依據(jù)35USC 119(e)，本申請要求2014年2月18日提交的美國臨時專利申請NO.61/940,959的優(yōu)先權。將美國臨時專利申請No.61/940,959的公開內容全部按引用并入本文中。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及使用感染原檢測微生物的方法和系統(tǒng)。

背景

對提高檢測生物、食品、水和臨床樣品中的細菌、病毒和其他微生物的速度和靈敏度存在強烈興趣。微生物病原體可以引起人和家畜中相當大的發(fā)病率，以及巨大的經濟損失。此外，鑒于由攝入某些微生物(例如，大腸桿菌(E.coli)或沙門氏菌(Salmonella spp.)污染的食品引起的致病或毀滅性的疾病，微生物的檢測對于食品藥品管理局(FDA)和疾控中心(CDC)是高優(yōu)先級的。

用于細菌檢測的傳統(tǒng)微生物測試依賴非選擇性和選擇性的富集培養(yǎng)，接著涂布在選擇性的培養(yǎng)基上并進一步測試，以證實懷疑的菌落。這樣的程序可能需要幾天。已經研究了各種快速方法并引入實踐來縮短時間需求。然而，這些方法具有缺陷。例如，涉及直接免疫測定或基因探針的技術通常需要富集步驟，以獲得適當?shù)撵`敏度。聚合酶鏈反應(PCR)測試還包括擴增步驟，并且因此能夠具有非常高的靈敏度和選擇性；然而，可以經濟地接受PCR測試的樣品大小受到限制。使用稀釋的細菌懸浮液，大部分小的子樣品將不含細胞，并且因此仍然需要純化和/或富集步驟。

傳統(tǒng)生物富集所需的時間受樣品的靶細菌群的生長速率、樣品基質的影響和所需靈敏度的控制。例如，對于分別檢測模型系統(tǒng)中1000、100和1個集落形成單位/毫升(CFU/mL)，用于產志賀毒素大腸桿菌的磁捕獲PCR系統(tǒng)可能需要約5、7和10小時的富集培養(yǎng)，而對于檢測絞碎牛肉中的1CFU/克(g)，需要15小時的富集培養(yǎng)。在實踐中，大部分高靈敏度方法使用過夜孵育并且總地花費大約24小時。由于培養(yǎng)所需的時間，根據(jù)待測定的生物體和樣品來源，這些方法可能花費長達三天。這種滯后的時間通常是不合適的，因為受污染的食品、水(或其他產品)可能已經進入牲畜或人。此外，抗生素抗性細菌的增加和生物防御考慮使得全世界非常優(yōu)先地考慮水、食品和臨床樣品中細菌病原體的快速鑒定。

因此，需要快速、簡單和靈敏的微生物檢測和鑒定，所述微生物如細菌、病毒和其他潛在致病的微生物。

概述

本發(fā)明的實施方案包括用于微生物檢測的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明可以以各種方式來具體說明。

在一些方面中，本發(fā)明包括重組噬菌體，其包括插入噬菌體的晚期基因區(qū)中的指示基因。

在一些實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測樣品中的目標微生物的方法，其包括將樣品與感染目標微生物的重組噬菌體一起孵育的步驟，其中重組噬菌體包括插入噬菌體的晚期基因區(qū)中的指示基因，使得在宿主細菌感染后的噬菌體復制過程中指示基因表達，形成可溶的指示蛋白產物，并且檢測指示蛋白產物，其中指示劑蛋白產物的陽性檢測表示目標微生物存在于樣品中。

在其他實施方案中，本發(fā)明包括用于快速檢測樣品中的目標微生物的系統(tǒng)，其包括用于將樣品與目標微生物特異性的感染原一起孵育的組分，其中感染原包括指示部分，和用于檢測指示部分的組分。

在再其他實施方案中，本發(fā)明包括用于與根據(jù)本發(fā)明的方法或系統(tǒng)一起使用的非瞬時性計算機可讀介質。

附圖簡述

通過參考一下非限制性附圖可以更好地理解本發(fā)明。

圖1描繪了根據(jù)本發(fā)明實施方案的指示噬菌體構建體，說明了包括螢火螢光素酶基因和T7晚期啟動子的遺傳構建體插入噬菌體的晚期(III類)區(qū)。還描繪了在所有三個閱讀框中包括防止通讀的終止密碼子和未翻譯區(qū)(UTR)的序列。

圖2顯示了噬菌體JG04的基因組，JG04是T4-樣噬菌體，其從污水處理廠樣品分離并與T4-樣噬菌體RB69共享～98％同一性。衣殼蛋白gp23和gp24在晚期基因區(qū)內，由結構基因組成，其編碼病毒粒蛋白。因為這些病毒粒蛋白以非常高的水平表達，可以預期插入這個區(qū)域的任何基因具有相似表達水平，只要使用晚期基因啟動子和/或其他相似控制元件。

圖3顯示了攜帶三個不同螢光素酶基因的同源重組質粒構建體。將螢火螢光素酶，螢光素酶，和Oplophorus螢光素酶基因每個插入pUC57.Amp^R質粒主鏈中。在每個構建體中，gp23衣殼蛋白基因的片段接著是T4晚期啟動子，各自的螢光素酶基因和gp23-24未翻譯區(qū)。Oplophorus構建體另外包括未翻譯區(qū)下游的gp24基因的片段。

圖4描繪了使用一些列按序感染和吸收步驟，使用如圖3中所示那些的質粒構建體，從JG04噬菌體的修飾分離重組噬菌體，以鑒定表達指示基因的重組噬菌體。

圖5描繪了使用編碼可溶性螢光素酶的指示噬菌體，以通過檢測細菌細胞感染過程中從子代噬菌體復制產生的螢光素酶來檢測細菌細胞。

圖6證明了使用具有旋轉柱的指示噬菌體檢測靶細菌的靈敏度。X-軸上表示每個測定中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號顯示于Y-軸上，作為相對背景(BG)信號(即，無細胞)的相對魯米那單位(relative luminal unit)(RLU)(RLU/BG)。

圖7證明了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用具有旋轉柱的指示噬菌體，在一定范圍的滴定度內，檢測靶細菌。X-軸上表示每個測定中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對背景(BG)信號(即，無細胞)的相對魯米那單位(RLU)(RLU/BG)顯示于Y-軸上。

圖8證明了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用指示噬菌體和96-孔濾板檢測靶向細菌的靈敏度。X-軸上表示每個測定中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對背景(BG)信號(即，無細胞)的相對魯米那單位(RLU)(RLU/BG)顯示于Y-軸上。

圖9證明了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用指示噬菌體和96-孔濾板，在一定范圍的滴定度內，檢測靶細菌。X-軸上表示每個測定中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對背景(BG)信號(即，無細胞)的相對魯米那單位(RLU)(RLU/BG)顯示于Y-軸上。螢光素酶活性的檢測持續(xù)延長的時間段。在此，閱讀◇表示0時間(即，基線對照)；Δ15分鐘(min)后；和□30分鐘后。

圖10描繪了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用修飾的噬菌體檢測靶細菌的濾板測試，其中在濾板上孵育細菌和重組噬菌體，并且在子代噬菌體產生后，直接檢測指示劑蛋白，沒有除去培養(yǎng)基。

圖11顯示了使用噬菌體來檢測具有已知細胞數(shù)量的樣品中的大腸桿菌O157:H7細胞的濾板測試的結果。X-軸上表示每個測試中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對背景(BG)信號(即，無細胞)的相對魯米那單位(RLU)(RLU/BG)顯示于Y-軸上。

圖12描繪了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用修飾的噬菌體檢測靶細菌的“無濃縮測定”。

圖13顯示了來自使用JG04-OpLuc噬菌體的無濃縮測試的結果，以檢測具有低數(shù)量范圍的已知細胞數(shù)量的樣品中的大腸桿菌O157:H7細胞。X-軸上表示每個測試中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為與背景(X)信號(即，無細胞)相比的相對魯米那單位(RLU)顯示于Y-軸上。

圖14顯示了來自使用JG04-OpLuc噬菌體的無濃縮測試的結果，以檢測具有低至高數(shù)量范圍的已知細胞數(shù)量的樣品中的大腸桿菌O157:H7細胞。X-軸上表示每個測試中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對魯米那單位(RLU)顯示于Y-軸上。

圖15顯示了來自使用JG04-OpLuc噬菌體的無濃縮測試的結果，以檢測具有已知細胞數(shù)量的蔬菜洗滌樣品中的大腸桿菌O157:H7細胞。X-軸上表示每個測試中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對魯米那單位(RLU)顯示于Y-軸上。

圖16證明了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用親和性純化的、表面特異性的抗體，大腸桿菌O157:H7的特異性和定量捕獲。

圖17描繪了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用修飾的噬菌體，檢測靶細菌的Hybrid Immuno-Phage(HIP)測定，其中在與具有指示基因的重組感染原一起孵育前，使用目標微生物的抗體將微生物捕獲在測定孔表面上。

圖18顯示來自HIP測試的結果，使用噬菌體，以檢測具有已知細胞數(shù)量的樣品中的大腸桿菌O157:H7細胞，以對數(shù)標度。X-軸上表示每個測試中大致的大腸桿菌O157:H7細胞的數(shù)量。感染細菌時產生的可溶性螢光素酶提供的信號作為相對魯米那單位(RLU)顯示于Y-軸上。

發(fā)明詳述

本文中公開的是證明了令人驚訝的檢測測定樣品(例如，生物、血液、水和臨床樣品)中的目標微生物的靈敏度的組合物、方法和系統(tǒng)。在沒有使用任何富集培養(yǎng)或在一些實施方案中使用最小孵育時間(在該過程中，微生物可能潛在地繁殖)進行的測定中，可以使用遺傳修飾的感染原，在短于之前認為可能的時間周期中實現(xiàn)檢測。還令人驚訝的是，使用高感染復數(shù)(MOI)或高濃度的噬菌斑形成單位(PFU)用于與測試樣品一起孵育的成功。這樣的高噬菌體濃度(PFU/mL)之前據(jù)說對于微生物檢測測定是有害的，因為據(jù)說它們引起“自外溶菌作用”。

本發(fā)明的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒可以包括用于檢測此類微生物的感染原。在某些實施方案中，本發(fā)明包括組合物，所述組合物包括具有插入噬菌體的晚期基因區(qū)中的指示基因的重組噬菌體。在某些實施方案中，在宿主細菌感染后的噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性的指示蛋白產物。在某些實施方案中，指示基因可以插入噬菌體的晚期基因(即，III類)區(qū)中。噬菌體可以源自T7、T4、JG04或另一種天然噬菌體。

在一些方面中，本發(fā)明包括檢測目標微生物的方法。該方法可以使用用于檢測目標微生物的感染原。例如，在某些實施方案中，目標微生物是細菌，而感染原是噬菌體。因此，在某些實施方案中，該方法可以包括檢測樣品中的目標微生物，通過將樣品與感染目標微生物的重組噬菌體一起孵育。在某些實施方案中，重組噬菌體包括指示基因。在某些實施方案中，指示基因可以插入噬菌體的晚期基因區(qū)中，使得在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物。該方法可以包括檢測指示蛋白產物，其中指示蛋白產物的陽性檢測表示目標微生物存在于樣品中。

在某些實施方案中，本發(fā)明可以包括一種系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以含有至少一些本發(fā)明的組合物。此外，該系統(tǒng)可以包括至少一些用于進行所述方法的組分。在某些實施方案中，將所述系統(tǒng)配制成試劑盒。在某些實施方案中，本發(fā)明可以包括用于快速檢測樣品中的目標微生物的系統(tǒng)，其包括：用于將樣品與目標微生物特異性的感染原一起孵育的組分，其中感染原包括指示部分；和用于檢測指示部分的組分。在再其他實施方案中，本發(fā)明包括用于與所述方法或系統(tǒng)一起使用的軟件。

因此，本發(fā)明的一些方法通過使用基于感染原的方法解決了對擴大表示細菌存在的可檢測信號的需求。在某些實施方案中，檢測少至單個細菌。本文中應用的原理可以應用于檢測各種微生物。由于微生物表面上用于感染原的無數(shù)結合位點，在感染過程中產生一百或更多感染原子代的能力和編碼的指示部分的高水平表達的可能，感染原或指示部分可以比微生物自身更快速地檢測到。以這種方式，本發(fā)明的實施方案可以從甚至單個感染的細菌實現(xiàn)巨大的信號擴增。

本發(fā)明的各個方面利用可以結合特定微生物，如感染原的結合組分的結合劑的高特異性，作為檢測和/或定量樣品中的特定微生物的方式。在一些實施方案中，本發(fā)明利用感染原(如噬菌體)的高特異性。

在一些實施方案中，通過與目標微生物特異性的結合劑相關的指示部分來實現(xiàn)檢測。例如，感染原可以包括指示部分。在一些實施方案中，指示劑可以由感染原(如噬菌體)編碼，并且噬菌體被定名為指示噬菌體。

本文中公開和描述的本發(fā)明的一些實施方案利用以下發(fā)現(xiàn)：單個微生物能夠結合特定的識別劑，如噬菌體。噬菌體感染和復制后，可以通過噬菌體復制過程中表達的指示部分檢測子代噬菌體。這個原則基于微生物表面受體的特異性識別，允許從一或幾個細胞擴大指示信號。例如，通過將甚至單個微生物細胞暴露于多個噬菌體，此后在復制過程中允許噬菌體的擴增和編碼的指示基因產物的高水平表達，指示信號擴大，使得可以檢測到單個微生物。

本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的實施方案可以應用于檢測和定量各種環(huán)境中的各種微生物(例如，細菌、真菌、酵母)，包括但不限于來自食品、水、臨床和商業(yè)樣品的病原體的檢測。本發(fā)明的方法可以快速地提供高檢測靈敏度和特異性，并且不需要傳統(tǒng)的生物富集(例如，富集培養(yǎng))，這是令人驚訝的方面，因為所有可利用的方法都需要培養(yǎng)。在一些實施方案中，檢測在噬菌體或病毒的1-2個復制周期內是可能的，這與常規(guī)智慧相反，因為常規(guī)智慧不利用噬菌體的天然能力來擴大自身和螢光素酶信號。

定義

除非本文中另外限定，否則結合本發(fā)明使用的科學和技術術語應當具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非內容另外需要，單數(shù)術語應當包括復數(shù)，并且復數(shù)術語應當包括單數(shù)。通常，結合本文中所述的細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白和核酸化學和雜交使用的命名以及本文中所述的細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白和核酸化學和雜交的教導是本領域公知和常用的那些。通常根據(jù)本領域公知的以及按照本發(fā)明整個說明書中討論的各種一般的和更具體的參考文獻中所述的常規(guī)方法進行已知的方法和技術，除非另外指出。根據(jù)制造商的說明進行酶反應和純化技術，如本領域通常完成的或如本文中所述的。結合本文中所述的實驗室程序和技術使用的命名是本領域公知和常用的那些。

以下術語，除非另外指出，應當理解為具有以下含義：

如本文中使用的，術語“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”可以指一個或多個，除非另外明確指出。

術語“或”的使用用來表示“和/或”，除非明確指出是指只是替換方案或替換方案是互相排他的，盡管公開內容支持表示只是替換方案和“和/或”的限定。如本文中使用的，“另一個”可以表示至少第二個或更多。

在整個本申請中，術語“約”用于表示數(shù)值包括該設備的固有誤差變化、該方法用于測定該數(shù)值或樣品間存在的變化。

術語“固體支持物”或“支持物”表示提供其上可以結合生物分子的基質和/或表面的結構。例如，固體支持物可以是測定孔(即，如微滴定平板或多孔平板)，或固體支持物可以是濾器、陣列或可移動支持物，如珠?；蚰ど系奈恢?例如，濾板或側流條)。

