技術領域
本發(fā)明涉及獸用藥技術領域，具體涉及一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑及其制備方法和應用。
背景技術：
奶牛乳腺炎是由物理、化學或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應，其中多種病原微生物的感染是引起奶牛乳腺炎的主要病因。抗生素是奶牛乳腺炎首選治療藥物，但存在單一藥物抗菌譜不夠廣、耐藥性、藥物殘留蓄積、腸道菌群失調的問題。從根本上講，抗生素治療失敗的原因主要歸于奶牛乳腺特殊生理結構形成的藥理學和藥動學機制。另外，采用抗生素治療選擇的是單純抗菌的思路，只重視了對微生物的殺滅，而未重視作為乳腺炎過程中矛盾的另一方面，即奶牛本身的炎癥反應和炎癥引起的免疫力下降的問題。
中獸醫(yī)稱乳房炎為乳癰，多是陽明經(jīng)實熱、厥陰肝經(jīng)淤滯和沖任二脈失調，使乳房脈絡不暢，乳汁積滯發(fā)熱腐敗而造成的炎性反應。中獸醫(yī)理論認為，乳房炎的防治應著眼于肝胃，應疏肝氣、散郁結、清胃熱、消腫毒、通脈絡。中草藥治療奶牛乳房炎，可避免產生耐藥菌株和乳中殘留抗生素，當前對于中藥防治乳房炎的研究，重點是單味藥物和復方藥物對乳房炎的臨床療效。
鑒于奶牛乳腺炎發(fā)病初期，以微生物感染為主要矛盾，而隨著疾病的發(fā)展，乳腺內炎癥反應加強、感染受到控制，主要矛盾轉變?yōu)檠装Y引發(fā)的免疫力低下，抗病力減弱。因此，乳腺免疫系統(tǒng)對臨床型乳腺炎的進程有重要影響，提高免疫系統(tǒng)對炎區(qū)組織修復也有著根本意義，應改變原有的單純抗菌的思路，把控制炎癥反應本身、改善免疫系統(tǒng)作為治療的要點之一。中藥屬于天然藥物，具有抗菌消炎、不易使致病菌產生耐藥性和增強機體免疫機能，提高動物抗應激、抗疾病能力，改善動物生產性能等多種功效，能克服大量使用抗生素帶來的弊端。中藥具有標本兼治的作用，它可直接抑制或殺滅乳腺炎的病原菌，或通過提高機體的免疫力而抑制或殺滅病原菌，在治療奶牛乳腺炎方面具有巨大的潛力。
特異性卵黃抗體IgY 是一種良好的免疫球蛋白資源，無污染，無殘留，具有高度的穩(wěn)定性，對熱、酸、堿具有較強的耐受性，可以針對不同抗原制備特異性抗體，專一性抑制殺滅病原體，近年來受到了國內外學者的高度關注。研究表明，口服特異性卵黃抗體IgY 可成功用于防治動物和人類因細菌、病毒感染引起的消化道疾病，如幽門螺桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、輪狀病毒等引起的胃腸道感染，其效果呈劑量依賴性?？诜禺愋月腰S抗體IgY 在遠離腸道部位的乳腺亦能夠有效抑制細菌的生長，國外Coleman(1996)用抗無乳鏈球菌和抗金黃色葡萄球菌的IgY 抗體給泌乳期奶牛服用，結果牛奶的SCC 值很快降低，乳腺炎病情得到控制。針對上述問題，本發(fā)明將根據(jù)獸藥類非抗生素生物制劑的發(fā)展方向，在中獸醫(yī)理論的基礎上，以散瘀止痛、退毒下膿、涼血消腫、抗菌消炎為原則，提供一種具有提高奶牛免疫力及抗病力的中藥組合物，從根本達到標本兼治、祛邪固本的治療功效。此外，利用產蛋雞受到外來抗原（奶牛乳腺炎4種主要致病菌）的刺激會產業(yè)免疫應答，并生成相應抗體且抗體主要累計于卵黃這一特點，以產蛋雞為生物轉換器，大量、連續(xù)的生產抗奶牛乳腺炎主要致病菌的特異性卵黃免疫球蛋白IgY（Dominate pathogens of bovine mastitis，抗DP-BM-IgY）。制備的特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體可通過被動免疫途徑防治奶牛乳腺炎，定向殺滅多種奶牛乳腺炎致病菌，尤其是抗生素無法有效殺滅的L-型耐藥變種菌及其他耐藥菌，而對奶牛乳房內的有益菌無影響。因此，抗DP-BM-IgY卵黃抗體有助于提高奶牛對乳腺炎主要致病菌的抗性，對奶牛多種類型的乳腺炎都有明顯療效，愈后奶牛乳腺炎不再復發(fā)，并以其性質穩(wěn)定、特異性強、無殘留、無抗藥性而倍受關注。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了一種能夠有效防治奶牛臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎的藥物注入劑及其制備方法和應用，在兼具退毒下膿、提高奶牛免疫力及抗病能力的同時，還具有特異性防治奶牛乳腺炎主要致病菌如鏈球菌、葡萄球菌、G—桿菌的作用。在預防及治療奶牛乳腺疾病方面具有療效顯著、無毒副作用、不產生耐藥性、不易復發(fā)的優(yōu)勢。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為：一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述藥物注入劑包含有特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體和中藥組合物提取液，為乳房注入劑。
進一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述藥物注入劑中，按照體積百分比計特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體：中藥組合物提取液為（5%-15%）：（10%-25%）。
