本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種萊茵衣藻溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶，本發(fā)明還涉及該酶的用途。

背景技術(shù)：

當(dāng)今全球大約80％的能源來自于化石燃料，自19世紀(jì)工業(yè)革命至今的一百多年中化石燃料逐漸消耗殆盡，作為一種不可再生資源，人類必須找到一種既能替代化石燃料而成為主要能源又不會過于劇烈的改變工業(yè)結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)力工具的替代品。在眾多可替代能源中生物燃料最受關(guān)注，這其中就包括生物柴油。

目前，能用于制造生物柴油的生物質(zhì)主要是高等植物，比如油菜、大豆、棕櫚油、向日葵、麻風(fēng)樹等。雖然這些植物本身產(chǎn)油能力很高但卻需要大面積的土地進(jìn)行種植來供應(yīng)燃料需求，這就勢必造成大量森林被砍伐，導(dǎo)致生態(tài)失衡，所以這些高等植物并不能滿足作為化石燃料替代品的要求。而微藻卻具有高等植物所沒有的巨大優(yōu)勢，有些產(chǎn)油微藻有著較高的光合效率能夠帶來巨大的生物質(zhì)，又不需要占用過多土地資源，所以微藻的產(chǎn)油能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)農(nóng)作物，其巨大的產(chǎn)業(yè)價值使它成為近年來的研究熱點[chisti,yusuf."biodieselfrommicroalgaebeatsbioethanol."trendsinbiotechnology26.3(2008):126-131]。

一般來說，生物柴油是c15-c19的脂肪酸甲酯，若要將生物柴油真正應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，則需要對生物柴油的脂肪酸碳鏈長度及飽和度提出一定要求。目前，歐盟和美國分別頒布了生物柴油的標(biāo)準(zhǔn)(en14214和astmd6751)，以c16和c18的飽和或單不飽和脂肪酸為 主的生物柴油性能最好。雖然微藻產(chǎn)油可以作為生物柴油的理想來源，但其本身的脂肪酸組成繁雜，很難保證c16或c18的脂肪酸構(gòu)成細(xì)胞總脂肪酸的主要成分。由此可以看出，對微藻脂肪酸組成結(jié)構(gòu)的控制，是目前需要解決的一個難題。

除了作為生物柴油的前體外，含有飽和c16脂肪酸(又稱棕櫚酸或軟脂酸)的甘油三酯在食品等領(lǐng)域也有廣泛的用途。例如，如1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(以下簡稱opo)，就是已經(jīng)商業(yè)化人乳脂肪替代品產(chǎn)品如betapol45^tm及infat^tm中的重要組分，衛(wèi)生部于2008年13號公告中，明確opo能以營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰幼兒乳制品。

脂肪酸在甘油三酯中的位置分布對脂肪酸及礦物質(zhì)(例如鈣)的吸收效果具有顯著的影響。freeman等[j.dairysc1.,1965,p.853]報道了人乳脂肪絕大多數(shù)的棕櫚酸分布在sn-2位，而硬脂酸和油酸分布在sn-1(3)位。filer等[j.nutrition,99,pp.293-298]研究表明棕櫚酸分布在三甘酯的sn-2位在嬰兒體內(nèi)比黃油脂肪(黃油脂肪的棕櫚酸主要分布在sn-1，3位)能獲得更好的吸收。因此，opo被認(rèn)為是目前已知的接近人乳脂肪組分的重要甘油三酯，而現(xiàn)有opo制備方法，多是采用混合調(diào)制不同成分的油脂并引入催化酸解等工藝來實現(xiàn)(us20100104694a1，us20090130728a1)?，F(xiàn)有的方法費時費力，故限制了此類產(chǎn)品的開發(fā)。

除了甘油三酯外，棕櫚酸的其他衍生物也具有多種工業(yè)用途。例如，其棕櫚酸鈉鹽或鉀鹽可作乳液聚合時的乳化劑；棕櫚酸的鈉鹽是肥皂的主要成分之一；棕櫚酸鋁鹽和鋅鹽等可用于潤滑劑、涂料、油墨和增塑劑中。