術語“抗體”包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體和嵌合抗體，例如，通過組合誘變和噬菌體展示產生的。術語“抗體”還包括抗體的模擬物或肽模擬物。肽模擬物是基于或源自肽和蛋白質的化合物。本發(fā)明的肽模擬物通常可以使用非天然氨基酸、構象限制、等構置換等，通過已知肽序列的結構修飾而獲得。在一些實施方案中，抗體片段可以替代抗體來起作用。如本文中使用的“表面特異性抗體”結合特定微生物外表面上暴露的分子。

如本文中使用的，術語“游離抗體”是指在溶液中并且可以通過液體自由移動的抗體；即，它們最初不結合固體支持物或者被限制。

如本文中使用的，“親和性純化的”或“親和性純化”是指一系列用于制備和處理抗體，使得它們呈現(xiàn)出最佳的特異性和靈敏性，包括與不需要表位的最小交叉反應性的步驟。例如，從抗血清除去不需要的脂質和蛋白質可以首先通過鹽沉淀步驟來實現(xiàn)。更多陽性選擇(也稱為“親和性純化”)和/或陰性選擇(也稱為“反向純化”)可以通過將剩余的抗體通過包括設計來截留具有特定表位親和性的表面抗原的支持物(例如，瓊脂糖柱)來實現(xiàn)。在一些實施例中，其中起始抗血清是多克隆的，這些選擇步驟后截留的純化抗體能夠識別目標微生物表面上的許多不同表位，但它們不識別其他微生物的表面表位。

術語“結合劑”是指可以特異性和選擇性地結合第二個(即，不同的)目標分子的分子。相互作用可以是非共價的，例如，作為氫鍵合、范德華相互作用或靜電或疏水性相互作用的結果，或可以是共價的。術語“可溶性結合劑”是指不與固體支持物相連(即，共價或非共價結合)的結合劑。

如本文中使用的，“分析物”是指待測量的分子、化合物或細胞。在某些實施方案中，目標分析物可以與結合劑相互作用。如本文中所述的，術語“分析物”可以指目標蛋白或肽。分析物可以是激動劑、拮抗劑或調節(jié)劑?；颍治鑫锟梢圆痪哂猩镄?。分析物可以包括小分子、糖、寡糖、脂質、肽、肽模擬物、有機化合物等。

術語“可檢測部分”或“可檢測生物分子”或“報道子”或“指示部分”是指可以在定量測定中測量的分子。例如，指示部分可以包括可以用于將底物轉化成可以測量的產物的酶。指示部分可以是催化產生生物發(fā)光發(fā)射的反應的酶(例如，螢光素酶)?；颍甘静糠挚梢允强梢远康姆派湫酝凰??；颍甘静糠挚梢允菬晒鈭F。或，可以使用其他可檢測分子。

如本文中使用的，“噬菌體(bacteriophage)”或“噬菌體(phage)”包括多種細菌病毒中的一種或多種。在本公開內容中，術語“噬菌體(bacteriophage)”和“噬菌體(phage)”包括如分枝桿菌噬菌體(如，用于TB或paraTB)、真菌噬菌體(如，用于真菌)、支原體噬菌體這樣的病毒，以及是指可以入侵活的細菌、真菌、支原體、原生動物、酵母和其他用顯微鏡可見的活生物體并且使用它們來自我復制的病毒的任何其他術語。在此，“顯微鏡可見的”表示最大尺寸為一毫米或更小。噬菌體是已經自然進化以使用細菌作為自我復制方式的病毒。噬菌體通過使自身連接至細菌并將其DNA(或RNA)注入該細菌中，并誘導其復制噬菌體上百乃至上千次，來進行這個過程。將這成為噬菌體擴增。

如本文中使用的，“晚期基因區(qū)”是指在病毒生命周期晚期轉錄的病毒基因組的區(qū)域。晚期基因區(qū)通常包括最大量表達的基因(例如，裝配至噬菌體顆粒中的結構蛋白)。晚期基因與III類基因是同義的，并且包括具有結構和裝配功能的基因。例如，晚期基因(與III類同義)在T7中轉錄，例如，從傳染后8分鐘脂質裂解，I類(例如，RNA聚合酶)是早期從4-8分鐘，而II類是早期從6-15分鐘，因此在II和III的時間上存在重疊。晚期啟動子是天然位于這樣的晚期基因區(qū)并且在該區(qū)域中有活性的啟動子。

如本文中使用的，“富集培養(yǎng)”是指傳統(tǒng)培養(yǎng)，如在有利于微生物繁殖的培養(yǎng)基中的孵育，并且不應當與詞語“富集”的其他可能的使用混淆，如通過除去樣品的液體組分以濃縮其中所含微生物的富集，或不包括微生物繁殖的傳統(tǒng)促進的其他富集形式。在本文所述方法的一些實施方案中，可以使用非常短時間段的富集培養(yǎng)，但不是必需的并且如果完全使用，時間段比傳統(tǒng)富集培養(yǎng)短得多。

如本文中使用的，“重組”是指通常在實驗室進行的遺傳(即，核酸)修飾，以將不會另外被發(fā)現(xiàn)的遺傳物質集合。該術語可以與本文中的術語“修飾”互換使用。

樣品

本發(fā)明方法和系統(tǒng)各自的實施方案可以允許樣品中的微生物的快速檢測和定量。例如，最優(yōu)選，可以在約兩小時或更短時間內進行根據(jù)本發(fā)明的方法。

通過本發(fā)明的方法和系統(tǒng)檢測的微生物包括商業(yè)、醫(yī)療或獸醫(yī)關注的病原體。這樣的病原體包括革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、支原體和病毒?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法檢測已經對其鑒定出對特定微生物具有特異性的感染原的任何微生物。本領域技術人員將認識到除了需要的特異性感染原/微生物對的可利用性，對本發(fā)明方法的應用沒有限制。

通過本發(fā)明可檢測的細菌細胞包括，但不限于，是食品或水傳播的病原體的細菌細胞。通過本發(fā)明可檢測的細菌細胞包括，但不限于，沙門氏菌屬的所有種，大腸桿菌的所有菌株，包括但不限于大腸桿菌O157:H7，李斯特氏菌屬(Listeria)的所有種，包括但不限于單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)，以及彎曲桿菌屬(Campylobacter)的所有種。通過本發(fā)明可檢測的細菌細胞包括，但不限于，是醫(yī)療或獸醫(yī)重要的病原體的細菌細胞。這樣的病原體包括但不限于芽孢桿菌屬數(shù)種(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、腸桿菌屬數(shù)種(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和鏈球菌屬數(shù)種(Streptococcus spp.)。

樣品可以是環(huán)境或食品或水樣品以及醫(yī)療或獸醫(yī)樣品。樣品可以是液體、固體或半固體。樣品可以是固體表面的拭樣。樣品可以包括環(huán)境材料，如水樣，或來自旋風收集器的空氣樣品或氣溶膠樣品的濾器。樣品可以是肉、家禽、加工食品、奶、奶酪，或其他乳制品。醫(yī)療或獸醫(yī)樣品包括但不限于血液、痰液、脊髓液和糞便樣品以及不同類型的拭樣。

樣品可以直接用于本發(fā)明的檢測方法中，不用制備、濃縮或稀釋。例如，液體樣品，包括但不限于，奶和汁液，可以直接測試。樣品可以被稀釋或懸浮于溶液中，其可以包括，但不限于，緩沖液或細菌培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^將固體在液體中切碎、混合或浸軟，將固體或半固體樣品懸浮于液體中。樣品應當維持在促進噬菌體連接宿主細菌細胞的pH范圍內。樣品還應當含有合適濃度的二價和單價陽離子，包括但不限于Na⁺、Mg²⁺和K⁺。優(yōu)選，將樣品維持在保持樣品內含有的任何病原體細胞的生活力的溫度下。

優(yōu)選在檢測測定中，將樣品維持在保持樣品中存在的任何病原體細胞的生活力的溫度下。在其中噬菌體連接細菌細胞的步驟期間，優(yōu)選將樣品維持在促進噬菌體連接的溫度下。在其中噬菌體在受感染細菌細胞內復制或裂解這樣的受感染細胞的步驟期間，優(yōu)選將樣品維持在促進噬菌體復制和宿主裂解的溫度下。這樣的溫度至少約25攝氏度(℃)，更優(yōu)選不高于約45攝氏度。最優(yōu)選約37攝氏度。還優(yōu)選將樣品在噬菌體連接、復制和細胞溶解過程中溫和地混合或振蕩。

測定可以包括各種合適的對照樣品。例如，不含噬菌體的對照樣品或含有噬菌體但不含細菌的對照樣品可以作為用于背景信號水平的對照來進行測定。

指示感染原

如本文中更詳細描述的，本發(fā)明的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒可以包括用于檢測這些微生物中的感染原。在某些實施方案中，本發(fā)明可以包括組合物，所述組合物包括具有插入噬菌體的晚期基因區(qū)中的指示基因的重組噬菌體。如以下更詳細描述的，在感染原的某些實施方案中，指示基因不編碼融合蛋白。例如，在某些實施方案中，在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物。在某些實施方案中，指示基因可以插入噬菌體的晚期基因區(qū)中。在重組噬菌體中，晚期基因區(qū)可以是III類基因區(qū)。

在一些實施方案中，指示噬菌體源自T7、T4或另一種噬菌體。指示噬菌體還可以源自T7-樣、T4-樣、JG04、JG04-樣或任何其他與T7、T7-樣、T4、T4-樣、JG04、JG04-樣噬菌體具有至少99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82，81，80，79，78，77，76，75，74，73，72，71或70％同源性的基因組的噬菌體。在一些實施方案中，指示噬菌體源自從環(huán)境分離的天然噬菌體，如按照實施例中所述的JG04噬菌體、T4-樣噬菌體。遺傳修飾可以避免野生型基因的缺失并且因此與許多商業(yè)可購得的噬菌體(例如，415)相比，保留更多與野生型感染原的相似性。這樣天然衍生的噬菌體與商業(yè)可購得的噬菌體相比，對環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的細菌更具有特異性，并且因此，遺傳上與環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的噬菌體截然不同。

此外，認為非必需的噬菌體基因可能具有未被認識的功能。例如，明顯非必需的基因可能在升高釋放量中具有重要功能，同時在裝配中具有精細切割、擬合或整理功能。因此，缺失基因以插入指示劑可能是有害的。大部分噬菌體可以包裝比其天然基因組大幾個百分比的DNA。鑒于這種考慮，對于修飾噬菌體，尤其是具有較小基因組的噬菌體，較小的指示基因可能是更合適的選擇。OpLuc和蛋白只有約20kDa(大約500-600bp來編碼)，而Fluc為約62kDa(大約1,700bp來編碼)。比較而言，T7的基因組大約為40kbp，而T4基因組為約170kbp。

在一些指示噬菌體實施方案中，指示基因可以插入未翻譯區(qū)中，以避免功能基因的破壞，留下完整的野生型噬菌體基因，當感染非實驗室菌株細菌時，這可以導致更高的適合度。另外，所有三個閱讀框的終止密碼子可以通過降低通讀來提高表達，也稱為泄露表達。這種策略還可以消除以低水平形成融合蛋白的可能性，其將呈現(xiàn)為不能與噬菌體分離的背景信號(例如，螢光素酶)。

指示基因可以表達各種生物分子。指示基因是表達可檢測產物或產生可檢測產物的酶的基因。例如，在一個實施方案中，指示基因編碼螢光素酶?？梢允褂酶鞣N類型的螢光素酶。在可替換的實施方案中，并且如本文中更詳細描述的，螢光素酶是Oplophorus螢光素酶、螢火螢光素酶或工程化的螢光素酶。

因此，在一些實施方案中，本發(fā)明包括修飾的噬菌體，其包括在晚期(III類)基因區(qū)中的非噬菌體指示基因。在一些實施方案中，非天然指示基因處于晚期啟動子的控制下。使用病毒晚期基因啟動子確保報道基因(螢光素酶)不僅高水平表達，如病毒衣殼蛋白那樣，而且沒有關閉(shut down)，如內源性細菌基因乃至早期病毒基因那樣。

在一些實施方案中，晚期啟動子是T4-或T7-樣啟動子，或另一個與沒有遺傳修飾的天然噬菌體中發(fā)現(xiàn)的相似的噬菌體啟動子。晚期基因區(qū)可以是III類基因區(qū)，并且噬菌體可以源自T7、T4、T4-樣、JG04或另一個與T7、T4或T4-樣噬菌體具有至少90％同源性的基因組的天然噬菌體。在優(yōu)選實施方案中，指示基因沒有編碼融合蛋白。

感染原的遺傳修飾可以包括小片段的核酸、實質性部分的基因或完整基因的插入、缺失或置換。在一些實施方案中，插入或置換的核酸包括非天然序列。非天然指示基因可以插入噬菌體基因組中，使得其處于噬菌體啟動子的控制下。在一些實施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。即，在一些實施方案中，可以配置遺傳修飾，使得指示蛋白產物不包括天然噬菌體的多肽。在一些實施方案中，指示蛋白產物是可溶性的。在一些實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標微生物的方法，包括將測試樣品與這樣的修飾噬菌體一起孵育的步驟。

在一些實施方案中，非天然指示基因不鄰近編碼結構噬菌體蛋白的基因，并且因此不產生融合蛋白。在一些實施方案中，宿主細菌感染后子代噬菌體中指示基因的表達形成可溶性蛋白產物。

與使用檢測部分與衣殼蛋白的融合體(即，融合蛋白)的系統(tǒng)不同，本發(fā)明的一些實施方案表達可溶性螢光素酶。這可以很大程度上提高測定的靈敏度(低至單個細菌)，并將測定簡單化，對于一些實施方案，允許測定在短于1小時內完成，與由于使用產生可檢測融合蛋白的構建體需要的其他純化步驟的幾個小時相對。此外，由于例如可能改變酶活性位點的構象或接近底物的蛋白折疊限制，融合蛋白活性可能比可溶性蛋白低。

此外，通過限定的融合蛋白限制了連接至噬菌體中的蛋白亞基上的部分的數(shù)量。例如，使用設計來作為用于融合蛋白平臺的商業(yè)上可購得的系統(tǒng)將形成約415個融合部分的拷貝，對應于約415個的每個T7噬菌體顆粒中基因10B衣殼蛋白的拷貝。在沒有這個限制的情況下，感染細菌可望表達比適合于噬菌體上的更多拷貝的檢測部分(例如，螢光素酶)。另外，大的融合蛋白，如衣殼-螢光素酶融合體，可能抑制噬菌體顆粒的裝配，因此產生較少的噬菌體子代。因此，可溶性的、非融合指示基因產物可能是優(yōu)選的。

在一些實施方案中，指示噬菌體編碼可檢測酶。指示劑可以發(fā)射光和/或可以通過顏色變化來檢測。各種合適的酶是商業(yè)上可購得的，如堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)或螢光素酶(Luc)。在一些實施方案中，這些酶可以用作指示部分。在一些實施方案中，螢火螢光素酶是指示部分。在一些實施方案中，Oplophorus螢光素酶是指示部分。在一些實施方案中，是指示部分。其他工程化螢光素酶或產生可檢測信號的其他酶也可以是合適的指示部分。