進一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述藥物注入劑中，按照體積百分比計特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體：中藥組合物提取液為10%：20%。
進一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述中藥組合物由按照重量份計的以下原料藥組成：漏蘆5-15 份，蒲公英5-15份，紫花地丁5-15 份，連翹5-20 份，地榆5-15 份，瓜蔞5-15 份，當歸5-10 份，黃芪10-20 份。
進一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述中藥組合物由按照重量份計的以下原料藥組成：漏蘆6 份，蒲公英10份，紫花地丁10 份，連翹12份，地榆8 份，瓜蔞10 份，當歸7 份，黃芪15份。
進一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體的制備方法包括以下步驟：
a）選取制備多價菌體蛋白抗原的主要致病菌，無乳鏈球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黃色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大腸桿菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源），鑒定得到純種，分別在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物中進行體外擴大培養(yǎng)，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物為加有體積百分比5-10 %犢牛血清、質量體積百分比1-2 %葡萄糖的LB 營養(yǎng)肉湯；將培養(yǎng)好的菌液離心濃縮，采用細菌裂解液結合超聲細胞破碎方法，分別制備單一抗原，單一抗原進行等濃度組合即得所需的復合抗原；將制備的復合菌體蛋白抗原加入與等量的弗氏完全佐劑混合，充分乳化制得抗原免疫物；采用多次交替的免疫程序，通過肌肉、皮下多點注射式途徑，免疫接種具有高免應答能力的180日齡健康產蛋雞，首免后，收集免疫雞產下的蛋為樣品，即高免雞蛋，備用；
b）采用水稀釋法-冷凍法-聚乙二醇沉淀法分離提純抗DP-BM-IgY，將分離出的卵黃用7-9倍體積磷酸緩沖液稀釋，pH 值調至5.2，經(jīng)冷凍、解凍、離心去除脂肪沉淀，收集的上清液經(jīng)4 %、12 %的PEG-6000分別去除卵黃磷脂及蛋白沉淀，高速冷凍離心獲得特異性抗DP-BM-IgY 卵黃抗體液，將其濃度調節(jié)到50 mg/mL，在無菌條件下采用微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存，備用。
本發(fā)明的第二個目的是提供了上述一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑的制備方法，包括以下步驟：
1）特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體的制備方法：
a）選取制備多價菌體蛋白抗原的主要致病菌，無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，鑒定得到純種，分別在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物中進行體外擴大培養(yǎng)，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物為加有體積百分比5-10 %犢牛血清、質量體積百分比1-2 %葡萄糖的LB 營養(yǎng)肉湯；將培養(yǎng)好的菌液離心濃縮，采用細菌裂解液結合超聲細胞破碎方法，分別制備單一抗原，單一抗原進行等濃度組合即得所需的復合抗原；將制備的復合菌體蛋白抗原加入與等量的弗氏完全佐劑混合，充分乳化制得抗原免疫物；采用多次交替的免疫程序，通過肌肉、皮下多點注射式途徑，免疫接種具有高免應答能力的180日齡健康產蛋雞，首免后，收集免疫雞產下的蛋為樣品，即高免雞蛋，備用；
b）采用水稀釋法-冷凍法-聚乙二醇沉淀法分離提純抗DP-BM-IgY，將分離出的卵黃用7-9倍體積磷酸緩沖液稀釋，pH 值調至5.2，經(jīng)冷凍、解凍、離心去除脂肪沉淀，收集的上清液經(jīng)4 %、12 %的PEG-6000分別去除卵黃磷脂及蛋白沉淀，高速冷凍離心獲得特異性抗DP-BM-IgY 卵黃抗體液，將其濃度調節(jié)到50 mg/mL，在無菌條件下采用微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存，備用；
2）中藥組合物提取液的制備方法：
按所述重量份稱取各原料藥，混合、攪拌、粉碎，加水煎煮，合并濾液、濃縮，得到濃縮濾液；之后用乙醇醇提，去乙醇后，在藥液中加注射用水，殺菌，得到本發(fā)明的乳房注入劑中藥提取液；