有上述內(nèi)容可以看出，尋找新的涉及棕櫚酸合成或?qū)⑵浣M裝為甘油三酯的基因，并利用基因工程的方法對現(xiàn)有的工程微生物、植物、動物進(jìn)行遺傳改造，使之產(chǎn)生富含“棕櫚酸的油脂”或“甘油三酯”，或“在甘油骨架特定的位置上含有棕櫚酸”的油脂(如opo)，將極大程度地推進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

近年來，生物細(xì)胞產(chǎn)油(還有其他可以產(chǎn)油細(xì)胞，如酵母、高等 植物細(xì)胞)作為可再生生物柴油及多種高附加值產(chǎn)品的來源已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。生物細(xì)胞內(nèi)油脂的生物合成是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，其起始于脂肪酸的從頭合成。這個步驟發(fā)生在質(zhì)體中，脂肪酸合成酶以丙二酰coa為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，這些不斷增長的碳鏈與?；d體蛋白acp結(jié)合，有些?；d體蛋白acp在?；鵦oa合成酶的作用下形成?；?coa，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，這些不同長度的酰基-coa會在多種酶的作用下進(jìn)一步修飾，比如脂肪酸的去飽和等[harwood,johnl."recentadvancesinthebiosynthesisofplantfattyacids."biochimicaetbiophysicaacta(bba)-lipidsandlipidmetabolism1301.1(1996):7-56.]。從脂肪酸到甘油三酯tag的合成是通過kennedy途徑完成的。首先甘油-3-磷脂(g-3-p)在甘油-3-磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶(gpat)的催化下形成溶血性磷脂酸(lpa)，隨后在溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(lpaat)的作用下形成磷脂酸(pa)，磷脂酸在磷脂酸磷酸水解酶(pap)的作用下脫磷酸化而形成甘油二脂(dag)，最終在二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(dgat)的催化下合成甘油三酯[kennedy,e.p.,&weiss,s.b.(1956).thefunctionofcytidinecoenzymesinthebiosynthesisofphospholipides.journalofbiologicalchemistry,222(1),193-214.]。近年來科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)不同來源的gpat和dgat對底物?；?coa的選擇性較小，而lpaat卻對底物有很強(qiáng)的選擇性，它嚴(yán)格控制了tag的sn-2位上脂肪酸鏈的長度與飽和度。例如高等植物油菜和擬南芥質(zhì)體的lpaat對16:0-coa的偏好性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于18:1-coa，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)lpaat卻對18:1-coa有著強(qiáng)烈的偏好性[kim,hyunuk,andanthonyhchuang."plastidlysophosphatidylacyltransferaseisessentialforembryodevelopmentinarabidopsis."plantphysiology134.3(2004):1206-1216]，由此可見高等植物的不同細(xì)胞器來源的lpaat對底物有偏好性而使脂肪酸的組成呈現(xiàn)多樣化。

但是目前研究尚不清楚低等植物藻類中不同細(xì)胞器來源的lpaat是否也有類似的偏好性，如果確有類似的偏好性，則能借此來調(diào)節(jié)和控制生物細(xì)胞(特別是藻細(xì)胞)中脂肪酸的組成結(jié)構(gòu)，使 c16或c18的脂肪酸構(gòu)成細(xì)胞總脂肪酸的主要成分，將很大程度的解決前文所提的技術(shù)難題，使產(chǎn)油生物細(xì)胞(特別是微藻)產(chǎn)油真正成為生物柴油的理想來源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明根據(jù)宿主細(xì)胞中質(zhì)體lpaat對c16:0的底物選擇性，在萊茵衣藻中找到了一個新的質(zhì)體crlpaat1基因，其表達(dá)的蛋白酶即萊茵衣藻溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶對16:0-coa有強(qiáng)烈的選擇性。通過過量表達(dá)該基因，顯著提高了生物細(xì)胞中c16:0脂肪酸在總脂肪酸中的比例。

基于此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(lpaat)，用以提高產(chǎn)油生物細(xì)胞產(chǎn)c16:0的能力；

本發(fā)明的第二個目的在于提供所述萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的基因(crlpaat1)；