此外，使用可溶性檢測部分消除了從受感染樣品細胞的裂解物分離污染親本噬菌體的需要。使用融合蛋白系統(tǒng)，用于感染樣品細胞的任何噬菌體將具有連接的檢測部分，并且與也含有檢測部分的子代噬菌體是不可區(qū)分的。因為樣品細菌的檢測依賴于新形成的(重頭合成的)檢測部分的檢測，使用融合構建體需要另外的步驟從新形成的(子代噬菌體)部分分離老的(親本)部分。這可以在噬菌體生命周期完成前，通過洗滌受感染的細胞多次來完成，在感染后通過物理或化學方式滅活過量的親本噬菌體，和/或用結合部分(如生物素)化學修飾親本噬菌體，其隨后可以被結合并分離(如通過抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的瓊脂糖珠粒)。然而，即使在分離時使用所有這些嘗試，當使用高感染復數(shù)(MOI)來確保少量樣品細胞的感染時，通常還是保留了親本噬菌體，形成可能阻礙從受感染細胞子代噬菌體檢測信號的背景信號。

相反，在本發(fā)明的一些實施方案中使用表達的可溶性檢測部分，就不需要從最終裂解物純化親本噬菌體，因為親本噬菌體將不具有任何連接的檢測部分。因此，感染后存在的任何檢測部分必須重新形成，表示受感染細菌的存在。為了利用這種益處，親本噬菌體的產生和制備可以包括從細菌培養(yǎng)物中產生親本噬菌體的過程中產生的任何游離檢測部分純化噬菌體。根據(jù)本發(fā)明的噬菌體的一些實施方案，可以使用標準噬菌體純化技術來純化，如蔗糖密度梯度離心、氯化銫等密度梯度離心、HPLC、大小排阻色譜和滲析或衍生技術(如Amicon條帶濃縮器-Millipore，Inc.)。本文中的實施例描述了使用氯化銫等密度超離心作為本發(fā)明的重組噬菌體制備的一部分，使得從細菌儲液中的噬菌體繁殖時產生的污染螢光素酶蛋白分離親本噬菌體顆粒。以這種方式，本發(fā)明的重組噬菌體基本上不含細菌生產過程中產生的任何螢光素酶。當用測試樣品孵育重組噬菌體時，噬菌體儲液中存在的殘留螢光素酶的去除可以實質性地降低看到的背景信號。

在修飾的噬菌體的一些實施方案中，晚期啟動子(III類啟動子，例如，來自T7或T4)對相同天然噬菌體(例如，分別為T7或T4)的RNA聚合酶具有高親和性，所述天然噬菌體轉錄用于裝配至噬菌體顆粒中的結構蛋白的基因。這些蛋白是由噬菌體形成的最大量蛋白，因為每個噬菌體顆粒包含數(shù)打或數(shù)百個這些分子的拷貝。使用病毒晚期啟動子可以確保螢光素酶檢測部分的最佳高水平表達。使用源自衍生指示噬菌體的初始野生型噬菌體的晚期病毒啟動子(例如，具有基于T4-或T7-系統(tǒng)的T4或T7晚期啟動子)、衍生指示噬菌體的初始野生型噬菌體特異性的晚期病毒啟動子(例如，具有基于T4-或T7-系統(tǒng)的T4或T7晚期啟動子)或在衍生指示噬菌體的初始野生型噬菌體下有活性的晚期病毒啟動子(例如，具有基于T4-或T7-系統(tǒng)的T4或T7晚期啟動子)，可以進一步確保檢測部分的最佳表達。在一些情況下，使用標準細菌(非病毒/非噬菌體)啟動子可能對表達是有害的，因為這些啟動子在噬菌體感染過程中常常下調(為了噬菌體將用于噬菌體蛋白產生的細菌來源列為優(yōu)先)。因此，在一些實施方案中，噬菌體優(yōu)選工程化來編碼和高水平表達可溶性(游離)指示部分，其沒有將表達限于噬菌體結構組分的亞基的數(shù)量。

使用本發(fā)明修飾噬菌體的實施方案可以允許特定細菌菌株的快速檢測，總的測定時間快至45分鐘-1.5小時。根據(jù)測試中的噬菌體的菌株和待檢測細菌的菌株，所需時間量可能更短或更長一些。

圖1描繪了本發(fā)明的重組噬菌體(指示噬菌體415-Luc)的基因組結構的圖示。對于圖1中描繪的實施方案，檢測部分由晚期(III類)基因區(qū)110內插入的螢火螢光素酶基因100編碼，其在病毒生命周期的晚期表達。晚期基因通常以高于其他噬菌體基因的水平表達，因為它們編碼結構蛋白。因此，在圖1所繪的重組噬菌體的實施方案中，將指示基因(即，螢火螢光素酶)插入晚期基因區(qū)中，就在基因10B(主衣殼蛋白)后，并且是包括螢火螢光素酶基因100的構建體。圖1中所繪的構建體設計成在全部3個閱讀框中包括終止密碼子120，以確保螢光素酶不摻入基因10B產物中。此外，如圖1所描繪的，構建體可以包括共有T7晚期啟動子130來驅動螢光素酶基因的轉錄和表達。構建體還可以包括從幾個T7UTR140合成的復合未翻譯區(qū)。這種構建體確保產生可溶性螢火螢光素酶，使得表達不限于噬菌體展示系統(tǒng)中固有的衣殼蛋白的數(shù)量。

如本文中所述，在某些實施方案中，可以優(yōu)選利用已經從環(huán)境中分離的感染原，用于生產本發(fā)明的感染原。以這種方式，可以產生天然衍生的微生物特異性的感染原。

例如，圖2顯示了噬菌體JG04的基因組，JG04是與T4-樣噬菌體(RB69)具有約98％序列同源性的天然噬菌體。在本文的實施例中特別描述了從污水處理廠樣品分離JG04噬菌體。如實施例中討論的，衣殼蛋白，gp23(220)和gp24(230)在晚期基因區(qū)(210)內，由結構基因組成，其編碼病毒粒蛋白。因為這些病毒粒蛋白以非常高的水平表達，預期插入這個區(qū)域中的任何基因具有相似的表達水平，只要使用晚期基因啟動子和/或其他相似控制元件。圖2中描繪的噬菌體構建體具有SEQ ID NO:3中所示的序列。

本發(fā)明的組成可以包括各種感染原和/或指示基因。例如，圖3顯示了攜帶三個不同螢光素酶基因的三個同源重組質粒構建體。制得了三個構建體并與JG04一起用于重組中，以產生本發(fā)明的重組噬菌體。因此，圖3中的上構建體顯示了具有用于螢火螢光素酶同源重組插入JG04的螢火螢光素酶構建體的重組質粒：同源重組質粒pUC57.HR.Fluc，對應于SEQ ID NO.5。圖3中的中間構建體顯示了用于螢光素酶同源重組插入JG04的重組質粒：同源重組質粒pUC57.HR.對應于SEQ ID NO.6；以及圖3中的下構建體顯示了用于Oplophorus螢光素酶同源重組插入JG04中的重組質粒：同源重組質粒pUC19.HR.OpLuc.KanR，對應于SEQ ID NO.7。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的指示基因包括遺傳工程化來包括圖3中顯示的三個構建體中的任一個的JG04。即，包括SEQ ID NO.3的序列的指示噬菌體，進一步包括在SEQ ID NO.3的核苷酸116,555和119,830之間插入的對應于SEQ ID NO.5的核苷酸402-2,973(或其一部分)的其他序列；或SEQ ID NO.6的核苷酸402-1,922(或其一部分)，在本文中的實施例6和11中也稱為指示噬菌體；或SEQ ID NO.7的核苷酸2,241-4,729(或其一部分)，在本文中的實施例7-9中也稱為JG04-OpLuc指示噬菌體。例如，其一部分可以只包括螢光素酶部分(即，SEQ ID NO.5的核苷酸943-2,595；或SEQ ID NO.6的核苷酸943-1.542；或SEQ ID NO.7的核苷酸2,784-3,296)。其一部分可以進一步包括T4晚期啟動子(即，SEQ ID NO.5或NO.6的核苷酸908-936，或SEQ ID NO.7的核苷酸2,749-2,777)。在另一個實施方案中，這樣的指示噬菌體包括在根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)或試劑盒中。本文中所述的方法也利用這樣的指示噬菌體。

圖4描繪了使用圖3中顯示的和實施例6中描述的質粒構建體，從JG04噬菌體的修飾分離重組噬菌體。

在第一個步驟402中，用噬菌體感染用同源重組質粒轉化的細菌，形成具有大約20,000個野生型432:1個重組噬菌體434比例的親本和重組噬菌體混合物的子代噬菌體。將所得到的重組噬菌體混合物稀釋404至96孔平板406中，以獲得平均每個平板3個重組轉導單位(TU)，其對應于每孔約625個大部分野生型噬菌體的傳染單位(IU)。測定96-孔平板的螢光素酶活性，以與含有野生型噬菌體的孔440相比，鑒定含有重組噬菌體的孔436。加入408細菌438；例如，每個孔可以含有約50μL混濁的大腸桿菌O157:H7。這允許噬菌體復制并產生螢光素酶442。在410所示的37℃下孵育2小時后，可以針對螢光素酶442的存在篩選孔。任何陽性孔很可能已經用單個重組噬菌體接種，并且在這個階段，混合物可以含有大約600個野生型噬菌體:1個重組體的比例，高于初始20,000:1比例的富集。在一個實施方案中，可溶性螢光素酶和噬菌體以大約625個野生型:1個重組的比例存在。來自這個富集培養(yǎng)物412的子代可以接受另外的有限稀釋測定414，以證實比例并測定重組噬菌體轉導單位的實際濃度。例如，可以從第一個純化儲液等分414約3個重組TU/96-孔平板416，形成大約～20個大部分野生型噬菌體/孔的接種的第二個稀釋測試平板420。任何陽性的螢光素酶孔很可能已經接種單個重組連同～20個野生型噬菌體?？梢葬槍ξ灩馑孛?42的存在分析這些孔。

添加細菌并孵育(例如，37℃2小時)418后，可溶性螢光素酶和噬菌體以大約20個野生型:1個重組體存在420。最后，可以進行噬菌斑測定422，以篩選表達螢光素酶446的重組體?？梢詥为毺暨x少量單獨的(例如，n＝48)噬菌斑，并針對螢光素酶活性436，在第三個多孔平板上篩選426。在一個實施方案中，這種方法應當確保約3個重組體在待篩選的噬菌斑混合物中。可以從平板取出一個噬菌斑至96-孔平板的每個孔中424，并且進行螢光素酶測試426，以確定哪個孔含有呈現(xiàn)出螢光素酶442活性的噬菌體。證明螢光素酶活性的孔428表示純的重組噬菌體434，而沒有螢光素酶活性的孔430表示純的野生型噬菌體432。

然后可以將單獨的噬菌斑懸浮于緩沖液或培養(yǎng)基中(例如，100μL TMS)，并且將等份試樣(例如，約5μL)加入含有混濁的大腸桿菌O157:H7培養(yǎng)物的孔中，并在孵育后測定(例如，在37℃下約45分鐘至1小時)。預期陽性孔含有純的重組噬菌體培養(yǎng)物。仍然，在某些實施方案中，包括另一輪的噬菌斑純化是優(yōu)選的。

因此，如圖4舉例說明的，通過合適的重組質粒與JG04的同源重組產生的重組噬菌體可以從構成0.005％總噬菌體的混合物分離。分離后，可以進行大規(guī)模生產，以獲得適用于大腸桿菌O157:H7檢測測定中的高滴定度儲液。例如，如本文中的實施例中更詳細描述的，氯化銫等密度梯度離心可以用于從污染熒光素蛋白分離噬菌體顆粒，以降低背景。

以這種方式，并且如以下實施例中更詳細描述的，可以產生具有插入源自環(huán)境的噬菌體中的目標螢光素酶基因(例如，螢火蟲、Oplophorus或工程化螢光素酶，如)的重組噬菌體。

使用感染原檢測微生物的方法

如本文中所述的，在某些實施方案中，本發(fā)明可以包括使用感染原檢測微生物的方法?？梢砸愿鞣N方式來具體說明本發(fā)明的方法。

因此，本發(fā)明的方法利用識別并結合特定目標微生物的結合劑的高特異性，作為擴大信號的手段并由此檢測樣品中存在的低水平微生物(例如，單個微生物)。例如，感染原(例如，噬菌體)特異性地識別特定微生物的表面受體并因此特異性地感染那些微生物。因此，這些感染原可以是用于靶向目標微生物的合適結合劑。本發(fā)明的一些實施方案利用感染原的結合特異性和高水平的遺傳表達能力，用于快速且靈敏地靶向感染并促進目標微生物的檢測。

因此，在一個實施方案中，本發(fā)明可以包括用于檢測樣品中的目標微生物的方法，包括步驟：用感染目標微生物的感染原孵育樣品，其中感染原包括指示基因，使得目標微生物感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物；和檢測指示蛋白產物，其中指示蛋白產物的陽性檢測表示樣品中存在目標微生物。

可以使用各種感染原。在可替換的實施方案中，可以入侵活的細菌、真菌、支原體、原生動物、酵母和其他用顯微鏡可見的活生物體的噬菌體、噬菌體、分枝桿菌噬菌體(如用于TB和paraTB)、真菌噬菌體(如用于真菌)、支原體噬菌體和任何其他病毒。例如，在一個實施方案中，其中目標微生物是細菌，則感染原可以包括噬菌體。如本文中討論的，這樣的噬菌體可以在細菌內部復制，以產生上百個子代細菌。插入噬菌體中的指示基因的檢測可以用作樣品中細菌的測量。例如，充分研究的大腸桿菌的噬菌體包括T1、T2、T3、T4、T5、T7和λ；ATCC保藏中心可獲得的其他大腸桿菌噬菌體，例如，包括phiX174、S13、Ox6、MS2、phiV1、fd、PR772和ZIK1。或者，可以從各種環(huán)境來源分離天然噬菌體?？梢曰谄渲蓄A期發(fā)現(xiàn)目標微生物的位置來選擇用于噬菌體分離的來源。因此，在一些實施方案中，指示噬菌體包括指示部分，并且可以通過擴大的指示部分產生的信號來檢測單個大腸桿菌細胞的感染。因此，該方法可以包括檢測噬菌體復制過程中產生的指示部分，其中指示劑的檢測表示樣品中存在靶細菌。

在一個實施方案中，本發(fā)明可以包括用于檢測樣品中的靶細菌的方法，包括步驟：將樣品與感染靶細菌的重組噬菌體一起孵育，其中重組噬菌體包括插入噬菌體晚期基因區(qū)中的指示基因，使得在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物；和檢測指示蛋白產物，其中指示蛋白產物的陽性檢測表示樣品中存在靶細菌。在一個實施方案中，并且如本文中詳細描述的，檢測的指示部分的量對應于樣品中存在的靶細菌的量。

在一個實施方案中，晚期基因區(qū)是III類基因區(qū)。如本文中更詳細描述的，指示基因插入晚期III類基因區(qū)中可以確保指示基因在細菌中復制時以高數(shù)量表達。

如以上針對本發(fā)明的組合物所述的，噬菌體源自T7、T4、T4-樣、JG04的噬菌體或具有與T7、T4或其他T4-樣噬菌體至少90％同源性的基因組的另一種天然噬菌體。

此外，在某些實施方案中，指示基因不編碼融合蛋白。因此，在某些實施方案中，在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物。

可以使用各種指示部分。在某些實施方案中，指示基因可以編碼螢光素酶。例如，螢光素酶可以是Oplophorus螢光素酶、螢火螢光素酶或工程化螢光素酶中的一種。

如本文中更詳細描述的，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以利用各種感染復數(shù)(MOI)。在某些實施方案中，MOI高于標準測試。這樣相對高的MOI可以允許感染以非常低的量存在于樣品的微生物。例如，在某些實施方案中，用于孵育步驟的噬菌體濃度高于1×10⁷PFU/mL。