所述加水煎熬是加入相對于原料藥質量之和5-15倍質量的水，煎煮1-4 h，煎煮3 次；
所述乙醇醇提是在濃縮濾液中加入1倍濃縮液質量的乙醇，將醇沉液離心，取上清液，上清液去乙醇后再加入乙醇進行醇沉，醇沉液過濾，濾過液去乙醇，再加入去離子水，得到含生藥量為0.5 g/mL的溶液，過濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液；
3）乳房注入劑藥物的制備方法：
取所述中藥組合物提取液20 mL，在其中加入0.5 mL吐溫-80和50 mg苯甲醇，混合均勻后，加注射用水至 90mL，氫氧化鈉調pH 值至7.4，100℃滅菌30 min，冷卻，至溫度降至20℃，無菌加入抗DP-BM-IgY卵黃抗體10 mL，在無菌條件下進行灌裝得成品乳房注入劑。
本發(fā)明的第三個目的是提供了上述一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑在制備用于防治奶牛乳腺炎的乳房注入劑藥物中的應用。
進一步的，上述的應用，所述乳房注入劑藥物的使用量為每頭奶牛每個乳區(qū)20-60 mL。
本發(fā)明的有益效果為：
（1）本發(fā)明提供的含有抗DP-BM-IgY卵黃抗體及中藥組合物提取液的乳房注入劑藥物，同時具有局部和全身作用。用藥后藥物可直接作用于乳腺組織，從而提高生物利用度及藥物療效，對疾病的治療更加有效、確切，并可降低藥物引起的全身毒副作用，減少藥物不良反應，使用方便，順應性好，增加了使用的安全性。其次，藥物經(jīng)乳腺組織局部吸收后可產生全身作用，特異性的防治奶牛乳腺炎的主要病原菌（包括對抗生素及消毒劑產生耐藥性的致病菌），有助于克服多藥耐藥性，恢復有益菌群，有效降低病牛的感染率和對抗生素的依賴，是防治奶牛乳腺炎的良好劑型。
（2）本發(fā)明提供的抗DP-BM-IgY乳房注入劑的制備方法，選材方便、提取效率高、成本相對較低，易于形成規(guī)?；a。
（3）本發(fā)明公開了一種治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑的用途，該藥物通過將抗DP-BM-IgY卵黃抗體與中藥復方活性成分進行偶聯(lián)，可通過特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體定向捕捉無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，制備出針對鏈球菌、葡萄球菌、G—桿菌獸用靶向治療藥物。其次，中藥復方提取液除具有清熱解毒、退毒下膿、抗菌消炎的優(yōu)點外，還兼具提高奶牛免疫力及抗病能力的特點，而且刺激性小、低毒無殘留、不易產生耐藥性，因此，對鏈球菌、葡萄球菌、G—桿菌引起的奶牛臨床型、隱性乳腺炎具有良好的靶向治療和預防作用。長期給奶牛使用不會產生藥物殘留，無需停擠乳或棄乳期，能顯著的節(jié)省成本，減少棄奶損失，具有預防保健和疾病治療的雙重效果，使奶農及奶牛養(yǎng)殖企業(yè)獲得良好的經(jīng)濟效益。
（4）本發(fā)明通過制備抗DP-BM-IgY卵黃抗體與中藥組合物提取液的乳房注入劑藥物，能夠直接在乳房局部給藥，靶向效果大大提高，可進一步提高藥物抗菌抑菌作用及生物利用度，對疾病的治療更加有效、確切，并可降低藥物引起的全身毒副作用，減少藥物不良反應，使用方便，順應性好，增加了使用的安全性。
附圖說明
圖1為抗DP-BM-IgY卵黃抗體的純度檢測結果。
其中： M-蛋白Marker；1-標準雞IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。
具體實施方式
奶牛乳腺炎是奶牛乳腺組織炎癥，主要由多種非特定的病原微生物引起的，常見主要致病菌為鏈球菌屬、葡萄球菌屬和腸桿菌屬等。另外，環(huán)境因素和飼養(yǎng)管理對奶牛乳腺炎的發(fā)病率也有很大影響，當奶牛生活環(huán)境衛(wèi)生條件差或擠奶不當損傷乳管，使得機體降低和喪失抗感染的能力，奶牛乳房容易遭受病原微生物侵襲而發(fā)生乳腺炎。其次，當乳房局部出現(xiàn)血液循環(huán)障礙時，乳腺黏膜系統(tǒng)受損，免疫能力降低，造成致病菌大量入侵、增殖引發(fā)炎癥。本發(fā)明所述的特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體可通過被動免疫途徑防治奶牛乳腺炎，定向殺滅多種奶牛乳腺炎致病菌，尤其是抗生素無法有效殺滅的L-型耐藥變種菌及其他耐藥菌，而對奶牛乳房內的有益菌無影響。因此，抗DP-BM-IgY卵黃抗體有助于提高奶牛對乳腺炎主要致病菌的抗性，對奶牛多種類型的乳腺炎都有明顯療效，愈后奶牛乳腺炎不再復發(fā)，并以其性質穩(wěn)定、特異性強、無殘留、無抗藥性而倍受關注。
另外，傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論認為，乳腺炎即乳癰，是痰、濕、氣、血瘀結不散化而為炎。因飼養(yǎng)管理不善，久臥濕熱之地，濕熱毒氣上蒸，侵害乳房?；蛞蛭笩嵊菏?，肝郁氣滯，乳絡失暢以致乳房氣血凝滯，瘀結而生癰腫。本發(fā)明所述的中藥組合物根據(jù)中獸醫(yī)藥和現(xiàn)代中醫(yī)藥學理論，以散瘀止痛、退毒下膿、涼血消腫、免疫增強為原則，按照一定的重量份組方而成的，既能活血化瘀、抗菌消炎，又能提高奶牛的免疫力和抗病力，達到標本兼治、祛邪固本的功效，利于預防和治療奶牛乳腺炎。