本發(fā)明的第三個目的在于提供所述萊茵衣藻溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶及其基因的用途。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的首先提供一種萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶，其為:1)由seqidno.1所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或2)在seqidno.1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有seqidno.2所示的核苷酸序列。該基因是以jgi萊茵衣藻基因組數(shù)據(jù)庫中的同族基因為參考基因，設(shè)計特異引物，并以萊茵衣藻cdna文庫為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得的。該cdna含有一個大小為999bp的開放閱讀框，編碼了一個含有332個氨基酸殘基的蛋白。初步預(yù)測了此蛋白含有酰基轉(zhuǎn)移酶的功能域和兩段跨膜域并且在n末端具有葉綠體轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，其可能的亞細(xì)胞定位是葉綠體。

應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在 不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明的萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶還包括seqidno.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，具有萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核苷酸序列，包括但不限于seqidno.2所示的序列，其互補(bǔ)序列，或者是在嚴(yán)格條件下與seqidno.2序列雜交，且編碼具有所述萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的dna序列。所述嚴(yán)格條件是ph＝7-8的tris-hcl緩沖液，95℃變性5分鐘后，于37℃下雜交。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。例如，根據(jù)密碼子的簡并性，seqidno.2所示序列的第7-9位堿基cgt亦可為cgc、cga或cgg。編碼序列的互補(bǔ)序列可以作為模板鏈在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可以據(jù)此設(shè)計引物等等進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供含有上述基因的載體。所述載體，包括但不限于含有crlpaat1基因的克隆載體或各類表達(dá)載體。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供含有上述基因或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，例如產(chǎn)油生物細(xì)胞，包括但不限于微藻或酵母。

通過上述基因工程的手段，可以實現(xiàn)異源表達(dá)所述的萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶，因此該酶可以通過培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供上述的萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶、上述的基因或上述的載體在制備產(chǎn)油的宿主細(xì)胞中的應(yīng)用。所述宿主細(xì)胞包括但不限于微藻或酵母。轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞中c16脂肪酸占總脂肪酸比例高于轉(zhuǎn)化前的比例。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供上述的萊茵衣藻溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶、上述基因或上述的載體在提高生物細(xì)胞中c16脂肪酸占總脂肪酸比例中的應(yīng)用。所述的生物細(xì)胞包括但不限于微藻或酵母。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供一種制備生物柴油的方法，該方法是使用上述轉(zhuǎn)化了所述基因的宿主細(xì)胞來生產(chǎn)生物柴油。

在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞通常是指能接受基因?qū)氲募?xì)胞。導(dǎo)入外源基因的方法不限于各種轉(zhuǎn)化方法，例如點擊轉(zhuǎn)化。

在本發(fā)明中，載體通常是能將dna片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并進(jìn)行自我復(fù)制的dna分子，包括克隆載體及表達(dá)載體等等，含有外源基因的載體通常是指外源基因插入到載體的克隆位點。

在本發(fā)明中，適于萊茵衣藻溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的宿主細(xì)胞包括微藻或酵母。但不限于“微藻和酵母”兩種異源性細(xì)胞中對脂肪酸組成影響的例子，但凡使用可產(chǎn)生c16:coa的生物細(xì)胞均可作為宿主細(xì)胞。利用crlpaat1基因所表達(dá)的蛋白酶(lpaat)對c16:c0a強(qiáng)烈的選擇性，在(lpaat)的作用下形成磷脂酸(pa)，接著在磷脂酸磷酸水解酶(pap)的作用下脫磷酸化而形成甘油二脂(dag)，最終經(jīng)催化下合成c16:0脂肪酸，使c16:0含量提高，甚至成為主要成分。

有益效果

本發(fā)明根據(jù)宿主細(xì)胞中質(zhì)體lpaat對c16:0的底物選擇性，在萊茵衣藻中找到了一個新的質(zhì)體crlpaat1基因，其表達(dá)的蛋白酶即萊茵衣藻溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶對16:0-coa有強(qiáng)烈的選擇性。通過過量表達(dá)該基因，顯著提高了生物細(xì)胞中c16:0脂肪酸在總脂肪酸中的比例。進(jìn)而能夠應(yīng)用于獲得高品質(zhì)(燃點低、粘度低)生物柴油及其他相關(guān)產(chǎn)品。