在某些實施方案中，重組感染原可以純化，使得不含感染原儲液生產時產生的任何殘余指示劑蛋白。因此，在某些實施方案中，并且如本文中更詳細描述的，在與樣品一起孵育前，可以使用氯化銫等密度梯度離心純化重組噬菌體。感染原是噬菌體時，這種純化可以具有除去不具有DNA的噬菌體(即，空噬菌體)的附加益處。

如以下進一步描述的，在某些實施方案中，該方法可以使用由此濃縮目標微生物或從大量樣品中捕獲目標微生物的步驟。因此，在某些實施方案中，該方法可以包括在孵育步驟前從固體支持物上的樣品捕獲微生物的步驟。

在一些實施方案中，該方法可以包括將固體支持物(例如，磁珠或濾器基質)上捕獲的微生物與多種特異性感染原(例如，指示噬菌體)接觸并允許噬菌體結合并感染細菌。在其他實施方案中，微生物的捕獲對于檢測不是必需的?？梢允褂酶鞣N固體支持物。在某些實施方案中，固體支持物可以包括多孔平板、濾器、珠粒或側流帶、濾帶、濾盤或濾紙，或設計用于培養(yǎng)細胞的薄膜(例如，3M的PetriFilm)。其他固體支持物也可能是合適的。

可以通過使用結合劑從樣品純化目標微生物。例如，在某些實施方案中，捕獲步驟進一步包括用捕獲抗體結合微生物?？贵w可以結合固體支持物來使用。例如，在某些實施方案中，捕獲抗體促進微生物與固體支持物的結合。

本發(fā)明的方法可以包括各種步驟來提高靈敏度。例如，如本文中更詳細討論的，所述方法可以在添加噬菌體之后但在孵育之前包括洗滌捕獲并受感染的微生物的步驟，以除去污染噬菌體制備物的過量親本噬菌體和/或螢光素酶或其他報道蛋白。

與現(xiàn)有技術已知的測試相反，可以不需要培養(yǎng)樣品而完成目標微生物的檢測，培養(yǎng)微生物是作為提高微生物群的一種方式。因此，在某些實施方案中，在比使用富集培養(yǎng)將微生物數(shù)量提高到原來的4-倍或10-倍所需的時間段短的時間內完成目標微生物的檢測。例如，在某些實施方案中，檢測需要的總時間短于6.0小時，5.0小時，4.0小時，3.0小時，2.5小時，2.0小時，1.5小時，1.0小時，45分鐘，或短于30分鐘。

此外，與本領域已知的測試相反，本發(fā)明的方法可以檢測單獨的微生物。因此，在某些實施方案中，所述方法可以檢測樣品中存在的≤10個微生物細胞(即，1，2，3，4，5，6，7，8，9個微生物)。

因此，本發(fā)明的各個方面提供了通過指示部分檢測測定樣品中的微生物的方法。在一些實施方案中，在目標微生物是細菌的情況下，指示部分可以與感染原(如指示噬菌體)相關。指示部分可以與底物反應來發(fā)射可檢測信號或可以發(fā)射固有信號(例如，熒光蛋白)。在一些實施方案中，檢測靈敏度可以揭示測試樣品中少如50，20，10，9，8，7，6，5，4，3或2個目標微生物細胞的存在。在一些實施方案中，甚至單個目標微生物的細胞也可以產生可檢測的信號。

在一些實施方案中，與感染原相關的指示部分可以在感染原復制過程中或之后檢測到。適宜用作指示部分的許多不同類型的可檢測生物分子是本領域已知的，并且許多是商業(yè)上可購得的。在一些實施方案中，指示噬菌體包括酶，其用作指示部分。在一些實施方案中，將指示噬菌體的基因組進行修飾，以編碼可溶性蛋白。在一些實施方案中，指示噬菌體編碼可檢測酶。指示劑可以發(fā)射光和/或可以通過顏色變化來檢測。各種合適的酶是商業(yè)上可購得的，如堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)或螢光素酶(Luc)。在一些實施方案中，這些酶可以用作指示部分。在一些實施方案中，螢火螢光素酶是指示部分。在一些實施方案中，Oplophorus螢光素酶是指示部分。在一些實施方案中，是指示部分。其他工程化的螢光素酶或產生可檢測信號的其他酶也是合適的指示部分。

檢測指示劑可以包括檢測光的發(fā)射。在一些實施方案中，可以使用光度計來檢測指示劑(例如，螢光素酶)。然而，也可以使用其他儀器或設備。例如，分光光度計、CCD相機或CMOS相機可以檢測顏色變化和其他光發(fā)射。

在一些實施方案中，指示噬菌體被遺傳工程化以含有用于酶(如螢光素酶)的基因，其只在噬菌體特異性地識別并感染的細菌感染時才產生。在一些實施方案中，指示部分在病毒生命周期的晚期表達。在一些實施方案中，如本文中所述的，指示劑是可溶性蛋白(例如，可溶性螢光素酶)并且沒有與限制其拷貝數(shù)的噬菌體結構蛋白融合。

在本發(fā)明方法的各種實施方案中，可以不需要從樣品的任何微生物純化來檢測微生物。例如，在某些實施方案中，含有一個或幾個目標微生物的樣品可以直接施加于測定容器，如旋轉柱、微滴定孔或濾器，并且在該測定容器中進行測定。本文中公開了此類測定的各種實施方案。

例如，將包含細菌的等份測試樣品施加于旋轉柱并且用重組噬菌體感染和任選的洗滌以除去任何過量噬菌體后，檢測的可溶性指示劑的含量將與受感染的細菌產生的噬菌體含量成比例。實施例4描述了這樣的測試。

或者，可以將等份的測試樣品直接分配在多孔平板的孔中，加入指示噬菌體，并且在足以感染的時間段后，添加裂解緩沖液以及指示部分的底物(例如，用于螢光素酶指示劑的螢光素酶底物)并進行指示信號的檢測。實施例5-6描述了在濾板上進行的方法的實施方案。本文中的實施例7-9描述了稱為“無濃縮測定”的測定變化形式。

例如，在許多實施方案中，使用多孔平板來進行測定。平板的選擇(或其中可以進行檢測的任何其他溶液)可能影響檢測步驟。例如，一些平板可以包括有色或白色背景，這可能影響光發(fā)射的檢測。一般而言，白色平板具有更高的靈敏度，但也產生較高的背景信號。其他顏色的平板可能產生較低的背景信號，但也具有略低的靈敏度。另外，針對背景信號的一個原因是光從一個孔泄露至另一個鄰近的孔。存在一些具有白色孔但平板的剩余部分是黑色的平板。這允許孔內部的高信號，而且防止孔至孔的光泄露，并且因此可以降低背景。因此，平板或其他測定容器的選擇可能影響該測定的靈敏度和背景信號。

因此，在一些利用指示噬菌體的實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標微生物的方法，包括步驟：捕獲至少一個樣品微生物；將至少一個微生物與多個指示噬菌體一起孵育；允許感染和復制的時間，以產生子代噬菌體并表達可溶性指示部分；和檢測子代噬菌體，或優(yōu)選指示劑，其中指示劑的檢測證明樣品中存在微生物。

例如，在一些實施方案中，可以通過結合平板的表面，或通過噬菌體濾器(例如，0.45μm孔徑旋轉濾器或平板濾器)過濾樣品，來捕獲測試樣品微生物。在一個實施方案中，在最小體積中將感染原(例如，指示噬菌體)直接添加至濾器上的捕獲樣品中。在一個實施方案中，隨后將濾器或平板表面上捕獲的微生物洗滌一次或多次，以除去過量未結合的感染原。在一個實施方案中，添加培養(yǎng)基(例如，Luria-Bertani，在本文中也稱為LB肉湯)，持續(xù)更多孵育時間，以允許噬菌體復制和編碼指示部分的基因的高水平表達。然而，該測定的實施方案的令人驚訝的方面在于孵育步驟只需要足夠用于單個噬菌體生命周期的時間長度。之前認為使用噬菌體的擴大率需要更多時間，使得噬菌體可以復制幾個周期。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，單個復制的指示噬菌體足以促進靈敏且快速的檢測。

當細菌裂解時，可溶性指示劑(例如，螢光素酶)釋放至周圍液體中，其隨后可以被測量和定量。在一個實施方案中，隨后將溶液通過濾器旋轉，并且通過添加針對指示劑酶的底物(例如，螢光素酶底物)，收集用于測試的濾液。因此可以從捕獲固體支持物除去濾液，并在新的容器中(例如，在光度計中)分析，或可以直接在濾器上測量指示信號。

在各種不同的實施方案中，純化的親本指示噬菌體不包括可檢測指示劑自身，因為在用于與測試樣品一起孵育前，親本噬菌體可以被純化。晚期(III類)基因的表達發(fā)生在病毒生命周期的晚期。在本發(fā)明的一些實施方案中，親本噬菌體可以純化，以排除任何現(xiàn)有的指示劑蛋白(例如，螢光素酶)。在一些實施方案中，在宿主細菌感染后子代噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物。因此，在許多實施方案中，不需要在檢測步驟中從子代噬菌體分離出親本。在一個實施方案中，微生物是細菌，并且指示噬菌體是噬菌體。在一個實施方案中，指示部分是可溶性螢光素酶，其在宿主微生物裂解時釋放出來。

因此，在可替換的實施方案中，指示劑底物可以與保持結合濾器或結合平板表面的樣品部分一起孵育。因此，在一些實施方案中，固體支持物是96-孔濾器平板(或常規(guī)96-孔平板)，并且通過將平板直接放入光度計中來檢測底物反應。

例如，在一個實施方案中，本發(fā)明可以包括用于檢測大腸桿菌O157:H7的方法，包括步驟：用能夠在感染時表達螢光素酶的多個親本指示噬菌體感染96-孔濾板上捕獲的細胞；洗掉過量噬菌體，添加LB肉湯并允許噬菌體復制和裂解特定大腸桿菌靶的時間(例如，30-90分鐘)；和通過加入螢光素酶底物并直接在96-孔平板中測量螢光素酶活性來檢測指示劑螢光素酶，其中螢光素酶活性的檢測表示樣品中存在大腸桿菌O157:H7。

在另一個實施方案中，本發(fā)明可以包括用于檢測大腸桿菌O157:H7的方法，包括步驟：用感染時能夠表達螢光素酶的多個親本指示噬菌體感染96-孔平板中的液體溶液或懸浮液中的細胞；允許噬菌體復制并裂解特定大腸桿菌靶的時間(例如，30-90分鐘)；和通過加入螢光素酶底物并直接在96-孔平板中測量螢光素酶活性來檢測指示劑螢光素酶，其中螢光素酶活性的檢測表示樣品中存在大腸桿菌O157:H7。在這樣的實施方案中，不需要捕獲步驟。在一些實施方案中，液體溶液或懸浮液可以是可消費的測試樣品，如蔬菜洗滌液。在一些實施方案中，液體溶液或懸浮液可以是用濃縮LB肉湯或營養(yǎng)肉湯強化的蔬菜洗滌液。在一些實施方案中，液體溶液或懸浮液可以是在LB肉湯中稀釋的細菌。

在一些實施方案中，微生物的裂解可以在檢測步驟之前、之中或之后發(fā)生。實驗表明在一些實施方案中，添加螢光素酶底物時，受感染的未裂解的細胞是可檢測的。據(jù)推測，螢光素酶可能脫離細胞和/或螢光素酶底物可能進入細胞，而沒有完全的細胞溶解。因此，對于利用旋轉濾器系統(tǒng)的實施方案，其中在光度計中只分析釋放至裂解物中的螢光素酶(而不是螢光素酶仍然在完整的細菌內部)，需要裂解來用于檢測。然而，對于利用濾板或96-孔平板和溶液或懸浮液中的樣品的實施方案，其中充滿完整和裂解細胞的初始平板在光度計中直接測定，對于檢測，不需要裂解。

在一些實施方案中，指示部分(例如，螢光素酶)與底物的反應可能持續(xù)30分鐘或更長，并且對于優(yōu)化靈敏度，在不同時間點的檢測可能是理想的。例如，在使用96-孔濾板作為固體支持物和螢光素酶作為指示劑的實施方案中，可以在初始以及以10-或15-分鐘間隔獲取光度計讀數(shù)，直至反應完成。

令人驚訝地，對于感染測試樣品利用高濃度的噬菌體(即，高MOI)成功地實現(xiàn)了在非常短的時間周期中非常少量的目標微生物的檢測。在一些實施方案中，將噬菌體與測試樣品一起孵育只需要足夠用于單個噬菌體生命周期的時間長度。在一些實施方案中，用于此孵育步驟的噬菌體濃度高于7×10⁶，8×10⁶，9×10⁶，1.0×10⁷，1.1×10⁷，1.2×10⁷，1.3×10⁷，1.4×10⁷，1.5×10⁷，1.6×10⁷，1.7×10⁷，1.8×10⁷，1.9×10⁷，2.0×10⁷，3.0×10⁷，4.0×10⁷，5.0×10⁷，6.0×10⁷，7.0×10⁷，8.0×10⁷，9.0×10⁷或10.0×10⁸PFU/mL。

使用這樣的高濃度噬菌體的成功是令人驚訝的，因為大量的噬菌體之前與“自外溶菌作用”相關，其殺滅靶細胞并由此防止從早期噬菌體測試產生有用的信號。可能是本文中所述的制備的噬菌體儲液的清除有助于減輕這個問題(例如，通過氯化銫等密梯度超離心的清除)，因為除了除去任何與噬菌體相關的污染螢光素酶，這種清除也可能除去了菌蛻粒子(具有丟失的DNA的顆粒)。這種菌蛻粒子可以通過“自外溶菌作用”裂解細菌細胞，過早地殺滅細胞并由此防止指示信號的產生。電子顯微鏡證明了粗制JG04裂解物(即，在氯化銫清除之前)具有高于50％的菌蛻。這些菌蛻粒子可以通過刺穿細胞膜的許多噬菌體顆粒的作用引起微生物過早的死亡。因此，菌蛻粒子可能引起之前的問題，其中報道了高PFU濃度是有害的。此外，非常干凈的噬菌體制備允許沒有洗滌步驟而進行測試，這使得無濃縮測定是可能的。

旋轉柱測定

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用產生可溶性螢光素酶的指示噬菌體的策略。在這種方法中，噬菌體(例如，T7、T4或JG04噬菌體)可以被工程化，以在噬菌體復制過程中表達可溶性螢光素酶。螢光素酶的表達通過病毒衣殼啟動子來驅動(例如，噬菌體T7或T4晚期啟動子)，產生高表達。親本噬菌體將不含螢光素酶，因此測試中檢測的螢光素酶必須來自細菌細胞感染過程中子代噬菌體的復制。因此，通常不需要從子代噬菌體分離出親本噬菌體。

在這些實驗中，將至少部分包含待定量大腸桿菌細菌502的樣品500放入旋轉柱濾器中并離心除去LB肉湯，并且加入合適多重性的遺傳工程化來表達可溶性螢光素酶503的T7噬菌體504。可以將感染的細胞孵育足以發(fā)生子代噬菌體復制和細胞溶解的時間(例如，37℃下30-90分鐘)。然后可以收集(例如，通過離心)裂解物中的親本504和子代噬菌體516加游離螢光素酶503，并且使用光度計518定量濾液中的螢光素酶水平?；蛘撸梢允褂酶咄糠椒?，其中將細菌樣品施加于96-孔濾板中，并且進行以上所列的所有操作后，可以直接在初始96-孔濾板中測試螢光素酶，而沒有最終的離心步驟。