所述中藥組合物的原料藥包括漏蘆、紫花地丁、連翹、地榆、瓜蔞、當歸和黃芪。
所述中藥組合物中各原料藥的重量份分別為：漏蘆5-15 份，蒲公英5-15 份，紫花地丁5-15 份，連翹5-20 份，地榆5-15 份，瓜蔞5-15 份，當歸5-10 份，黃芪10-20 份。
各原料藥的重量份優(yōu)選為：漏蘆6 份，蒲公英10 份，紫花地丁10 份，連翹12 份，地榆8 份，瓜蔞10 份，當歸7 份，黃芪15 份。
各原料藥的藥理作用具體如下：
漏蘆：學名 Stemmacanthauniflora （L.）Dittrich。性味：苦咸，寒。入胃、大腸經(jīng)。功能主治：清熱解毒，消癰，下乳，舒筋通脈。主要用于乳癰腫痛，癰疽發(fā)背，瘰疬瘡毒，乳汁不通，濕痹拘攣，骨節(jié)疼痛、熱毒血痢、痔瘡出血。
蒲公英：拉丁學名 Herba Taraxaci。性味：甘，微苦，寒。功能主治：清熱解毒，消腫散結。
紫花地?。簩W名 Viola philippica。性味：苦、辛、寒，無毒。歸心、肺經(jīng)。具有清熱解毒，涼血消腫，清熱利濕的作用，主治疔瘡，癰腫，瘰疬，黃疸，痢疾，腹瀉，目赤，喉痹，毒蛇咬傷。
連翹：拉丁學名 Forsythia suspensa，英文名稱fructus forsythiae。性味：苦、涼。歸肺、心、小腸經(jīng)。功能主治：清熱解毒，消腫散結。用于癰疽，瘰癘，乳癰，丹毒，風熱感冒，溫病初起，溫熱入營，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋尿閉。
地榆：學名Sanguisorba officinalis。性味：苦酸、寒，無毒。歸肝、肺、腎、大腸經(jīng)。功效：涼血止血，清熱解毒，消腫斂瘡。主治：吐血，咯血，衄血，尿血，便血，痔血，血痢，崩漏，赤白帶下，瘡癰腫痛，濕疹，陰癢，水火燙傷，蛇蟲咬傷。
瓜蔞：拉丁學名 Fructus Trichosanthis，英文名稱：Snakegourd Fruit。性味：甘苦、寒。歸肺、胃、大腸經(jīng)。功能主治：清熱滌痰，寬胸散結，潤燥滑腸。主要用于肺熱咳嗽，痰濁黃稠，胸痹心痛，結胸痞滿，乳癰，肺癰，腸癰腫痛，大便秘結。
當歸：學名 Angelica sinensis。性味：甘、辛、苦，性溫。歸肝、心、脾經(jīng)。功效：補血、活血、調經(jīng)止痛、潤燥滑腸。主治：血虛諸證、月經(jīng)不調、經(jīng)閉、痛經(jīng)、癥瘕結聚、崩漏、虛寒腹痛、痿痹、肌膚麻木、腸燥便難、赤痢后重、癰疽瘡瘍、跌撲損傷。
黃芪：拉丁學名 Leguminosae。性味：甘，微溫。歸肺、脾、肝、腎經(jīng)。功效：補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌。用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，癰疽難潰，久潰不斂，血虛痿黃，內熱消渴。
本發(fā)明所用到的各種原料藥都可從醫(yī)藥商店購買得到，其規(guī)格符合國家或行業(yè)標準即可。
本發(fā)明所述的中藥組合物可用常規(guī)的中藥制劑方法，制備成適合臨床應用的適宜制劑，優(yōu)選為適合局部外用的制劑，最優(yōu)選為乳房灌注方法，采用該方法可使藥物直接作用于患處，在乳腺內達到較高的藥物濃度，更好地達到散瘀止痛、退毒下膿、涼血消腫、免疫增強的功效。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應說明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1：
抗DP-BM-IgY卵黃抗體的制備：
1. 可溶性菌體蛋白抗原復合物的制備：
（1）選取具有特定抗原的致病性無乳鏈球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黃色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大腸桿菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源）。主要致病菌的培養(yǎng)優(yōu)選為均以血瓊脂斜面培養(yǎng)基進行傳代，37 ℃培養(yǎng)24 h，染色鏡檢無雜菌，得到純種。分別將4種主要致病菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基（內含5-10 %犢牛血清及1-2 %的葡萄糖）中進行擴大培養(yǎng)，置37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中(150-200 r/min)，培養(yǎng)24 h，離心收集細菌細胞。
