cd44高表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞更多，表達(dá)顆粒酶b和細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的比例也更高(圖2.m)。這些結(jié)果表明acat1缺陷增強(qiáng)cd8t細(xì)胞在非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移型腫瘤中的抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)。

由于acat1^cko小鼠中所有的t細(xì)胞都缺失acat1，為了驗(yàn)證acat1基因敲除是對腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞而非cd4t細(xì)胞的功能的影響而獲得更強(qiáng)抗腫瘤作用，在野生型c57小鼠皮下注射b16f10-ova黑色素瘤細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)ovalbumin，可以被黑色素瘤細(xì)胞的h2kb遞呈在細(xì)胞表面，從而被ot-icd8t細(xì)胞識(shí)別。在野生型小鼠成功誘導(dǎo)黑色素瘤后，在注射腫瘤后第10天以尾靜脈注射的方式，將來自acat1^cko小鼠和野生型小鼠的ot-ictl注射到荷瘤野生型小鼠體內(nèi)，然后監(jiān)測腫瘤生長并記錄小鼠的生存情況(圖2.n)，結(jié)果表明，注射了acat1^ckoot-ictl的實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長比注射了野生型ot-ictl的對照組更慢，而且小鼠的生存時(shí)間更長(圖2.o,p)，進(jìn)一步表明acat1特異性敲除的cd8t細(xì)胞有更好的抗腫瘤作用。

實(shí)施例3acat抑制劑avasimibe增強(qiáng)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤功能。

本實(shí)施例目的是進(jìn)一步驗(yàn)證acat1抑制劑在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。acat1作為用作治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)，目前已有一系列小分子藥物在進(jìn)行動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)。avasimibe是其中一種，目前多次臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了avasimibe在的安全性。因此選用avasimibe，驗(yàn)證acat1作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的可能性。體外實(shí)驗(yàn)表明，avasimibe與其他acat抑制劑如cp113,818和k604一樣，可以促進(jìn)cd8t細(xì)胞顆粒酶b的釋放和細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)(圖3.a)。體外殺傷實(shí)驗(yàn)也表明avasimibe增強(qiáng)ctl的靶細(xì)胞殺傷能力，且呈劑量效應(yīng)(圖3.b)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在小鼠黑色素瘤模型中驗(yàn)證avasimibe的作用，通過對黑色素瘤荷瘤野生型小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥(15mg/kg)處理，與對照小鼠相比，avasimibe給藥的小鼠腫瘤生長減慢，小鼠的生存時(shí)間也顯著延長(圖3.d-f)。為了驗(yàn)證avasimibe不是通過直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長，在體外實(shí)驗(yàn)中用avasimibe處理b16f10黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)avasimibe處理不影響b16f10細(xì)胞的活性(圖3.c)。對小鼠腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，avasimibe給藥的小鼠中：其腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞活性更高，表現(xiàn)為cd8t細(xì)胞表面活化標(biāo)記cd44的表達(dá)比例更高，而且表達(dá)顆粒酶b，細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的細(xì)胞比例也更高。對小鼠腫瘤浸潤的t細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)avasimibe給藥組的腫瘤浸潤cd8t細(xì)胞數(shù)量更多，且cd8/cd4比率更高。另外avasimibe給藥組腫瘤浸潤cd8t細(xì)胞中的細(xì)胞增殖標(biāo)記物ki-67的表達(dá)水平也更高(圖3.g-h)。考慮到腫瘤微環(huán)境的免疫抑制效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)也檢測了cd8t細(xì) 胞上的免疫抑制受體pd-1和ctla-4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)avasimibe給藥并未改變這些免疫檢測點(diǎn)受體的表達(dá)(圖3.i)。

腫瘤微環(huán)境中還存在有一些抑制型的免疫細(xì)胞如treg(regulatorytcell)和mdsc(myeloid-derivedsuppressorcell)，這些細(xì)胞通過抑制cd8t細(xì)胞等腫瘤殺傷細(xì)胞的活性，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵的作用。因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了腫瘤組織中treg和mdsc的比例，avasimibe給藥后，treg(cd4⁺foxp3⁺)細(xì)胞在cd4t細(xì)胞中的比例沒有明顯改變，而mdsc(gr1⁺cd11b⁺cd45⁺)在cd45⁺免疫細(xì)胞中的比例有較輕微的降低(圖3.j，k)，考慮到avasimibe給藥組的腫瘤組織中cd8t細(xì)胞的數(shù)量明顯上升，mdsc在cd45⁺細(xì)胞中的比例降低可能是由于cd8t細(xì)胞在cd45⁺細(xì)胞中的比例上升所致(圖3.h)。這些證據(jù)表明，acat抑制劑avasimibe可以通過特異性上調(diào)cd8t細(xì)胞殺傷性效應(yīng)而在腫瘤治療中起作用。