來自本發(fā)明實施方案的實例實驗的數(shù)據(jù)顯示于圖6-9中。結果證明本發(fā)明的可替換實施方案利用指示噬菌體通過指示噬菌體感染細菌產生的可溶性螢光素酶的檢測來測試樣品細菌。將作為相對光單位(RLU)校準的指示劑檢測水平相對于從標準過夜菌落形成單位(CFU)測定所確定的細胞濃度進行作圖，并表示為“細胞/測定”，因此證明相似的靈敏度。提高螢光素酶信號對應于提高輸入樣品細胞，證明劑量依賴性響應。

如圖6中所示，本發(fā)明的方法可以證明使用指示噬菌體和旋轉柱濾器，對于靶細菌的檢測的高靈敏度。在這個測定中，通過離心在旋轉濾器上收集測試樣品，并與包括可溶性螢光素酶的基因的指示噬菌體一起孵育(例如，如圖1中所示)。孵育足以感染的時間(例如，室溫下10分鐘)后，可以洗滌濾器并旋轉以除去過量輸入噬菌體?？梢约尤肱囵B(yǎng)基(例如，LB肉湯)并孵育(例如，在37℃下30分鐘)，以允許子代噬菌體的復制和細菌的裂解?？梢栽俅涡D濾器，以除去濾液，其可以轉移至光度計平板，并進行螢光素酶測試(例如，使用光度計，使用螢光素酶測定試劑的注射，Promega，Inc.)?？梢愿鶕?jù)平行CFU測定中的菌落數(shù)量校正細胞計數(shù)。

如圖6中所示，在初始樣品中可以檢測到大約1,700個細菌細胞，并且進一步的連續(xù)稀釋測定可以證明檢測降至平均1.7個細胞，對應于1或2個細胞的實際檢測。這表明少如1至3個大腸桿菌細胞的感染可以通過螢光素酶活性提供可測量的信號。這也表明甚至單個細胞相對于背景的存在或不存在的統(tǒng)計學顯著性(p值＝0.018)。

圖7證明了使用較寬范圍的細胞數(shù)量的連續(xù)稀釋，對于圖5的測試描述的相同方法的非常大的檢測范圍。這表明檢測范圍可以從平均1.4個細胞至1.4千萬個細胞。

濾板測定

如上所述，在某些實施方案中，可以在為滴定測定平板的孔中直接進行測定。例如，圖8證明了使用指示噬菌體，用96-孔濾板用于捕獲和檢測。該方法與以上針對圖5所述的相同，除了整個測試在96-孔濾板中進行，包括螢光素酶反應。與旋轉濾器方法相比，這個實施方案減少了操作和材料。減少的操作和96-孔濾板的使用順從高通量測定情況，并且根據(jù)本發(fā)明的實施方案，適用于與液體操作機器人一起使用。圖8顯示了在這個實施方案中，96-孔濾器平板可以用于檢測單個大腸桿菌細胞(測定平均0.5個細胞，證實約一半的孔接收了單個細胞)、5.4和54個細胞。

圖9證明了在某些實施方案中，使用96-孔系統(tǒng)，對于相同的測定，可以獲得非常大的細胞濃度檢測范圍，從平均少于1個細胞/測定(單個細胞)至至少1.4千萬個細胞/測定。添加螢光素酶底物后不同時間點的多次讀數(shù)可以證明各種各樣的靈敏度。使用15分鐘讀數(shù)獲得了對于檢測<10個細胞的靈敏度，并且在30分鐘讀數(shù)可以獲得降至單個細胞水平的靈敏度。因此，如果不需要檢測數(shù)十個細胞或更少的細胞，可以節(jié)約時間。注意到兩個實驗中響應提高數(shù)量的輸入樣品細胞，信號提高，再次證明了劑量依賴性響應。

圖10描繪了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用修飾的噬菌體檢測靶細菌的濾板測定。利用這種測定的實際實驗描述于實施例6中。簡而言之，可以將包括靶細菌1018的樣品1016加入多孔濾板1004的孔1002中并旋轉1006，以通過從樣品除去液體來濃縮樣品。將遺傳修飾的噬菌體1020加入孔中并與添加的另外的培養(yǎng)基一起孵育，持續(xù)足夠的時間，以用于吸收1008，接著是靶細菌的感染和噬菌體生命周期的進展1010(例如，～45分鐘)。最后，加入螢光素酶底物并與任何存在的螢光素酶反應1024。在光度計1014中測量所得到的發(fā)射，所述光度計檢測螢光素酶活性1026。圖11顯示了來自圖10所繪濾板測定的結果，使用噬菌體來檢測具有已知細胞數(shù)的樣品中的大腸桿菌O157:H7細胞。Student’s t-檢驗表明每個測試0個細胞和1個細胞之間0.034的p值，證明統(tǒng)計學顯著性。

在某些實施方案中，可以進行測定而沒有濃縮捕獲表面上或附近的細菌。圖12說明了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用修飾的噬菌體檢測靶細菌的“無濃縮測定”。將等份的指示噬菌體1214分配至多孔平板1204的單獨孔1202中，然后加入含有細菌1212的測試樣品等份試樣并孵育1206(例如，37℃下45分鐘)，持續(xù)足以使噬菌體復制并產生可溶性指示劑1216(例如，螢光素酶)的時間。然后可以測定1210含有可溶性指示劑和噬菌體的平板孔1208，以測量平板上的指示劑活性1218(例如，螢光素酶測定)。利用這種方法的真正實驗描述于實施例7-9中。在這個實施方案中，測試樣品沒有濃縮(例如，通過離心)，而只是與指示噬菌體一起直接孵育一段時間，并隨后測定螢光素酶活性。

圖13顯示了來自圖12中所繪的無濃縮測定類型測定的結果，使用JG04-OpLuc噬菌體檢測具有低數(shù)量范圍的已知細胞數(shù)的樣品(即，大量稀釋的細胞樣品)中的大腸桿菌O157:H7。如實施例7中所述，這個實驗證明了每個測定0個細胞和1個細胞的信號之間可以看到統(tǒng)計學顯著差異(通過ANOVA檢驗，p值＝0.0024)，證明了檢測單個細胞的能力。因此，該測定是令人驚訝地靈敏的。具有每孔少于1個細胞的樣品似乎顯示出高于背景信號的成比例的孔數(shù)。

圖14顯示了來自無濃縮測定的結果，使用JG04-OpLuc噬菌體檢測具有非常低至非常高數(shù)量范圍的已知細胞數(shù)的樣品(即，含有少于1個細胞/測定至上百萬個細胞的樣品)中的大腸桿菌O157:H7。如實施例8中所述，這個實驗證明了來自每個測定0個細胞和1.1個細胞的信號之間的統(tǒng)計學顯著差異(p值＝0.000702，Student’s t-檢驗)，證明了檢測單個細胞的能力。每個測定更多個細菌細胞表明信號以劑量依賴性方式遞增，高達至少10⁶個細菌細胞/測定，令人驚訝地證明了非常寬的檢測范圍。

圖15顯示了來自無濃縮測定的結果，如實施例9中所述的，使用JG04-OpLuc噬菌體檢測具有已知細胞數(shù)量的蔬菜洗滌樣品中的大腸桿菌O157:H7。

為了制備蔬菜洗滌液，將蔬菜葉(例如，菠菜或生菜)稱重并加入干凈的塑料袋中。每克(g)蔬菜加入一mL LB(+/-0.01-0.05％Tween20)。將葉子和溶液手動混合幾分鐘。然后從塑料袋中提取液體并用作“蔬菜洗滌液”。使用這種方法，發(fā)現(xiàn)在單片菠菜葉(1-2g)上存在～1百萬個細菌。

測試是定量的，因為檢測的信號與樣品中的目標微生物的量成比例。例如，在圖15中所繪的實驗中，將已知數(shù)量的大腸桿菌O157:H7細胞加入蔬菜洗滌液樣品中，以刺激植物被致病細菌污染。使用蔬菜洗滌液樣品的實驗證明了來自每個測定0個細胞和3個細胞的信號之間的顯著差異，證明了檢測蔬菜洗滌液中個位數(shù)細胞數(shù)量的能力。每個測定使用更多細菌細胞顯示出信號以劑量依賴性方式遞增。蔬菜洗滌液含有約10⁶個非靶細菌/mL，對應于這個測定中每個樣品至少10⁵個非靶細菌(包括0個大腸桿菌O157:H7對照)。分辨來自10⁵個非靶細菌的少如3個靶細菌細胞的能力是令人驚訝的，并再次證明了測試的特異性。

暴露于感染原前的微生物捕獲

在一些實施方案中，本發(fā)明包括不需要捕獲微生物步驟的方法和系統(tǒng)。其他實施方案允許從樣品物理分離細菌細胞。本文中所述的方法可以用作促進樣品中存在的低水平微生物(例如，單個微生物)檢測的手段。捕獲步驟可以基于特定的結合劑，如識別目標微生物的抗體，或可以基于針對微生物的其他特征的選擇，如大小分級。

在一些實施方案中，基于分子特異性(例如，大小)以外的其他物理特征來捕獲微生物。在一些實施方案中，本發(fā)明利用微生物的物理大小將其捕獲在固體支持物上。在一些實施方案中，固體支持物是濾器。例如，將樣品通過細菌濾器(例如，0.45μm孔徑旋轉濾器)過濾允許較小的物質通過，而保留完整的細菌?；蛘?，可以使用板濾來捕獲微生物，或可以使用各種其他濾器設備(例如，96-孔濾板)。

例如，所述方法可以包括收集固體支持物上的微生物的步驟，如例如，將樣品通過細菌濾器過濾?；诖笮〔东@后，可以使用任何特異性靶向目標微生物的結合劑。例如，可以用捕獲的微生物孵育感染原，以特異性地靶向和鑒定目標微生物?？梢允褂梅蛛x樣品中的微生物的其他方法。在一些實施方案中，檢測步驟可以在這樣的捕獲步驟之前、同時或之后進行。

在一些實施方案中，可以使用對目標微生物具有高特異性的結合劑，作為促進樣品中存在的低水平微生物(例如，單個微生物)的特異性捕獲的手段。在一些實施方案中，待測試的大體積液體樣品可能需要在進一步測試前有效地濃縮。

例如，單個細菌，其可能具有約一立方微米的體積，可以從具有10¹²立方微米體積的一微升樣品中分離出來。在這樣的實施方案中，捕獲步驟可以包括將樣品接觸多個(過量)的親和性純化捕獲抗體或抗體片段。

一些實施方案利用相對特定目標微生物的表面上發(fā)現(xiàn)的抗原分子產生的親和性純化的和/或反向純化的表面特異性抗體或抗體片段。這樣的抗體或抗體片段可以特異性地鑒定用于捕獲或檢測目的或兩者的微生物。證明對各種細菌或其他微生物上的表面抗原特異性識別的抗體可以從各種來源商業(yè)購得，如Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.(KPL)或Abcam。

在本發(fā)明的一些實施方案中，識別特定微生物(例如，大腸桿菌O157:H7)的微生物表面抗原的親和性純化和/或反向純化的表面特異性抗體不識別其他相似的微生物(例如，大腸桿菌B)。在一些實施方案中，對例如大腸桿菌B或大腸桿菌O157:H7特異性的抗體不識別鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的細胞。這表示另一種令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，因為許多細菌具有例如表面脂多糖(革蘭氏陰性細菌)或脂磷壁酸(革蘭氏陽性細菌)分子，之前認為是高度相似的，尤其是在密切相關的種之間。

本文中公開的用于基于抗體的捕獲的方法適用于其沒有與其他微生物交叉反應的表面特異性抗體是可利用的任何靶細菌或其他微生物(例如，致病微生物)。

例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的捕獲步驟可以使用微生物特異性的捕獲抗體或抗體片段，以促進微生物的捕獲。在一些實施方案中，捕獲抗體可以與結合連接固體支持物(例如，珠粒或平板表面)的另一種結合劑的化學部分綴合。例如，在一些實施方案中，捕獲抗體可以生物素化，以促進與結合固體支持物的抗生物素蛋白鏈菌素結合。在一些實施方案中，固體支持物包括磁珠。在其他實施方案中，固體支持物包括平板表面或多孔平板(例如，ELISA平板)的表面。例如，ELISA平板可以覆蓋特異性識別目標微生物的抗體。

在某些實施方案中，可以通過微生物與隨后結合固體支持物的游離捕獲抗體或抗體片段的結合，將微生物從樣品的其他成分中分離出來。在一些實施方案中，捕獲抗體或抗體片段包括結合第二種試劑(例如，抗生物素蛋白鏈菌素)的結合劑(例如，生物素)，所述第二種試劑結合固體支持物。

在一些實施方案中，例如，如果用生物素標記捕獲抗體，該方法可以進一步包括使樣品與多個磁性抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的珠粒接觸，以結合細菌-抗體復合物，并且用磁鐵捕獲珠粒-抗體-細菌復合物，以分離細菌?；?，可以使用純化生物素-抗體:細菌復合物的其他方法。使用這樣的實施方案，一毫升樣品中的細菌可以濃縮至一微升(～1000倍)，有利于通過本文中所述的方法進一步檢測和/或定量。

因此，在一些實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標微生物的方法，其中捕獲步驟包括從樣品中的其他組分中特異性地分離微生物。

或者，在一些實施方案中，捕獲步驟可以基于目標微生物的其他特征，如大小。在利用基于大小捕獲的實施方案中，固體支持物可以是旋轉柱濾器。在一些實施方案中，固體支持物包括96-孔濾板?；颍糜诓东@的固體支持物可以是陣列或移動支持物(如珠粒)上的一個位置。

因此，在一些實施方案中，可以使用上述方法，在檢測之前，從大的體積中捕獲并分離目標微生物。例如，可以使用捕獲抗體或抗體片段的屬性來特異性地分離微生物。在一些實施方案中，捕獲抗體是生物素化的，使得其有利于隨后細胞-抗體復合物與磁性抗生物素蛋白鏈菌素珠粒的結合?；?，捕獲抗體可以與另一種蛋白質或其他分子綴合，其有利于珠?；蛄硪环N固體支持物上的捕獲。這樣的實施方案可以提供提高的靈敏度，特別是在初始樣品體積大的情況下。因此，所述方法可以包括連接多個可以特異性地結合目標微生物上的表面抗原的結合劑的步驟，其由此有利于結合捕獲固體支持物。

或者，可以使用結合抗細菌抗體的另一個化學部分來覆蓋磁珠。例如，可以使用識別或結合抗細菌抗體的二抗覆蓋的珠粒。然后可以分離結合珠粒的細菌。在一個實施方案中，可以通過將結合的細菌涂覆在珠粒和未結合的上清液級分并計數(shù)所得到的菌落(CFU)來定量捕獲的效率。在其他實施方案中，測量通過與底物(即，用于指示部分的底物試劑)反應產生的信號，用于檢測。

在一些實施方案中，使用固體支持物上的特異性捕獲證明了抗體的特異性。本發(fā)明的一種方法包括通過使用具有微生物特異性的結合劑的基質從樣品獲得和濃縮微生物(例如，細菌)的步驟。在一個實施方案中，將結合劑固定于固體支持物上(例如，磁珠)，或是游離的并隨后固定于固體支持物上。然后從樣品取出固定的微生物(例如，通過分離、潷析、磁力或其他合適的分離技術)并通過各種技術來檢測。