（2）單菌濃縮蛋白抗原的制備：將菌沉淀按照每克濕菌 + 3 mL pH 7.0 的PBS緩沖液的比例，漂洗2-3 次。按每克濕菌 + 5 mL細胞裂解液的比例，混懸細菌細胞，20-37 ℃溫育10-20 min，同時輕輕搖動。細菌細胞破碎后的勻漿液用超聲波粉碎儀超聲破碎（超聲時間 5s，間歇時間 10 s，超聲 20 min，功率 400 W），10000 rpm冷凍離心10 min，棄去細菌碎片沉淀，上清即為含有目的蛋白的粗提物。取上清，18300 rpm離心30 min。棄上清，沉淀用0.5 %十二烷基肌氨酸鈉懸浮，4 ℃作用1 h，18300 rpm離心30 min。棄上清，沉淀用雙蒸水混懸，用改良Bradford法測定目的菌體蛋白濃度，將其濃度調節(jié)到1.0 mg/mL，分裝后－20 ℃保存，備用。
（3）菌體蛋白抗原復合物的制備：將相同蛋白濃度的4種單一抗原進行等濃度組合即得復合菌體蛋白抗原。
2. 多價菌體蛋白抗原免疫物的制備及動物免疫方案：
（1）免疫佐劑的選擇：免疫佐劑優(yōu)選為弗氏佐劑，初次免疫選用弗氏完全佐劑（FCA），加強免疫（二免、三免）均選用弗氏不完全佐劑（FIA），兩者在母雞血清及卵黃中誘導產生中和抗體的量上具有不同的效能。
（2）抗原免疫物的制備：初次免疫，將實施例 1中制備的10 mL 復合菌體蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑（FCA）混合，采用快速乳化法，冰浴條件下，利用超聲波粉碎儀反復乳化3-4 次（每次乳化10-15 s，置4 ℃冰箱，間隔1 min），直至完全乳化抗原和佐劑混合物。乳化完全后，冷藏備用。加強免疫均選用弗氏不完全佐劑（FIA），與所述實施例 1中制備的復合菌體蛋白抗原等量混合、充分乳化，作為免疫抗原用于免疫產蛋母雞，免疫效果更佳。
（3）免疫方案：制定多次交替的免疫程序，選擇具有高免應答能力的健康產蛋雞(180日齡)，采用肌肉、皮下多點注射式途徑，免疫間隔設定為10日、免疫3次（基礎免疫1次、加強免疫2次）、免疫接種劑量為0.50 mg的免疫方案。首免后，收集免疫雞產下的蛋為樣品，即高免雞蛋，備用。
3. 抗DP-BM-IgY卵黃抗體的分離純化及制備：
采用水稀釋法--冷凍法--聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法分離提純抗DP-BM-IgY，分別采用4 %、12 %的PEG-6000進行純化，以進一步去除卵黃磷脂及蛋白沉淀，脫脂、沉淀蛋白效果好，制備的抗DP-BM-IgY得率平均可達到50-60 mg/蛋，抗體純度可達90 %以上。具體地，將高免雞蛋用碘酒和酒精棉球進行消毒處理，分離蛋黃和蛋清，刺破蛋黃膜，收集無膜蛋黃液并計量體積。取卵黃液 + 去離子水以1: 6-10 的比例混合(v/v，每個雞蛋的卵黃液平均按15 mL計)，pH 值調至5.0-6.0，-20 ℃過夜（約8-10 h），4 ℃解凍，析出的上清液及卵黃沉淀高速冷凍離心，棄去脂肪沉淀。收集上清液，根據(jù)上清液的體積加入4 % 的PEG-6000 (w/v)，輕輕攪拌使其完全溶解，4 ℃靜置2-3 h，高速冷凍離心，以進一步去除卵黃中的磷脂（離心后的黃色沉淀主要是蛋黃中的磷脂，蛋白主要存在上清液中）。收集上清液，根據(jù)上清液的體積加入12 % 的PEG-6000 (w/v)，輕輕攪拌使其完全溶解，4 ℃靜置1-2 h，以沉淀其中的蛋白抗體，高速冷凍離心，獲得的抗DP-BM-IgY卵黃抗體沉淀。
用少量0.1M PBS 溶液溶解沉淀，用改良Bradford法測定其中抗DP-BM-IgY卵黃抗體的蛋白濃度，并將其濃度調節(jié)到50 mg/mL，4℃保存，備用。
實施例2：
中藥組合物的制備方法，所述中藥提取液為乳房注入劑，具體為：
中藥提取液1號 的制備：
1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆5，蒲公英5，紫花地丁5，連翹5，地榆5，瓜蔞5，當歸5，黃芪10。
2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過濾。將上述3 次過濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過得濾過液。濾過液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。
中藥提取液2號 的制備：
1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆15，蒲公英15，紫花地丁15，連翹20，地榆15，瓜蔞15，當歸10，黃芪20。
2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過濾。將上述3 次過濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過得濾過液。濾過液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。
中藥提取液3號 的制備：
1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆10，蒲公英12，紫花地丁12，連翹15，地榆10，瓜蔞12，當歸8，黃芪18。