附圖說明

圖1為萊茵衣藻crlpaat1cdna序列擴(kuò)增結(jié)果的凝膠電泳圖，其中m為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)。模板dna為萊茵衣藻cdna文庫。

圖2為crlpaat1基因結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1～46氨基酸片段為生物信息學(xué)軟件chloropv1.1預(yù)測得到的葉綠體轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列；94～116 和180～205氨基酸片段為生物信息學(xué)軟件tmhmm預(yù)測得到的跨膜區(qū)段；下劃線部分為生物信息學(xué)軟件interproscan預(yù)測得到的?；D(zhuǎn)移酶功能域；162～168和235～237氨基酸片段為多序列比對與文獻(xiàn)報道的?；D(zhuǎn)移酶催化位點與底物結(jié)合位點。

圖3為lpaat的系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用t-coffee進(jìn)行多序列比對后使用neighbor-joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹軟件為mega6.0。

圖4為功能互補(bǔ)實驗結(jié)果。

圖4a為構(gòu)建pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的方法。左圖為使用高保真dna聚合酶pfu從cdna文庫中克隆得到crlpaat1的片段；右圖為重組質(zhì)粒pqe30-crlpaat1的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4b為sm2-1lpaat缺陷型大腸桿菌體內(nèi)功能互補(bǔ)實驗的結(jié)果。pqe30為轉(zhuǎn)化了pqe30空質(zhì)粒的對照組，crlpaat1為轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的實驗組，菌液經(jīng)過5個梯度的稀釋后分別涂在含有或不含有iptg誘導(dǎo)劑的lb平板上，再將平板置于30℃和42℃下培養(yǎng)。

圖4c為轉(zhuǎn)化了crlpaat1基因或轉(zhuǎn)化空載體的sm2-1菌株表達(dá)crlpaat1蛋白的westernblot檢測結(jié)果。m：bio-radprecisionplusproteinstandards。泳道1：轉(zhuǎn)化了crlpaat1基因的實驗組；泳道2：轉(zhuǎn)化了pqe30空載體的對照組。

圖5顯示的是crlpaat1對不同酰基-coa作為?；w的選擇性。

圖5a為分別使用14:0-coa、16:0-coa、18:0-coa、20:0-coa、22:0-coa、24:0-coa6種飽和脂肪酸作為?；w。sm2-1+lpaat1/heat：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1，高溫加熱使粗酶失活作為陰性對照；sm2-1+lpaat1：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1作為實驗組。pa：磷脂酸標(biāo)樣；lpa：溶血性磷脂酸標(biāo)樣。

圖5b為分別使用16:1-coa、17:1-coa、18:1n7-coa、18:1n9-coa、 18:1n12-coa、18:2-coa、18:3n3-coa、18:3n6-coa、20:4-coa、20:5-coa、22:6-coa、24:1-coa12種不飽和脂肪酸作為?；w。sm2-1+lpaat1/heat：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1，高溫加熱使粗酶失活作為陰性對照；sm2-1+lpaat1：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1作為實驗組。

圖6顯示的是crlpaat1對不同lpa作為?；荏w的選擇性。分別使用14:0-lpa、16:0-lpa、17:0-lpa、18:1-lpa、20:4-lpa作為?；荏w，固定使用16:0-coa作為?；w進(jìn)行酶活實驗。sm2-1+empty：轉(zhuǎn)化了pqe30空質(zhì)粒的sm2-1作為對照組；sm2-1+lpaat1：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1作為實驗組；eh：高溫加熱使粗酶失活的對照組，使用18:1-lpa作為?；荏w；lh：高溫加熱使粗酶失活的實驗組，使用18:1-lpa作為酰基受體。