圖16描繪了通過使用相對完整大腸桿菌O157:H7產生的抗體從樣品特異性捕獲大腸桿菌O157:H7而不是大腸桿菌B或鼠傷寒沙門氏菌的實例實施方案。因此，在某些實施方案中，用抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的磁珠可以用于分離用生物素化的多克隆抗體(KPL)預先孵育的大腸桿菌O157:H7，所述抗體親和性純化和反向純化，以最小化與其他微生物物種的交叉反應性。在某些實施方案中，使用特異性的大腸桿菌O157:H7抗體時，捕獲級分(即，珠粒級分)中只存在大腸桿菌O157:H7，并且在上清液(未結合)級分中將沒有收集到細菌。在某些實施方案中，使用大腸桿菌O157:H7特異性抗體時，在上清液級分中只發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌B和鼠傷寒沙門氏菌，說明這些抗體的顯著特異性。在不存在抗體的情況下，在上清液級分中發(fā)現(xiàn)了所有三種類型的細菌。

雜合免疫噬菌體(HIP)測定

在某些實施方案中，本發(fā)明的方法結合使用了結合劑(例如，抗體)，以除了用感染原檢測以外從樣品純化和/或濃縮目標微生物。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測樣品中的目標微生物的方法，包括步驟：使用目標微生物特異性的捕獲抗體從之前的支持物上的樣品捕獲微生物；將樣品與感染目標微生物的重組噬菌體一起孵育，其中重組噬菌體包括插入噬菌體晚期基因區(qū)中的指示基因，使得在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物；并檢測指示蛋白產物，其中指示蛋白產物的陽性檢測表示樣品中存在目標微生物。

例如，圖17描繪了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用修飾的噬菌體檢測靶細菌的雜合免疫噬菌體(HIP)測試。首先將樣品施加于覆蓋了細菌特異性抗體1702的微滴定平板孔中。然后將平板離心以促進細菌與捕獲抗體1704的結合。足夠時間以允許完全細菌捕獲后，將含有細菌特異性的-噬菌體的溶液加入每個樣品1706中。與噬菌體一起孵育導致單個或多個噬菌體結合和連接捕獲的細菌1708。最后，孵育樣品，以促進噬菌體復制和螢光素酶表達，其導致細胞溶解和可溶性螢光素酶1710的釋放。

圖18顯示了來自HIP測定的結果，如實施例11中所述的，使用噬菌體來檢測具有對數(shù)規(guī)模的已知細胞數(shù)的樣品中的大腸桿菌O157:H7。HIP測定能夠用大約2×10⁶個PFU噬菌體檢測LB培養(yǎng)基中的100和1,000個大腸桿菌O157:H7。超過無細胞樣品的平均信號范圍從100個細胞樣品的大約50倍至1,000個細胞樣品的超過1,000倍。

在一些實施方案中，本文中所述方法的孵育步驟包括高于7×10⁶，8×10⁶，9×10⁶，1.0×10⁷，1.1×10⁷，1.2×10⁷，1.3×10⁷，1.4×10⁷，1.5×10⁷，1.6×10⁷，1.7×10⁷，1.8×10⁷，1.9×10⁷，2.0×10⁷，3.0×10⁷，4.0×10⁷，5.0×10⁷，6.0×10⁷，7.0×10⁷，8,0×10⁷，9.0×10⁷或1.0×10⁸PFU/mL的最終噬菌體濃度。之前認為這種高噬菌體濃度對于這樣的測定是有害的，并且因此產生令人驚訝的結果。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法需要少于3小時、少于2.5小時、少于2小時、少于1.5小時或少于1小時，用于檢測目標微生物。在一些實施方案中，所述方法可以檢測少如100，50，20，10，9，8，7，6，5，4，3或2個目標微生物細胞。這些是比之前認為可能的更短時間周期。在一些實施方案中，甚至單個微生物細胞也是可檢測的。在其他實施方案中，本發(fā)明包括系統(tǒng)(例如，計算機系統(tǒng)、自動化系統(tǒng)或試劑盒)，其包括用于進行本文中公開的方法和/或使用本文中修飾的感染原的組成部分。

本發(fā)明的系統(tǒng)和試劑盒

在一些實施方案中，本發(fā)明包括系統(tǒng)(例如，自動化系統(tǒng)或試劑盒)，其包括用于進行本文中公開的方法的組成部分。鑒于進行所述方法需要少量的試劑和材料，本文中所述的一些實施方案特別適用于自動化或試劑盒。在某些實施方案中，試劑盒的每個組成部分可以包括可以從第一個位點傳送至第二個位點的自包含單元。

在一些實施方案中，本發(fā)明包括用于快速檢測樣品中的目標微生物的系統(tǒng)或試劑盒。在某些實施方案中，所述系統(tǒng)或試劑盒包括將樣品與目標微生物特異性的感染原一起孵育的組成部分和用于檢測指示部分的組成部分，其中感染原包括指示部分。在本發(fā)明的系統(tǒng)和試劑盒的一些實施方案中，感染原是感染目標微生物的重組噬菌體，并且重組噬菌體包含插入噬菌體的晚期基因區(qū)中的指示基因作為指示部分，使得在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性的指示蛋白產物。一些系統(tǒng)進一步包括用于捕獲固體支持物上的目標微生物的組成部分。

在某些實施方案中，系統(tǒng)和/或試劑盒可以進一步包括用于洗滌捕獲的微生物樣品的組成部分。另外地或替換地，系統(tǒng)和/或試劑盒可以進一步包括用于測定指示部分的量的組成部分，其中檢測的指示部分的的量對應于樣品中的微生物的量。例如，在某些實施方案中，系統(tǒng)或試劑盒可以包括用于測量螢光素酶活性的光度計或其他設備。

在一些系統(tǒng)和/或試劑盒中，相同的組成部分可以用于多個步驟。在一些系統(tǒng)和/或試劑盒中，步驟是自動化的或通過使用者經由計算機輸入來控制和/或其中液體操作機器人進行至少一個步驟。

因此，在某些實施方案中，本發(fā)明可以包括用于快速檢測樣品中的目標微生物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：用于將樣品與目標微生物特異性的感染原一起孵育的組成部分，其中感染原包括指示部分；用于從固體支持物上的樣品捕獲微生物的組成部分；用于洗滌捕獲的微生物樣品以除去未結合的感染原的組成部分；和用于檢測指示部分的組成部分。在一些實施方案中，相同組成部分可以用于捕獲和/或孵育和/或洗滌的步驟。一些實施方案另外包括用于測定樣品中的目標微生物的量的組成部分，其中檢測的指示部分的量對應于樣品中的微生物的量。這樣的系統(tǒng)可以包括與以上針對快速檢測微生物方法描述的那些類似的各種實施方案和子實施方案。在一個實施方案中，微生物是細菌，并且感染原是噬菌體。在計算機化的系統(tǒng)中，系統(tǒng)可以全自動化、半自動化或由使用者通過計算機指引(或其一些組合)。

在一些實施方案中，系統(tǒng)可以包括用于從樣品中的其他組分分離出目標微生物的組成部分。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種包括用于檢測目標微生物的組成部分的系統(tǒng)，其包括：用于從樣品中的的其他組分分離出目標微生物的組成部分；用于用多個親本感染原感染至少一個微生物的組成部分；用于裂解至少一個受感染微生物以釋放微生物中存在的子代感染原的組成部分；和用于檢測子代感染原或子代感染原組分的組成部分，其中感染原或感染原組分的檢測表示樣品中存在微生物。

系統(tǒng)可以包括用于檢測子代感染原的各種組成部分。例如，在一個實施方案中，子代感染原(例如，噬菌體)可以包括指示部分。在一個實施方案中，子代感染原(例如，噬菌體)中的指示部分可以是在復制過程中表達的可檢測部分，如可溶性螢光素酶蛋白。

在其他實施方案中，本發(fā)明可以包括用于快速檢測樣品中的目標微生物的試劑盒，該系統(tǒng)包括：用于將樣品與目標微生物特異性的感染原一起孵育的組成部分，其中感染原包括指示部分；用于從固體支持物上的樣品捕獲微生物的組成部分；用于洗滌捕獲的微生物樣品以除去未結合的感染原的組成部分；和用于檢測指示部分的組成部分。在一些實施方案中，相同的組成部分可以用于捕獲和/或孵育和/或洗滌的步驟。一些實施方案另外包括擴用于測定樣品中的目標微生物量的組成部分，其中檢測的指示部分的量對應于樣品中的微生物量。這樣的試劑盒可以包括與以上針對快速檢測微生物的方法描述的那些類似的各種實施方案和子實施方案。在一個實施方案中，微生物是細菌，并且感染原是噬菌體。

在一些實施方案中，試劑盒可以包括用于從樣品中的其他組分中分離目標微生物的組成部分。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括包括用于檢測目標微生物的組成部分的試劑盒，其包括：用于從樣品中的其他組分中分離出至少一個微生物的組成部分；用于用多個親本感染原感染至少一個微生物的組成部分；用于裂解至少一個受感染的微生物以釋放微生物中存在的子代感染原的組成部分；和用于檢測子代感染原或子代感染原的組分的組成部分，其中感染原或感染原的組分的檢測，表示樣品中存在微生物。

試劑盒可以包括用于檢測子代感染原的各種組成部分。例如，在一個實施方案中，子代感染原(例如，噬菌體)可以包括指示部分。在一個實施方案中，子代感染原(例如，噬菌體)中的指示部分可以是在復制過程中表達的可檢測部分，如可溶性螢光素酶蛋白。

本發(fā)明的這些系統(tǒng)和試劑盒包括各種組成部分。如本文中使用的，術語“組成部分”寬泛限定，并且包括適用于進行所述方法的任何合適的裝置或裝置的集合。組成部分不需要以任何特定方式相對于彼此完整地連接或安置。本發(fā)明包括相對于彼此任何合適的組成部分的排列。例如，組成部分不需要在同一個房間中。但在一些實施方案中，組成部分在成套機組中彼此連接。在一些實施方案中，相同的組成部分可以進行多個功能。

計算機系統(tǒng)和計算可讀介質

本發(fā)明或其任何組成部分中所述的系統(tǒng)可以以計算機系統(tǒng)的形式來具體說明。計算機系統(tǒng)的典型實例包括通用計算機、程序化微處理器、微控制器、外周集成電路元件和能夠執(zhí)行組成本發(fā)明技術方法的步驟的其他設備或設備的排列。

計算機系統(tǒng)可以包括計算機、輸入裝置、顯示單元和/或互聯(lián)網(wǎng)。計算機可以進一步包括微處理器。微處理器可以連接通訊總線。計算機還可以包括存儲器。存儲器可以包括隨機存取存儲器(RAM)和只讀存儲器(ROM)。計算機系統(tǒng)可以進一步包括存儲設備。存儲設備可以是硬盤驅動器或可移動存儲設備，如軟盤驅動器、光盤驅動器等。存儲設備還可以是用于將計算機程序或其他指令加載至計算機系統(tǒng)中的其他相似裝置。計算機系統(tǒng)還可以包括通訊單元。通訊單元允許計算機通過I/O界面連接其他數(shù)據(jù)庫和互聯(lián)網(wǎng)。通訊單元允許將數(shù)據(jù)轉移至其他數(shù)據(jù)庫，以及從其他數(shù)據(jù)庫接收數(shù)據(jù)。通訊單元可以包括調制解調器、以太網(wǎng)卡或能夠使計算機系統(tǒng)連接數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡的任何相似設備，如LAN、MAN、WAN和互聯(lián)網(wǎng)。計算機系統(tǒng)因此有利于從使用者通過輸入設備輸入，通過I/O界面進入系統(tǒng)。

計算設備通常將包括提供用于一般管理和計算設備操作的可執(zhí)行程序指令的操作系統(tǒng)，并且通常將包括存儲指令的計算機可讀存儲介質(例如，硬盤、隨機存取存儲器、只讀存儲器等)，當通過服務器的處理器執(zhí)行時，所述指令允許計算設備進行其預定的功能。用于計算設備的操作系統(tǒng)和一般功能性的合適指令是已知的或商業(yè)可購得的，并且容易由本領域普通技術人員來執(zhí)行，特別是根據(jù)本文中的公開內容。

計算機系統(tǒng)執(zhí)行一套存儲在一個或多個存儲元件中的指令，以處理輸入數(shù)據(jù)。存儲元件還可以按照需要容納數(shù)據(jù)或其他信號。存儲元件可以是處理器中存在的信息源或物理存儲元件的形式。

環(huán)境可以包括如上討論的各種數(shù)據(jù)存儲以及其他存儲器和存儲介質。這些可以停留在各種位置，如一個或多個計算機本地(和/或存在于內部)的存儲介質或通過網(wǎng)絡遠程來自任一個或全部計算機。在特定組的實施方案中，信息可以存在于本領域技術人員熟悉的存儲區(qū)網(wǎng)絡(“SAN”)。相似地，用于進行歸屬于計算機、服務器或其他網(wǎng)絡設備的功能的任何所需文件可以本地和/或遠程存儲，按照需要。在系統(tǒng)包括計算設備的情況下，每個這樣的設備可以包括可以通過總線電耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一個中央處理單元(CPU)、至少一個輸入設備(例如，鼠標、鍵盤、控制器、觸摸屏或小鍵盤)和至少一個輸出設備(例如，顯示設備、打印機或揚聲器)。這樣的系統(tǒng)還可以包括一個或多個存儲設備，如盤驅動器、光存儲設備和固態(tài)存儲設備，如隨機存取存儲器(“RAM”)或只讀存儲器(“ROM”)，以及可移動介質設備、存儲卡、閃卡等。

這樣的設備還可以包括如上所述的計算機可讀存儲介質閱讀器、通訊設備(例如，調制解調器、網(wǎng)卡(無線或有線)、紅外通訊設備等)和工作存儲器。計算機可讀存儲介質閱讀器可以連接計算機可讀存儲介質或配置成接收計算機可讀存儲介質，所述存儲介質表示遠程、本地、固定的和/或可移動的存儲設備以及用于臨時和/或更多永久含有、存儲、傳輸和接收計算機可讀信息的存儲介質。系統(tǒng)和各種設備通常還將包括各種軟件應用、模塊、服務器或位于至少一個工作存儲設備內的其他元件，包括操作系統(tǒng)和應用程序，如客戶應用或Web瀏覽器。應當認識到可替換的實施方案可以具有來自上述的各種變化。例如，還可以使用定制硬件和/或硬件、軟件(包括便攜式軟件，如applet)或兩者中可以執(zhí)行特定元件。此外，可以使用與其他計算設備(如網(wǎng)絡輸入/輸出設備)的連接。

用于包含編碼或編碼的一部分的非瞬態(tài)存儲介質和計算機可讀介質可以包括本領域已知或使用的任何合適介質，包括存儲介質和通訊介質，如但不限于在任何方法或技術中執(zhí)行的易變和非易變、可移動和不可移動的用于信息(如，計算機可讀指令、數(shù)據(jù)結構、程序模塊或其他數(shù)據(jù))的存儲和/或傳送的介質，包括RAM、ROM、EEPROM、閃存或其他存儲技術、CD-ROM、數(shù)字通用光盤(DVD)或其他光學存儲、磁盒、磁帶、磁盤存儲或其他磁存儲設備，或任何其他可以用于存儲所需信息并可以由系統(tǒng)設備存取的介質?；诒疚闹刑峁┑墓_內容和教導，本領域普通技術人員將認識到用于實施各種實施方案的其他方式和/或方法。