2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL，浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過濾。將上述3 次過濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過得濾過液。濾過液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。
中藥提取液4號 的制備：
1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆6，蒲公英10，紫花地丁10，連翹12，地榆8，瓜蔞10，當歸7，黃芪15。
2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過濾。將上述3 次過濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過得濾過液。濾過液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。
中藥提取液5號 的制備：
1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆4，蒲公英8，紫花地丁8，連翹10，地榆5，瓜蔞7，當歸5，黃芪10。
2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過濾。將上述3 次過濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過得濾過液。濾過液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。
實施例3：
乳房注入劑藥物的制備方法：
取所述中藥提取液20 mL，在其中加入0.5 mL吐溫-80和50 mg苯甲醇，混合均勻后，加注射用水至90 mL，氫氧化鈉調pH 值至7.4，100℃滅菌30 min，冷卻，至溫度降至20 ℃左右，無菌加入抗DP-BM-IgY卵黃抗體10 mL，在無菌條件下進行灌裝，得成品乳房注入劑（優(yōu)選為50 mL/支）。抗DP-BM-IgY卵黃抗體：中藥提取液：注射用水的體積比為10：20：70。
進一步的，所述中藥提取液優(yōu)選為4號提取液（溶液含生藥量為0.5 g/mL），所述抗DP-BM-IgY卵黃抗體蛋白濃度50 mg/mL，最終注入劑藥物中生藥含量為0.1 g/mL。
進一步的，上述的應用，所述注入劑藥物的使用量為每頭奶牛每個乳區(qū)20-60 mL。
實施例4：
抗DP-BM-IgY卵黃抗體法純度檢測：
采用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，用于分離蛋白的凝膠選擇為：由7.5 %的分離膠和5.0 % 的濃縮膠組成的凝膠分離系統(tǒng)。電流：11 mA，電壓：220 V，時間：50 min，Marker 采用低相對分子質量標準蛋白質，采用考馬斯亮藍R-250 染色法?？笵P-BM-IgY卵黃抗體的純度檢測結果，如圖1所示。
圖1中，提取的抗DP-BM-IgY卵黃抗體蛋白質中含有少量41～44 Kda的IgY，而在標準商品化雞IgY中位于45 Kda處的條帶己被徹底除去。經(jīng)軟件Bandscan分析，IgY純度可達90 %以上。其中： M-蛋白Marker；1-標準雞IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。
實施例5：
乳房注入劑藥物的急性毒性試驗：
（1） 試驗動物與受試藥物
昆明系清潔級小鼠60只，小鼠體重20±2 g，雌雄各半，雌性小鼠未產未孕。飼養(yǎng)條件：試驗清潔級顆粒鼠糧（蘇飼審（2008）01008），室內溫度22±2 ℃，相對濕度為30 %～60 %，自由采食與飲水。連續(xù)觀察1周，臨床健康即可用于試驗，試驗期間按常規(guī)飼養(yǎng)。
受試藥為實施例3制備獲得的乳房注入劑藥物，其中含抗DP-BM-IgY抗體的濃度為5.0 mg/mL。
（2） 試驗方法
將健康小鼠隨機分成5個劑量組和1個對照組，組間劑量比設為1:1.4。每組10只，雌雄各半，并對每只小鼠進行稱重。灌胃前8 h、灌胃后4 h禁食，但可自由飲水。
各藥物劑量組根據(jù)小鼠體質量，按照1.00、1.40、1.96、2.74、3.84 g/kg的藥物劑量計算給藥量，以等濃度口服液經(jīng)口灌喂給藥，每日最大灌胃量不超過1.0 mL/只。對照組灌服生理鹽水。試驗期間所有小鼠自由采食與飲水。
（3） 觀察指標
給藥后3 h內，每隔30 min觀察1次小鼠的健康狀況、中毒表現(xiàn)及死亡過程，包括采食飲水、行為及反應、自主活動、呼吸急促或放緩狀態(tài)、被毛松散度、癥狀起始時間和持續(xù)時間、死亡等情況；之后，每隔2 h觀察1次；2 d后，每天觀察6次，連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計死亡率。