圖7a為過量表達(dá)crlpaat1對野生型釀酒酵母invsc1脂肪組成的影響；圖7b過量表達(dá)crlpaat1對野生型釀酒酵母invsc1tag中脂肪酸組成的影響；圖7c過量表達(dá)crlpaat1對野生型釀酒酵母invsc1總油脂含量的影響；圖7d過量表達(dá)crlpaat1對野生型釀酒酵母invsc1總tag含量的影響。其中empty：轉(zhuǎn)化了pyes2/ct空質(zhì)粒的invsc1酵母菌作為對照組；lpaat1：轉(zhuǎn)化了pyes2/ct-crlpaat1質(zhì)粒的invsc1酵母菌作為實驗組。結(jié)果進(jìn)行了t檢驗。

圖8過量表達(dá)crlpaat1對萊茵衣藻cw15總脂肪酸含量的影響。其中cw15為對照組，r16-1為過表達(dá)crlpaat1的突變株。

圖9過量表達(dá)crlpaat1對萊茵衣藻cw15總脂中各脂肪酸含量的影響。其中cw15為對照組，r16-1為過表達(dá)crlpaat1的突變株。

圖10過量表達(dá)crlpaat1對萊茵衣藻cw15tag占細(xì)胞干重的變化。其中cw15為對照組，r16-1為過表達(dá)crlpaat1的突變株。

圖11過量表達(dá)crlpaat1對萊茵衣藻cw15tag中各脂肪酸 含量的影響。其中cw15為對照組，r16-1為過表達(dá)crlpaat1的突變株。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。例如，對于基因操作、表達(dá)、分析以及蛋白互作等等可參考《分子克隆實驗指南》第三版中的相關(guān)方法。

實施例1基因克隆及序列特征分析

本發(fā)明所提供的crlpaat1基因是以jgi萊茵衣藻基因組數(shù)據(jù)庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)公布的cre09.g398289.t1.1基因為參考基因，設(shè)計特異引物(正向引物，如seqidno.3所示，5'-atggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'，反向引物，如seqidno.4所示，5'-ctgctcatccggcgccatctctgt-3')，以萊茵衣藻cdna文庫(cdna文庫的構(gòu)建按照《分子克隆實驗指南》按常規(guī)方法制備保存)為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得cdna序列，如圖1所示。pcr的反應(yīng)體系為：2μl模板dna，10μl2×gotaqdnapolymerasemix(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)，1μl正向引物(10μm)，1μl反向引物(10μm)，最后補(bǔ)充去離子水，使總體積為20μl。pcr反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

該cdna含有一個大小為999bp的開放閱讀框(seqidno.2)，編碼了一個含有332個氨基酸殘基的蛋白(seqidno.1)。用生物信息學(xué)相關(guān)軟件初步預(yù)測了此蛋白的功能與亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示crlpaat1含有?；D(zhuǎn)移酶的功能域和兩段跨膜域并且在n末端具有葉綠體轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，其可能的亞細(xì)胞定位是葉綠體(圖2)；其中，1～46氨基酸片段為生物信息學(xué)軟件chloropv1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorop/)預(yù)測得到的葉綠體轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 序列；94～116和180～205氨基酸片段為生物信息學(xué)軟件tmhmm(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)預(yù)測得到的跨膜區(qū)段；下劃線部分為生物信息學(xué)軟件interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)預(yù)測得到的?；D(zhuǎn)移酶功能域；162～168和235～237氨基酸片段為多序列比對與文獻(xiàn)報道的?；D(zhuǎn)移酶催化位點與底物結(jié)合位點。

使用t-coffee進(jìn)行多序列比對后使用neighbor-joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹軟件為mega6.0。與已證實的其它物種葉綠體lpaat基因有很高的同源性(圖3)。