計算機可讀介質可以包括，但不限于，能夠給處理器提供計算機可讀指令的電、光、磁或其他存儲設備。其他實例包括，但不限于，軟盤、CD-ROM、DVD、磁盤、存儲芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、內容可尋址存儲器(“CAM”)、DDR、閃存，如NAND閃存或NOR閃存、ASIC、配置的處理器、光存儲、磁帶或其他磁存儲，或從其計算處理器可以閱讀指令的任何其他介質。在一個實施方案中，計算設備可以包括單種類型的計算機可讀介質，如隨機存取存儲區(qū)(RAM)。在其他實施方案中，計算設備可以包括兩種或更多種類型的計算機可讀介質，如隨機存取存儲器(RAM)、盤驅動器和快速緩沖存儲區(qū)。計算設備可以聯(lián)通一個或多個外部計算機可讀介質，如外部硬盤驅動器或外部DVD驅動器。

如以上討論的，所述實施方案包括配置成執(zhí)行計算機可讀程序指令和/或存取存儲器中儲存的信息的處理器。指令可以包括由匯編者和/或解釋器從以任何合適的計算機編程語言書寫的代碼產生的處理器特異性的指令，所述編程語言包括，例如，C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems，Mountain View，Calif.)。在一個實施方案中，計算設備包括單個處理器。在其他實施方案中，設備包括兩個或更多個處理器。這樣的處理器可以包括微處理器、數(shù)字信號處理器(DSP)、專用集成電路(ASIC)、現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)和狀態(tài)機。這樣的處理器可以進一步包括可編程的電子設備，如PLC、可編程中斷控制器(PIC)、可編程邏輯設備(PLD)、可編程只讀存儲器(PROM)、電可編程只讀存儲器(EPROM或EEPROM)，或其他相似的設備。

計算設備包括網(wǎng)絡界面。在一些實施方案中，網(wǎng)絡界面配置成通過有線或無線通訊鏈接來通訊。例如，網(wǎng)絡界面可以允許通過以太網(wǎng)、IEEE802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、藍牙、紅外等通過網(wǎng)絡通訊。作為另一個實例，網(wǎng)絡界面允許通過如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窩通信網(wǎng)絡這樣的網(wǎng)絡來通訊。在一些實施方案中，網(wǎng)絡界面允許與另一個設備點對點連接，如通過通用串行總線(USB)、1394FireWire、串聯(lián)或并聯(lián)，或相似界面。合適的計算設備的一些實施方案可以包括兩個或更多個網(wǎng)絡界面，用于通過一個或多個網(wǎng)絡通訊。在一些實施方案中，除了網(wǎng)絡界面以外或替代網(wǎng)絡界面，計算設備可以包括數(shù)據(jù)存儲。

合適的計算設備的一些實施方案可以包括各種外部或內部設備或與各種外部或內部設備聯(lián)通，所述設備如鼠標、CD-ROM、DVD、鍵盤、顯示器、揚聲器、一個或多個麥克風，或任何其他輸入或輸出設備。例如，計算設備可以與各種使用者界面設備和顯示器聯(lián)通。顯示器可以使用任何合適的技術，包括，但不限于，LCD、LED、CRT等。

用于通過計算機系統(tǒng)執(zhí)行的指令組可以包括命令處理器執(zhí)行特定任務(如組成本發(fā)明技術的方法的步驟)的各種要求。指令組可以是軟件程序的形式。此外，軟件可以是分開的程序的集合、具有較大程序的程序模塊或程序模塊的一部分的形式，如在本文中的技術中。軟件還可以包括面向目標變成形式的模塊編程。通過處理器的輸入數(shù)據(jù)的處理可以是響應使用者要求、之前處理的結果或由另一個處理器形成的要求。

盡管已經關于某些實施方案公開了本發(fā)明，但所述實施方案的多種修改、變化和改變都是可能的，而沒有脫離所附權利要求中限定的本發(fā)明的范圍和精神。因此，認為本發(fā)明不限于所述的實施方案，而是具有由以下權利要求的語言限定的完整范圍及其等價體。

本文中所述技術的一些實施方案可以根據(jù)以下編號段落中的任何一個來限定：

(1)重組噬菌體，包括插入噬菌體晚期基因區(qū)中的指示基因，和任選其中晚期基因是III類基因區(qū)，和任選其中指示基因的轉錄由噬菌體III類或“晚期”啟動子來控制。

(2)段落1的重組噬菌體，其中噬菌體源自T7、T4、T4-樣、JG04的噬菌體或具有與T7、JG04、T4或其他T4-樣噬菌體具有至少90％同源性的基因組的另一種天然噬菌體；和/或其中檢測的指示部分的量對應于樣品中存在的目標微生物的量。

(3)段落1-2中任一個的噬菌體，其中指示基因不編碼融合蛋白和/或其中指示基因鄰近主要衣殼基因，和任選其中宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物。

(4)段落1-3中任一個的噬菌體，其中指示基因編碼螢光素酶，和任選其中螢光素酶是Oplophorus螢光素酶、螢火螢光素酶或工程化螢光素酶中的一種。

(5)一種檢測樣品中的目標微生物的方法，包括步驟：將樣品與感染目標微生物的重組噬菌體一起孵育，其中重組噬菌體包括插入噬菌體晚期基因區(qū)中的指示基因，使得在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物；和檢測指示蛋白產物，其中指示蛋白產物的陽性檢測表示樣品中存在目標微生物。

(6)段落5的方法，其中晚期基因區(qū)是III類基因區(qū)，和任選其中指示基因的轉錄受噬菌體III類啟動子的控制。

(7)段落5或6的方法，其中噬菌體源自T7、T4、T4-樣、JG04或具有與T7、T4或其他T4-樣噬菌體具有至少90％同源性的基因組的另一種天然噬菌體；和/或其中檢測的指示部分的量對應于樣品中存在的目標微生物的量。

(8)段落5-7中任一個的方法，其中指示基因不編碼融合蛋白和/或其中指示基因鄰近主要衣殼基因，和任選其中宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示基因的表達形成可溶性指示蛋白產物。

(9)段落5-8中任一個的方法，其中指示基因編碼螢光素酶，和熱選其中螢光素酶是Oplophorus螢光素酶、螢火螢光素酶或工程化螢光素酶中的一種。

(10)段落5-9中任一個的方法，其中用于孵育步驟的噬菌體濃度高于1×10⁷PFU/mL，和任選其中在與樣品一起孵育之前使用氯化銫等密度梯度離心來純化重組噬菌體。

(11)段落5-10中任一個的方法，進一步包括在孵育步驟前從固體支持物上的樣品捕獲微生物的步驟；和任選其中固體支持物包括多孔平板或濾器；和任選其中捕獲步驟進一步包括用捕獲抗體結合微生物；和任選其中捕獲抗體有利于微生物與固體支持物的結合；和任選其中該方法進一步包括在添加噬菌體后而在孵育前，用于洗滌捕獲和感染的微生物的步驟，以除去過量的噬菌體和/或污染報道蛋白，如螢光素酶。

(12)段落5-11任一個的方法，其中在短于使用富集培養(yǎng)將微生物的數(shù)量提高至原來的4-倍或10-倍所需的時間段的時間中完成目標微生物的檢測；和任選其中該方法可以檢測樣品中≤10微生物細胞，和任選其中用于檢測所需的總時間少于2小時。

(13)一種用于快速檢測樣品中的目標微生物的系統(tǒng)，包括：用于用目標微生物特異性的感染原孵育樣品的組成部分，其中感染原包括指示部分；和用于檢測指示部分的組成部分；和任選進一步包括用于測定樣品中的目標微生物的量的組成部分，其中檢測的指示部分的量對應于樣品中微生物的量；和任選進一步包括用于捕獲固體支持物上的目標微生物的組成部分，和/或進一步包括用于洗滌捕獲的微生物樣品的組成部分，和任選其中相同的組分可以用于多個步驟。

(14)段落13的系統(tǒng)，其中感染原是感染目標微生物的重組噬菌體，其中重組噬菌體包括插入噬菌體晚期基因區(qū)中的指示基因，作為指示部分，使得在宿主細菌感染后噬菌體復制過程中指示劑的表達形成可溶性指示蛋白產物；和任選其中步驟是自動化的或通過使用者經由計算機輸入來控制和/或其中液體操作機器人進行至少一個步驟；或其中系統(tǒng)包括試劑盒。

(15)用于與段落5-12任一個的方法和/或段落13-14任一個的系統(tǒng)一起使用的非瞬態(tài)計算機可讀介質。

實施例

以下實施例中描述的結果，除了實施例11，是沒有富集培養(yǎng)或沒有孵育樣品以實現(xiàn)樣品細胞復制而獲得的。此外，在“無濃縮測定”中，指示噬菌體直接加入樣品中，沒有濃縮細胞，可以感染和檢測少量細胞，甚至單個細菌。

實施例1.指示噬菌體的形成

使用來自Millipore，Inc.的415-1噬菌體展示系統(tǒng)形成了指示噬菌體。簡而言之，購買純化的DNA并用DNA限制酶EcoRI和HindIII(New England Biolabs)消化，并隨后純化切割的DNA。用噬菌體T7上游區(qū)，包括晚期T7啟動子，合成了用于野生型螢火螢光素酶(來自常見的東方螢火蟲，Photinus pyralis)的基因，以確保螢光素酶基因的高水平表達。

合成的螢光素酶基因命名為SEQ ID NO.1。通過PCR擴增這個基因，以包括用于EcoRI和HindIII的相容性限制酶識別位點，來確保新基因可以插入415-1基因組中，使用以下引物：

TATCTGAATTCTAAGTAACTGATAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAAC，命名為SEQ ID NO.2，和

AATGA AAGCTTTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG，命名為SEQ ID NO.3。

另外，在螢光素酶起始位點的上游添加所有3個閱讀框中的終止密碼子，以終止噬菌體主要衣殼蛋白(基因10B產物)的產生。415-1噬菌體展示系統(tǒng)設計形成基因10B主要衣殼蛋白的融合產物及其下游插入的任何小蛋白。終止密碼子的添加確保沒有形成融合產物，并且允許相對大的螢光素酶基因以可溶形式表達。用EcoR1和HindIII消化PCR產物，純化，并連接415-1。使用BioRad MicroPulser電穿孔系統(tǒng)，將連接產物插入MegaX DH10B電感受態(tài)細胞(Invitrogen)中，并且將培養(yǎng)物涂布在大腸桿菌上，用于噬菌斑。挑選噬菌斑，并且將噬菌體生長于大腸桿菌DH10B中并通過蔗糖密度梯度離心純化，用作指示噬菌體，415-Luc。

圖1描繪了實例指示噬菌體415-Luc的基因組結構?？蓹z測的指示部分由III類基因區(qū)內插入的螢火螢光素酶基因編碼，其在病毒生命周期晚期表達并以高于其他噬菌體基因的水平表達。構建體含有終止密碼子，以確保螢光素酶不摻入天然基因產物中，如衣殼蛋白基因10B，并且因此不是融合單位。因此，這個構建體允許子代噬菌體表達可溶性螢火螢光素酶，作為待檢測的指示劑。

實施例2.從環(huán)境分離和純化大腸桿菌O157:H7特異性噬菌體。

連同從鄰近的Ballona濕地的水樣，獲得了來自Hyperion污水處理廠的樣品。將樣品與粉末狀營養(yǎng)肉湯(Gibco，Inc.)混合成1×，并用來自3mL混濁培養(yǎng)物的大腸桿菌O157:H7(ATCC 43888)接種。將樣品在37℃下振蕩孵育3小時，以富集感染大腸桿菌O157:H7的噬菌體，用120μL氯仿裂解，渦旋15秒，并將1mL樣品在6800g下離心2分鐘。將上清液過濾(0.45μm濾器)，并為了大腸桿菌O157:H7上的噬菌斑涂布。將這個樣品以各種稀釋度在噬菌斑測試中涂布，以獲得孔分離的噬菌斑。用一次性移液管尖端刺入單個噬菌斑，并重懸浮于100μL TMS緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl₂，和100mM NaCl)。

對大腸桿菌菌株O157:H7、B和DH10B，以及沙門氏菌菌株，在覆蓋瓊脂上進行5μL重懸浮噬菌斑的等份試樣的斑點測試。只有澄清的O157:H7的噬菌體在大腸桿菌O157:H7中擴增，裂解物通過離心澄清，并使用緩沖液交換柱，將顆粒投入TMS緩沖液中。

將八個密切相關的噬菌體分離物在大腸桿菌O157:H7上生長，純化，并分離基因組和測序。三個基因組類型全部顯示出與T4-樣噬菌體RB69具有98％同源性?；谶@種同源性，將晚期基因作圖，并且選擇噬菌體JG04用于進一步的研究。圖2顯示了JG04，并將JG04的基因組命名為SEQ ID NO.4。

實施例3.重組指示噬菌體的產生和純化

基于晚期基因區(qū)的序列分析和定位，使用針對各種報道基因的插入片段合成了同源重組序列，所述報道基因由不同的螢光素酶蛋白組合，如圖3中所示。具體地，使用了三個構建體：螢火螢光素酶同源重組質粒，pUC57.HR.Fluc，對應于SEQ ID NO.5；同源重組質粒，pUC57.HR.對應于SEQ ID NO.6；和Oplophorus螢光素酶同源重組質粒，pUC19.HR.OpLuc.KanR，對應于SEQ ID NO.7。

使用上游T4晚期基因啟動子來插入螢光素酶基因，以確保病毒晚期過程中的表達。在一些情況下，還插入了雷帕霉素抗性標記，以允許在雷帕霉素抗生素下選擇受感染的細胞。這些區(qū)域兩側為多達500bp匹配衣殼蛋白的序列，gp23和gp24。這些合成的序列由氨芐青霉素抗性pUC57或pUC19來攜帶。

使用Gene Pulser II電穿孔器，將含有合成序列的質粒轉化至電穿孔感受態(tài)大腸桿菌O157:H7中，賦予氨芐青霉素抗性。通過用合適的螢光素酶底物(D-螢光素，用于螢火螢光素酶，腸腔熒光素，用于Oplophorus螢光素酶，以及腸腔熒光素或用于)進行測試，以針對陽性轉化來篩選菌落。將帶有質粒的大腸桿菌O157:H7(所述質粒具有兩側為與噬菌體JG04同源的序列的luc)生長于含有氨芐青霉素的LB肉湯細菌中，并且將細菌培養(yǎng)物在含有氨芐青霉素的LB肉湯中生長至大約10⁷個細胞/mL。然后用1MOI的噬菌體JG04感染培養(yǎng)物并在37℃下振蕩孵育45分鐘，以裂解細胞。裂解物含有大部分的野生型噬菌體與少量重組噬菌體的混合物，所述重組噬菌體由同源重組質粒對野生型噬菌體基因組的同源重組形成。

為了測定重組噬菌體與野生型噬菌體的比例，使用基于TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量50％)的有限稀釋測定來測定感染單位的濃度(IU/mL)，類似于病毒顆粒或噬菌噬菌斑形成單位的數(shù)量，以及測定螢光素酶轉導單位(TU/mL)的數(shù)量。在這些測試中，將樣品連續(xù)稀釋，將每個稀釋度等分至含有大腸桿菌O157:H7細菌的重復孔中。任何顯示出螢光素酶活性的孔必須已經用至少一個重組噬菌體感染?；谄渲邪l(fā)生這些情況下的每一種的最高稀釋度，反算初始濃度。來自轉化細胞的這些初始噬菌體混合物對于每個重組噬菌體TU通常產生20,000個野生型IU的比例。然后進行分離和擴增重組噬菌體的步驟。