組織病理學檢查：實驗期間對死亡小鼠及時進行解剖并記錄病變情況，尤其是其肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、腸道、胃的病理變化，包括各臟器的外觀形態(tài)顏色、大小、質地，胃腸發(fā)明是否出現(xiàn)腹部脹氣，并觀察大便性狀和色澤。第8天，對所剩存活小鼠進行稱重、斷頸處死，剖檢觀察、記錄腹腔內的液體狀況以及心、肝、脾、肺、腎的病理變化。
（4） 試驗結果與分析
給藥灌胃后，2.74、3.84 g/kg劑量組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、活動量減少的現(xiàn)象，未見其他明顯的異常反應。灌胃后第2～3 d，1.00、1.40、1.96、2.74 g/kg劑量組小鼠飲食、飲水量均有一定程度的增加，活動增多，精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)異常反應。而3.84 g/kg藥物劑量組小鼠精神欠佳，至試驗結束出現(xiàn)2例死亡小鼠。
試驗過程中小鼠自由采食與飲水，經(jīng)稱重，各藥物組及對照組小鼠的體質量在第7 d試驗結束時，體質量較初始體重均有一定程度的增加，存活的小鼠體質量均在30 g以上，1.00、1.40、1.96、2.74 g/kg劑量組在觀察期間未見死亡，未出現(xiàn)毒性反應。小鼠剖檢檢查結果顯示，各藥物組小鼠的主要組織器官正常，臟器無實質性異常變化。
急性毒性試驗結果表明，采用改良寇氏法計算注入劑藥物的LD50為5394.0 mg/kg，95 %置信區(qū)間為：3548.4--4010.6 mg/kg，屬于基本無毒。
實施例6：
中藥提取液4號的體外抑菌試驗：
（1） 試驗菌株：無乳鏈球菌(S. agalactiae)、乳房鏈球菌(S. uberis) 為本實驗室從乳房炎患牛乳汁中分離鑒定的優(yōu)勢菌株。停乳鏈球菌(S. dysgalactiae)[ATCC 35666]、金黃色葡萄球菌（S. aureus) [CMCC(B) 26003]、大腸埃希菌（E. coli) [CMCC(B) 44102]、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris) [CMCC(B) 49027]、化膿性鏈球菌 (S. pyogenes) [ATCC 19615]、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa) [CICC 10419]，分別購自中國普通微生物菌種保藏管理中心和中國工業(yè)微生物菌種保藏與管理中心，具有ATCC官方授權。
（2）試驗方法
MIC 的測定：按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的常量稀釋法（macrodilution），測定實驗菌株的最小抑菌濃度MIC值，通過管碟法觀察其體外抑菌活性。稀釋液為MH 肉湯。
瓊脂稀釋法：
接種菌量的準備：取各菌（細菌）的肉湯培養(yǎng)物，按10倍稀釋法，用0.9 %無菌生理鹽水溶液，制備濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的供試菌懸液，再用MH 肉湯稀釋至含菌量為1×107 CFU /mL，備用。
含藥瓊脂平板的制備：采用對倍稀釋法，用MH 肉湯稀釋待測藥物，6 mL/管，1# 管至10# 管中的藥物濃度依次為500 mg/mL（原藥濃度）、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.81 mg/mL、2.91 mg/mL、1.95 mg/mL、0.98 mg/mL。11# 管為不含藥物的生長對照。取33個無菌培養(yǎng)皿，分別對其進行標注(1#～11#)。制備MH 營養(yǎng)瓊脂11瓶，54 mL/瓶，121℃滅菌15 min。待溫度降至50 ℃左右，鏈球菌用平板加入2 %小牛血清，再吸取1#～11# 管內不同濃度的待測藥物6 mL，依次加入54 mL 的MH營養(yǎng)瓊脂中(藥物:瓊脂=1：9，v/v)，充分混勻，傾注滅菌平皿，20 mL/皿，瓊脂厚度以4 mm為宜。
接 種：在平板上劃定區(qū)域，移液槍吸取制備好的稀釋菌液1～2 μL，接種瓊脂平板表面，每個接種點約含104個菌。接種后形成的菌液圈直徑約5～8 mm。培 養(yǎng)：接種點菌液干后，將平板菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～24 h。
結果判斷：菌落生長被完全抑制的最低藥物濃度即為受試中藥對檢測菌的最低抑菌濃度（完全無菌生長的平板所對應的藥物濃度作為最低抑菌濃度）。單一菌落生長可忽略不計。各菌重復3次，求平均值。
管碟法：采用牛津杯加注藥液的體外抑菌法。
培養(yǎng)基平板的制備：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）瓊脂培養(yǎng)基（pH 7.2-7.4）按商品說明書進行配制。121 ℃滅菌15 min，待溫度降至50～60℃左右，傾注無菌平皿，使瓊脂厚度為4 mm。鏈球菌使用含5 %脫纖維綿羊血（v/v）的MH瓊脂平板。MH瓊脂平板使用前應置35 ℃孵育30 min，使其表面干燥。