實施例2功能驗證

以萊因衣藻cdna為模板，利用分別包含bamhi、hindiii限制性酶切位點的引物(正向引物，如seqidno.5所示，5'-tgacggatccatggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'，反向引物，如seqidno.6所示，5'-actgaagctttcactgctcatccggcgccatctctgt-3')和高保真聚合酶pfu進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得5'和3'含有相應(yīng)酶切位點的開放閱讀框dna片段。利用t4dna連接酶將該片段與經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體pqe30連接，獲得重組質(zhì)粒。利用熱擊法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入lpaat缺失的溫度敏感型大腸桿菌sm2-1(plsc-)(sm2-1來自耶魯大學(xué)大腸桿菌資源中心cgsc)感受態(tài)細(xì)胞中。與對照組(含有pqe30空載體)相比，轉(zhuǎn)化了crlpaat1基因的sm2-1菌株經(jīng)iptg誘導(dǎo)重組蛋白后，可以在42℃下生存，而對照組無法正常生長(圖4)。圖4a為構(gòu)建pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的方法。左圖為使用高保真dna聚合酶pfu從cdna文庫中克隆得到crlpaat1的片段；右圖為重組質(zhì)粒pqe30-crlpaat1的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4b為sm2-1lpaat缺陷型大腸桿菌體內(nèi)功能互補(bǔ)實驗的結(jié)果。pqe30為轉(zhuǎn)化了pqe30空質(zhì)粒的對照組，crlpaat1為轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的實驗組，菌液經(jīng)過5個梯度的稀釋后分別涂 在含有或不含有iptg誘導(dǎo)劑的lb平板上，再將平板置于30℃和42℃下培養(yǎng)。

圖4c為轉(zhuǎn)化了crlpaat1基因或轉(zhuǎn)化空載體的sm2-1菌株表達(dá)crlpaat1蛋白的westernblot檢測結(jié)果。m：bio-radprecisionplusproteinstandards。泳道1：轉(zhuǎn)化了crlpaat1基因的實驗組；泳道2：轉(zhuǎn)化了pqe30空載體的對照組。這說明crlpaat1在功能上回補(bǔ)了大腸桿菌plsc基因缺失所造成的無法在較高溫度如42℃下生存的表型。此實驗證明了crlpaat1基因在體內(nèi)具有溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶的活性。

實施例3體外酶活性測試

本發(fā)明中將轉(zhuǎn)化了crlpaat1基因的sm2-1大腸桿菌與轉(zhuǎn)化了pqe30空質(zhì)粒的sm2-1大腸桿菌在30℃培養(yǎng)并加入0.5mmiptg誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)6小時后，離心收集細(xì)胞。經(jīng)機(jī)械破碎及梯度離心的方法提取其膜組分并作為粗酶進(jìn)行了體外酶活實驗。實驗中選用多種不同碳鏈長短與飽和度不同的酰基-coa做為?；w，通過觀察產(chǎn)物磷脂酸(phosphatidicacid,pa)的積累量，以確定最適底物。酶反應(yīng)的條件為：在200μl100mm的磷酸鉀緩沖液(ph7.4)中含有250μm溶血性磷脂酸(lpa)，200μm脂酰輔酶a(acyl-coa)，1mmmgcl2與20μg粗酶。在加入粗酶后于30℃下振蕩反應(yīng)30min。后加入160μl5％冰醋酸終止反應(yīng)，再用blighanddyer方法提取總油脂，提取方法為：于反應(yīng)混合物中加入500μl氯仿甲醇(1:1，v/v)混合液，vortex振蕩10min，3000×g離心5min，將下層的氯仿層轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，使用真空濃縮儀吹干后加入30μl氯仿溶解。以氯仿甲醇水(65:25:4，v/v/v)的混合液為展開劑，利用薄層層析(tlc)的方法檢測產(chǎn)物的積累。

圖5a為分別使用14:0-coa、16:0-coa、18:0-coa、20:0-coa、22:0-coa、24:0-coa6種飽和脂肪酸作為?；w。sm2-1+lpaat1/heat：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1，高 溫加熱使粗酶失活作為陰性對照；sm2-1+lpaat1：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1作為實驗組。pa：磷脂酸標(biāo)樣；lpa：溶血性磷脂酸標(biāo)樣。圖5b為分別使用16:1-coa、17:1-coa、18:1n7-coa、18:1n9-coa、18:1n12-coa、18:2-coa、18:3n3-coa、18:3n6-coa、20:4-coa、20:5-coa、22:6-coa、24:1-coa12種不飽和脂肪酸作為?；w。sm2-1+lpaat1/heat：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1，高溫加熱使粗酶失活作為陰性對照；sm2-1+lpaat1：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1作為實驗組。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)crlpaat1對16:0-coa具有強(qiáng)烈的偏好性(圖5)。