如圖4中所示，從混合物中分離構成0.005％總噬菌體的重組噬菌體。將噬菌體混合物稀釋至96孔平板中，以獲得每個平板平均3個重組TU，其分解成每個孔約625IU的大部分野生型噬菌體。每個孔含有50μL混濁的大腸桿菌O157:H7。在37℃下孵育2小時后，對孔取樣并篩選螢光素酶的存在。任何陽性孔很可能已經接種單個重組噬菌體，和～600個野生型噬菌體，其是相對于初始20,000:1比例的富集。將來自這種富集培養(yǎng)的子代接受另一個有限稀釋測定，以驗證比例和測定重組噬菌體轉導單位的實際濃度。

再次，從這個儲液等分每個96-孔平板3個重組TU，形成每孔～20個大部分野生型噬菌體的大致接種物。任何陽性螢光素酶孔很可能已經接種單個重組噬菌體連同～20個野生型噬菌體。分析這些孔的螢光素酶活性，并且將任何陽性孔接受有限稀釋測定，以測定TU與IU的比例，然后接受噬菌斑測試，以獲得孔分離的噬菌斑。

在這點，預期的野生型與重組體的比例為約20:1。單獨挑選了48個噬菌斑并篩選螢光素酶轉導能力，確保約3個重組體在待篩選的噬菌斑的混合物中。將每個噬菌斑懸浮于100μL TMS中，并將5μL加入含有混濁的大腸桿菌O157:H7培養(yǎng)物的孔中，并且在37℃下孵育45分鐘至1小時后，測定孔。

預期陽性孔含有純的重組噬菌體培養(yǎng)物，但另一輪的噬菌斑純化是標準程序。進行大規(guī)模生產以獲得適用于大腸桿菌O157:H7檢測測定中的高滴定度儲液。使用氯化銫等密度梯度離心，以從污染螢光素酶蛋白中分離出噬菌體顆粒，來降低背景。

實施例4.使用旋轉柱濾器通過指示噬菌體的細菌檢測

圖5說明了根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用指示噬菌體和旋轉柱濾器用于細菌檢測。在實例實施方案中，將大腸桿菌DH10B在37℃下在Luria-Bertani肉湯(LB)中振蕩生長。將415-Luc噬菌體稀釋至10⁸PFU/40μL(2.5×10⁹PFU/mL)。將細胞計數(shù)并稀釋至3000，300，30和3個細胞/mL。與以下螢光素酶測定平行進行CFU測定，以測定每個測定的輸入細胞的實際數(shù)量。

對于每個細胞稀釋度，將0.1mL加入濾器中，重復三份。將濾器在600g下旋轉1分鐘。接著，將40μL每種噬菌體稀釋液加入每個濾器中，接著在室溫下孵育10分鐘。通過加入400μL PBST(0.05％Tween)將濾器洗滌兩次，接著在600g下離心1分鐘。接著加入50μL LB，接著在37℃下孵育30分鐘。將濾器在6800g下旋轉2分鐘。接著，將30μL濾液轉移至200 96-孔光度計平板，并通過注射100μL螢光素酶測定試劑(Promega，Inc.)，在Promega光度計中進行了螢光素酶測定。根據(jù)平行CFU測定中的菌落數(shù)量來校正細胞計數(shù)。通過將每個孔的細胞除以來自零細胞對照的信號的平均來獲得信號與背景的比例。圖6顯示了結果，證明了通過螢光素酶活性檢測少如1至3個大腸桿菌細胞的高測試靈敏度。圖7顯示了結果，證明了使用起始細菌樣品的連續(xù)稀釋，相同方法的非常大的檢測范圍。這允許檢測平均1.4個細胞至1.4千萬個細胞。

實施例5.使用96-孔濾板通過指示噬菌體的細菌檢測

將大腸桿菌DH10B在37℃下在LB中振蕩生長。將415-Luc噬菌體在LB中稀釋至4×10⁷PFU/20μL(2×10⁹PFU/mL)。將細胞計數(shù)并稀釋至500，50和5個細胞/mL(將0.1mL加入每個孔中，獲得圖5中所示的～50，5和<1個細胞)。與以下螢光素酶測定平行進行了CFU測試，以確定每個測定的輸入細胞的實際數(shù)量。

對于每個細胞稀釋度，將0.1mL加入96-孔濾板中的多個孔中：0.5個細胞為9個孔，50個細胞、5個細胞和零細胞對照為3個孔。將96-孔濾板在1200rpm(263rcf)下旋轉3分鐘。接著，將20μL噬菌體稀釋液加入每個濾器中并在室溫下孵育10分鐘，接著在37℃下孵育30分鐘。使用100μL螢光素酶測定試劑(Promega，Inc.)注射，使用Promega光度計，在初始濾板中直接進行了螢光素酶測定，并在注射后立即閱讀平板，并且在此后的15和30分鐘再次閱讀。根據(jù)平行CFU測定中的菌落數(shù)量來校正細胞計數(shù)。通過將每個孔的信號除以來自零細胞對照的信號的平均來獲得信號與背景的比例。

圖8顯示了結果，證明使用96-孔濾板用于檢測每個孔中的單個大腸桿菌細胞(測試了平均0.5個細胞，使得約一半的孔接收了單個細胞)，以及每孔5.4和54個細胞。

圖9顯示了結果，證明了使用96-孔濾板系統(tǒng)非常大的細胞檢測范圍，從平均少于1個細胞/孔(單個細胞)至至少1.4千萬個細胞/孔。

實施例6.使用指示噬菌體和低細胞濃度的濾板測定

將大腸桿菌O157:H7細胞在37℃下生長于LB中，使用220rpm振蕩。將指示噬菌體制成10⁶PFU/20μL。將細胞計數(shù)并稀釋成7290、2430、810、270、90、30、10和0個細胞/mL。將每個樣品等份的100μL沉積至Optiplate 96-孔灰色光度計0.45μm濾板的孔中，重復兩份。

如圖10中所示，將平板加載于翻斗離心機中并且在2400rpm下旋轉3分鐘。將20μL噬菌體稀釋液加入每個孔中，獲得5×10⁷PFU/mL的終濃度。將平板在室溫下孵育10分鐘，將200μL PBST加入每個孔中，并且將平板在2400rpm下旋轉3分鐘，以洗掉過量的親本噬菌體。

接著，將50μL LB加入每個孔中，并將平板在37℃培養(yǎng)箱中孵育45分鐘，沒有振蕩。將等份的10μL Promega Renilla螢光素酶裂解緩沖液加入孔中，將分析物轉移至孔中，并用50μL Promega試劑注射進行了螢光素酶測定。將含有細胞的樣品與0細胞對照進行比較。

如在圖11中看到的，濾板結果顯示出來自0個細胞和1個細胞/測試的信號之間的統(tǒng)計學顯著差異(通過Student’s t-檢驗，p值＝0.034)，證明了檢測單個細胞的能力。每個測定更多細菌細胞表明以劑量依賴性方式提高信號。

實施例7.具有低細胞濃度的無濃縮測定

在準備與示意圖12中所示的測定相似的實驗中，將大腸桿菌O157:H7在37℃下生長在LB中，使用220rpm振蕩。將JG04-OpLuc指示噬菌體制成1.2×10⁷PFU/20μL，并將20μL等份試樣分配至Optiplate 96-孔灰色光度計平板的孔中。將細胞計數(shù)并稀釋至10，3.3，1.1和0個細胞/mL。將等份的100μL的每個樣品分配至孔中，重復兩份(對于0.11和0.33個細胞/測定為12×，以及對于1個細胞/測定為5×)，獲得10⁸PFU/mL的最終噬菌體濃度。

將平板在37℃培養(yǎng)箱中孵育45分鐘，沒有振蕩。最后，將10μL Renilla螢光素酶裂解緩沖液加入每個孔中，并且用50μL Renilla螢光素酶測定試劑(腸腔熒光素)注射進行了螢光素酶測定。將樣品與0個細胞對照進行比較。

如圖13中看到的，使用低細胞濃度的無濃縮測定結果表明來自0個細胞和1個細胞/測定的信號之間的統(tǒng)計學顯著差異(通過ANOVA檢驗，p值＝0.0024)，證明了檢測單個細胞的能力。因此，該測試是令人驚訝地靈敏的。具有少于1個細胞/孔的樣品顯示出高于背景信號的成比例的孔的數(shù)量。

實施例8.使用寬細胞濃度范圍的無濃縮測定

在使用較高細胞濃度的相似實驗中，將大腸桿菌O157:H7細胞在37℃下生長于LB中，使用220rpm振蕩。將JG04-OpLuc指示噬菌體制成1.2×10⁷PFU/20μL，并將20μL等份試樣分配至Optiplate 96-孔灰色光度計平板的孔中。將細胞計數(shù)并稀釋至10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，33，11，3.7，1.2和0細胞/mL。將等份的100μL的每個樣品分配至孔中，重復兩份，獲得10⁸PFU/mL的最終噬菌體濃度。

將平板在37℃培養(yǎng)箱中孵育45分鐘，沒有振蕩。將10μLRenilla螢光素酶裂解緩沖液加入每個孔中，并且用50μLRenilla螢光素酶測定試劑(腸腔熒光素)注射進行了螢光素酶測定。將樣品與0個細胞對照進行比較。

如圖14中看到的，使用非常寬范圍的細胞濃度樣品的無濃縮測定的實驗表明來自0個細胞和1.1個細胞/測定的信號之間的統(tǒng)計學顯著差異(通過Student’s t-檢驗，p值＝0.000702)，證明了檢測單個細胞的能力。每個測定更多細菌細胞顯示出以劑量依賴性方式提高信號，直至至少10⁶個細菌細胞/mL，令人驚訝地證明了非常寬的檢測范圍。

實施例9.使用蔬菜洗滌樣品的無濃縮測定

為了制備蔬菜洗滌液，將蔬菜葉(例如，菠菜或生菜)稱重并加入干凈的塑料袋中。每克(g)蔬菜添加一mL LB(+/-0.01-0.05％Tween20)。將葉子和溶液手動混合幾分鐘。然后從塑料袋中提取液體并用作“蔬菜洗滌液”。使用這種方法，通過CFU發(fā)現(xiàn)在單片菠菜葉(1-2g)上存在～1百萬個細菌。

將大腸桿菌O157:H7細胞在37℃下生長于LB中，使用220rpm振蕩。將JG04-OpLuc指示噬菌體制成1.2×10⁷PFU/20μL，將20μL等份試樣分配至Optiplate 96-孔灰色光度計平板的孔中。將細胞計數(shù)并稀釋成120，60，30和0個細胞/mL的蔬菜洗滌液。將等份的100μL的每個樣品分配至孔中，重復兩份，獲得10⁸PFU/mL的最終噬菌體濃度。

將平板在37℃培養(yǎng)箱中孵育45分鐘，沒有振蕩。將10μLRenilla螢光素酶裂解緩沖液加入每個孔中，并且用50μLRenilla螢光素酶測定試劑(腸腔熒光素)注射進行了螢光素酶測定。將樣品與0個細胞對照進行比較。

如圖15中看到的，使用蔬菜洗液樣品的無濃縮測定的實驗顯示出來自0個細胞和3個細胞/測定的信號之間的顯著差異，證明檢測蔬菜洗滌液中個位數(shù)細胞數(shù)量的能力。每個測試使用更多細菌細胞表明以劑量依賴性方式提高信號。蔬菜洗滌液含有約10⁶個非靶細菌/mL，對應于這個測定中約10⁵個非靶細胞(包括0個細胞大腸桿菌O157:H7對照)。從10⁵個非靶細胞中辨別少如3個靶細胞細菌的能力是令人驚訝的并再次證明了測試的特異性。

實施例10.使用抗體和珠粒的大腸桿菌O157:H7的特異性的和定量的捕獲

圖16描繪了實例實驗，證明了對抗大腸桿菌O157:H7的抗體和磁抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的珠粒從樣品特異性地和定量地捕獲了大腸桿菌O157:H7，但沒有捕獲樣品中的大腸桿菌B或鼠傷寒沙門氏菌。為了證明從溶液捕獲完整的、活的細菌細胞的特異性，大腸桿菌O157:H7的表面抗原的多克隆抗體購自KPL(親和性-和反向-純化，以最小化交叉反應性)。

將大腸桿菌種和鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)物在LB肉湯中生長，收集，并用磷酸鹽緩沖液洗滌(1.1mM KH₂PO₄，5.6mM Na₂HPO₄，154mM NaCl，pH7.4)。然后將洗滌的細胞計數(shù)并稀釋至5-20個細胞/mL的濃度。

將含有大腸桿菌O157:H7的樣品與含有BSA和生物素綴合的抗體的溶液混合。將通過KPL產生的大約10ng生物素化的、多克隆抗大腸桿菌抗體(等于約4×10¹⁰抗體分子)加入每個細胞懸浮液中。還平行進行了對照實驗，其中沒有將抗體加入細胞懸浮液中。BSA濃度為～1％，并且總生物素-抗體為10ng。將混合物顛倒旋轉1小時。

用抗體孵育后，將4×10⁷個抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的磁微粒(Invitrogen/Life Technologies)加入混合物中并再孵育30分鐘。然后使用磁架收集細胞-抗體-珠粒復合物，并且除去未結合的級分(上清液)。用含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液(1.1mM KH₂PO₄，5.6mM Na₂HPO₄，154mM NaCl，pH7.4，0.05％Tween-20)溫和地洗滌珠粒。然后將上清液和捕獲的細胞-珠粒復合物分布于LB瓊脂平板上，并將平板在37℃下孵育過夜，以測定CFU。用抗O157:H7抗體捕獲大腸桿菌O157:H7，而不是大腸桿菌B或鼠傷寒沙門氏菌，是特異性的和定量的。

實施例11.雜合免疫噬菌體(HIP)測定

如示意圖17中所示，雜合免疫噬菌體或“HIP”測定結合了細菌特異性抗體捕獲的益處與修飾的噬菌體的益處。首先將樣品施加于覆蓋了細菌特異性抗體的微滴定平板孔中(1702)。然后將平板離心，以促進細菌與捕獲抗體的結合(1704)。足夠時間以允許細菌完全捕獲后，將含有細菌特異性的Luc-噬菌體的溶液加入每個樣品中(1706)。用噬菌體孵育導致了單個或多個噬菌體與捕獲的細菌的結合和連接(1708)。最后，將樣品孵育以促進噬菌體復制和螢光素酶表達，其導致細胞溶解和可溶性螢光素酶的釋放(1710)。

在HIP測定實驗中，將白色96-孔ELISA平板覆蓋300ng靶細菌特異性的單克隆抗體(在100μL PBS中)，在室溫下持續(xù)2-3小時。用PBS(200μL×3次洗滌)洗滌孔，用5％BSA/PBS(300μL)在室溫下阻斷1-1.5小時，并再次用300μL PBS×1洗滌。將樣品(100μL)加入孔中。

將ELISA平板在700×g下離心30分鐘，然后在室溫下孵育1小時。將噬菌體加入樣品中(10μL LB中2-4×10⁶PFU)，并在室溫下孵育10分鐘。用PBS洗滌樣品(200μL×2次洗滌)。將LB培養(yǎng)基加入樣品(100μL)中，并在37℃下孵育1.5小時。

將底物(50μL)直接加入樣品中，并在光度計中測量發(fā)光。如圖18中看到的，HIP測定能夠使用大約2×10⁶PFU噬菌體檢測LB培養(yǎng)基中的100和1,000個大腸桿菌O157:H7細胞。相對于無細胞樣品的平均信號以對數(shù)級別顯示，并且范圍從100個細胞樣品大約50倍到1,000個細胞樣品超過1,000倍。