牛津杯加注藥液法：將制備的菌液用滅菌生理鹽水稀釋至最佳涂布濃度，用滅菌棉簽蘸取菌液，將多余的菌液沿管壁擠出，然后均勻涂布至MH瓊脂平板，共3次，每次旋轉平板60°，最后沿平板內緣涂抹一周，以取得均勻接種。平板加蓋置放于超凈工作臺內，干燥至少3 min，不超過15 min。將滅菌牛津杯在酒精燈上微灼，在每個瓊脂平板表面上等距離放置4只牛津杯，并在每只牛津杯中加入受試藥液原液200 uL。在牛津杯上覆蓋2張滅菌濾紙（以防培養(yǎng)時水珠掉下影響實驗結果），合蓋，平皿平置，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20～24 h。
結果觀察：用游標卡尺測量藥物對各菌的抑菌環(huán)直徑，并評價其抑菌效果。試驗在相同條件下重復1次，兩次結果應基本一致，否則不予報道。結果判定：抑菌環(huán)直徑小于10 mm，為無抑菌作用；介于在10～15 mm，為抑菌作用較弱；大于20 mm，為具有較強抑菌作用。
（3）結果與分析：（見表 1）
表 1 中藥提取液4號的最小抑菌濃度(MIC)及抗菌活性。
結果顯示，中藥提取物4號對不同奶牛乳房炎常見病原菌表現(xiàn)出不同的抑菌作用，對鏈球菌屬的抑菌效果較強，MIC值小于31.25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌和變性桿菌具有一定的抑菌作用，MIC為62.5 mg/mL，而對常見腸桿菌具有較弱的抑菌作用，MIC值在125 mg/mL左右。其次，中藥提取物4號的原藥（500 mg/mL）對試驗菌株均有一定抑制作用，但抑菌強度不同。對鏈球菌屬及金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，抑菌環(huán)直徑介于21-23 mm之間；對金黃色葡萄球菌及腸桿菌具有較弱的抑菌活性，抑菌環(huán)直徑介于15-18 mm之間，在牛津杯周圍可見明顯的藥物作用圈，作用圈內可見少量散在小菌落。
實施例7：
乳房注入劑藥物的臨床療效觀察試驗：
1. 材料與方法：
1.1 試驗藥品：
乳房注入劑藥物，由中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所創(chuàng)新獸藥工程重點研究室制備。對照藥：注射用氨芐西林鈉（2 g/支，鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司）。奶牛乳腺炎診斷液（LMT 診斷液），由中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)研究室制備。
1.2 試驗方法：
患病奶牛分別來自甘肅省荷斯坦奶牛繁育示范中心、甘肅秦王川奶牛場試驗場，共計26頭28個乳區(qū)。奶牛臨床型乳房炎10頭10個乳區(qū)，奶牛隱性乳房炎16頭18個乳區(qū)（其中2頭患牛為雙乳區(qū)炎癥癥狀）。
奶牛臨床型乳房炎診斷標準為：奶牛產奶量下降，乳房部分腫脹發(fā)紅，有熱和痛感，牛奶中有薄片、絮狀物、膿塊或血液，牛奶呈稀水樣或擠不下來。嚴重時則表現(xiàn)為乳房突然腫脹、發(fā)熱、變硬、乳區(qū)敏感，甚至表現(xiàn)體溫升高、飲食大減或廢絕、精神萎頓等。根據(jù)臨床癥狀、乳房觸診和乳汁檢查，可確定為臨床型乳腺炎。
奶牛隱性乳房炎的確診：乳房及乳樣無上述癥狀及表現(xiàn)，LMT診斷液現(xiàn)場診斷呈陽性，乳區(qū)乳樣經(jīng)細菌分離培養(yǎng)、鑒定，可見常見致病菌生長。
奶牛乳房炎治愈標準：眼觀為臨床紅腫熱痛癥狀消失，乳汁正常，現(xiàn)場LMT診斷為陰性結果，乳區(qū)奶樣的細菌分離培養(yǎng)無細菌生長。
試驗分組：
（1）4頭臨床型乳房炎患牛及4頭隱性乳房炎患牛，為抗生素治療對照組，采用注射用氨芐西林鈉，按照說明書方法使用。
（2）其余18頭患病奶牛為注入劑藥物治療組，乳房注入劑藥物的使用：將患病乳區(qū)乳汁擠干，注入藥物50 mL/乳區(qū)，每日2 次，3 天為1療程。
治愈判定標準：
（1）臨床癥狀消失，乳汁正常；（2） LMT 診斷為陰性。
1.3 奶牛乳腺炎患牛的療效觀察：
藥物治療試驗結果如表 2所示。
表 2
結果表明，使用乳房注入劑藥物后，患牛乳房部位紅、腫、熱、痛、硬癥狀明顯減輕，消腫快，無不良反應，回奶迅速，肉眼觀察奶樣恢復正常，奶產量逐漸提高。對于急性臨床型病例，乳房注入劑的治愈效果低于對照抗生素藥物，但該藥對隱性乳房炎具有較好的治療效果，用藥5天后，有10頭12個乳區(qū)的乳房炎癥狀消失或明顯改善，頭治愈率和乳區(qū)治愈率均高于對照藥物組。
本發(fā)明制備抗DP-BM-IgY卵黃抗體所使用的菌種購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），其中，無乳鏈球菌（分類命名：S.agalactiae，編號CVCC55901，牛源）、停乳鏈球菌（分類命名：S.dysgalactiae，編號CVCC55935 牛源）、金黃色葡萄球菌（分類命名：S.aurrus，編號CVCC 8029 牛源）及大腸桿菌（分類命名：E.coli，O157：K88，編號CVCC1489 牛源）。
最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。