另外，還選用多種溶血性磷脂酸(lysophosphatidicacid,lpa)作為?；荏w進(jìn)行了酶活性測試。分別使用14:0-lpa、16:0-lpa、17:0-lpa、18:1-lpa、20:4-lpa作為?；荏w，固定使用16:0-coa作為酰基供體進(jìn)行酶活實驗。sm2-1+empty：轉(zhuǎn)化了pqe30空質(zhì)粒的sm2-1作為對照組；sm2-1+lpaat1：轉(zhuǎn)化了pqe30-crlpaat1質(zhì)粒的sm2-1作為實驗組；eh：高溫加熱使粗酶失活的對照組，使用18:1-lpa作為酰基受體；lh：高溫加熱使粗酶失活的實驗組，使用18:1-lpa作為?；荏w。結(jié)果表明crlpaat1對18:1-lpa具有很強(qiáng)的偏好性(圖6)。

實施例4在異源系統(tǒng)中表達(dá)重組lpaat及其對宿主系統(tǒng)脂肪酸組成的改變(以釀酒酵母為例)。

以萊茵衣藻cdna為模板，利用分別包含hindiii、xbai限制性酶切位點的引物：(正向引物，如seqidno.7所示，5'-tgacaagcttatggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'，反向引物，5'-actgtctagatcactgctcatccggcgccatctctgt-3'，如seqidno.8所示)和高保真聚合酶pfu進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得5'和3'含有相應(yīng)酶切位點的開放閱讀框dna片段。利用t4dna連接酶將該片段與經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體pyes2/ct連接，獲得重組質(zhì)粒。利用化學(xué)方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型釀酒酵母invsc1感受態(tài)細(xì) 胞中。挑選的單菌落在sc-uglucose生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長期后離心收集菌體，棄掉上清后菌體重懸于sc-ugalactose誘導(dǎo)培養(yǎng)基中表達(dá)重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)crlpaat124小時后，收獲酵母細(xì)胞，利用修改后的blighanddyer方法提取了細(xì)胞內(nèi)總脂肪，過程為：將離心收集后的菌體重懸于160μl去離子水中，加入600μl氯仿甲醇(1:2，v/v)混合液與200μl玻璃珠，高速振蕩1min，加入200μl氯仿于室溫下混合均勻，加入200μl去離子水并混合均勻，在室溫下3000×g離心5min，將所有液相部分轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再向固相部分加入320μl氯仿，再次高速振蕩1min，于室溫下3000×g離心5min，將液相部分與第一次收集到的液相部分混合于同一個離心管中，于室溫下3000×g離心5min，將下部的氯仿層轉(zhuǎn)移至新的離心管中，使用真空濃縮儀吹干，加入50μl氯仿溶解提取到的總脂肪?？傊具M(jìn)行了轉(zhuǎn)甲酯化反應(yīng)，具體步驟為：在氯仿溶解的總脂肪中加入200μl氯仿甲醇(2:1，v/v)混合液，再加入300μl鹽酸甲醇(5:95，v/v)混合液，于85℃靜置1h，加入1ml正己烷，充分振蕩混勻后于室溫靜置3h，取200μl轉(zhuǎn)移至gc上樣瓶中并加入5μl十五烷用于定量。利用agilent7890bgc氣相色譜系統(tǒng)(火焰電離檢測器fid和hp-88柱(60m*0.25mm，0.2μm厚))定量分析了重組酵母細(xì)胞與對照(含有pyes2/ct空載體)的脂肪酸組成。氣相色譜條件：運(yùn)載氣體(氮氣)流速2mlmin^-1；不分流；注射器和fid溫度為250℃和280℃；柱箱溫度先50℃保持2min，然后以每分鐘增加25℃的速度至175℃，保持5min，繼續(xù)以每分鐘7℃速度增溫至210℃，保持2min，再以每分鐘2℃的速度升溫至230℃。