實(shí)施例4avasimibe通過抑制acat1促進(jìn)cd8t細(xì)胞的抗腫瘤活性

本實(shí)施例的目的是驗(yàn)證avasimibe是否是通過抑制acat1發(fā)揮其腫瘤免疫能力。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，在體外用avasimibe對cd8t細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測其細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平的變化。通過filipiniii對細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)avasimibe處理后，cd8t細(xì)胞質(zhì)膜游離膽固醇水平明顯上升(圖4.a,b)。通過storm對cd8t細(xì)胞表面tcr的定位進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，avasimibe處理促進(jìn)tcr微簇的形成(圖4.c-e)；通過tirfm對t細(xì)胞活化過程中免疫突觸的形成進(jìn)行分析，也表明avasimibe處理促進(jìn)cd8t細(xì)胞免疫突觸的形成(圖4.f,g)。進(jìn)一步通過western-blotting方法檢測avasimibe處理后tcr信號(hào)通路的活化情況，結(jié)果也表明avasimibe處理增強(qiáng)tcr信號(hào)通路的活化(圖4.h)。這些結(jié)果與acat1敲除的cd8t細(xì)胞的表現(xiàn)一致。同時(shí)，為進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證該機(jī)制，實(shí)驗(yàn)從avasimibe給藥的荷瘤小鼠的腫瘤中分離腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞，通過storm對腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞上tcr的分布進(jìn)行成像分析，發(fā)現(xiàn)avasimibe處理(于rpmi1640完全培養(yǎng)基中加藥后，37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理6小時(shí)，處理完之后用培養(yǎng)基或pbs離心清洗3次)后，腫瘤浸潤的cd8t細(xì)胞表面tcr微簇更大(圖4.i-k)。這些證據(jù)表明avasimibe確實(shí)是通過抑制acat1促進(jìn)cd8t細(xì)胞的活化，從而增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

實(shí)施例5avasimibe在小鼠肺癌模型中的功效

本實(shí)施例的目的為進(jìn)一步驗(yàn)證acat1作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的有效性。實(shí)驗(yàn)建立了小鼠llc(lewislungcarcinoma)肺癌模型，檢測llc在野生型小鼠和acat1基因敲除小鼠中 肺癌發(fā)展進(jìn)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)t細(xì)胞中acat1基因敲除顯著抑制腫瘤的生長，荷瘤小鼠的生存期也明顯長于對照的野生型小鼠(圖5.a-c)。為了驗(yàn)證acat1抑制劑avasimibe對llc肺癌的治療效果，進(jìn)一步對造模成功的小鼠進(jìn)行avasimibe給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)avasimibe在治療小鼠肺癌上也有一定的療效，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞數(shù)量較對照組少，小鼠的生存時(shí)間延長(圖5.d-g)。

實(shí)施例6.acat抑制劑增強(qiáng)人pbmc中cd8⁺t細(xì)胞的效應(yīng)功能

本試驗(yàn)的目的是驗(yàn)證acat1作為藥物靶點(diǎn)在臨床上使用的潛在價(jià)值，在人cd8t細(xì)胞中分別用acat抑制劑avasimibe和cp113,818抑制acat的活性，然后通過抗體交聯(lián)的方式激活cd8t細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測cd8t細(xì)胞細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)。

試驗(yàn)方法：通過ficoll從健康志愿者體內(nèi)獲得的外周血中分離pbmc，然后用5μg/mlpha刺激獲得cd8⁺殺傷性t細(xì)胞。3天后換成不含pha的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以降低本底信號(hào)。再使用相應(yīng)濃度的avasimibe或cp113,818孵育處理12小時(shí)，細(xì)胞換液并通過鋪板刺激的方式用5μg/mlα-cd3+5μg/mlα-cd28抗體刺激24小時(shí)，在最后4小時(shí)加入5μg/mlbrefeldina以阻斷細(xì)胞因子的分泌，最后通過胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測cd8⁺t細(xì)胞中細(xì)胞因子ifnγ和tnfα的表達(dá)。雙尾非配對t-test用于差異顯著性分析。

試驗(yàn)結(jié)果：acat抑制劑cp113,818和avasimibe均能促進(jìn)cd8t細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)，且具劑量效應(yīng)，表明acat1作為增強(qiáng)cd8t細(xì)胞效應(yīng)功能的靶點(diǎn)同樣適用于人的cd8t細(xì)胞(圖6)。

實(shí)施例7avasimibe與dacarbazine(達(dá)卡巴嗪)聯(lián)合治療小鼠黑色素瘤的功效

本實(shí)施例的目的是為了驗(yàn)證acat1作為免疫治療靶點(diǎn)在與化療藥聯(lián)合用藥中的效果。化療是目前治療腫瘤的有效手段之一，dacarbazine(達(dá)卡巴嗪)是目前fda批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移型黑色素瘤的化療藥。本實(shí)施例在小鼠黑色素瘤模型中，給小鼠dacarbazine和avasimibe聯(lián)合用藥，結(jié)果表明顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長，而聯(lián)合用藥明顯增強(qiáng)avasimibe的抗腫瘤效果(圖7)。

試驗(yàn)動(dòng)物分成4組，每組9-13只，具體見圖7b,c，n值即小鼠數(shù)量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，組之間的差異顯著性即p值見圖7b,c。

以上的實(shí)施例是為了說明本發(fā)明公開的實(shí)施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前 提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實(shí)施例。事實(shí)上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。