實驗結(jié)果表明，與對照組相比，crlpaat1重組酵母中16:0脂肪酸占總脂肪酸的比例顯著提高(p<0.05,t-test)，相比對照組提高了10.48％，而其他脂肪酸則沒有明顯變化(圖7)。此實驗證實在異源真核系統(tǒng)中，過量表達(dá)crlpaat1具有提高16:0脂肪酸含量的能力。

實驗結(jié)果表明，與對照組相比，crlpaat1重組酵母中16:0脂肪酸占總脂肪酸的比例顯著提高(p<0.05,t-test)，相比對照組提高了62.2％，另外一種飽和脂肪酸18:0的含量提高了16.3％(p<0.05,t-test),而其他不飽和脂肪酸的含量略有下降，如圖7a所示。與對照組相比，重組酵母tag(甘油三酯)中16:0脂肪酸的比例也有顯著提高，相比對照組提高了65.2％，如圖7b所示。此實驗證實在異源真核系統(tǒng)中，過量表達(dá)crlpaat1具有提高16:0脂肪酸含量的能力。另外,crlpaat1重組酵母的總脂肪酸含量與總tag(甘油三酯)含量較對照分別提高了16.1％(如圖7c所示)與53.04％(如圖7d所示)，說明在酵母系統(tǒng)中過量表達(dá)crlpaat1能顯著提高油脂的含量。

實施例5在衣藻中表達(dá)lpaat及其對宿主系統(tǒng)脂肪酸組成的改變

以萊茵衣藻cdna為模板，利用分別包含ecori、xbai限制性酶切位點的引物：(正向引物，seqidno.9所示，5'-ggaattcatggcgcgtaaaagcag-3'；反向引物，如seqidno.10所示，5'-gctctagactactgctcatccggc-3')和高保真聚合酶pfu進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得5'和3'含有相應(yīng)酶切位點的開放閱讀框dna片段。利用ecori和xbai進(jìn)行雙酶切并將其與同樣經(jīng)過ecori和xbai雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pchlamy_4中，獲得重組質(zhì)粒。利用化學(xué)方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)dh5α中。挑選可以在amp⁺的瓊脂平板上生長的陽性單菌落在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長期后離心收集菌體。提取質(zhì)粒并利用scai對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，使環(huán)狀質(zhì)粒變?yōu)榫€性質(zhì)粒。

在正常tap培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型萊茵衣藻cw15至對數(shù)中期(約1-2×10⁶細(xì)胞ml^-1)，通過4000g離心5分鐘收集藻細(xì)胞，棄去上清并用新鮮的tap重懸沉淀至2×10⁸細(xì)胞ml^-1。將線性化后的質(zhì)粒通過玻璃珠法轉(zhuǎn)入細(xì)胞壁部分缺陷型萊茵衣藻cw15中。轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：重懸藻液300μl，無菌玻璃珠(直徑為0.4mm)0.3g，線性化質(zhì)粒 1μg，添加20％無菌聚乙二醇(peg)100μl維持細(xì)胞滲透壓。轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在vortexgenie-2渦旋震蕩器上劇烈震蕩15s后轉(zhuǎn)入15ml無菌螺帽離心管中，并加入10mltap培養(yǎng)基。將該離心管置于100rpm搖床孵育18h后離心收集藻細(xì)胞，沉淀的藻細(xì)胞重懸至1mltap培養(yǎng)基中。取100μl重懸細(xì)胞涂布在zeocin⁺的tap瓊脂平板上，在光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-7天，獲得單藻落的轉(zhuǎn)化株。

從平板中挑取單藻落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對挑取的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行pcr驗證。具體操作如下：取1ml藻液離心去上清，加入100mmedta混勻，100℃加熱5min，劇烈震蕩后瞬時離心，取1.5μl上清作為模板加入到pcr反應(yīng)體系中。pcr反應(yīng)體系包括1.5μl模板，10μl2×gotaqdnapolymerasemix,1μl正向引物(10μm)，1μl反向引物(10μm)，2μl100％dmso，最后補(bǔ)充去離子水至20μl。pcr反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。其中驗證插入引物為：正向引物，如seqidno.3所示，5'-atggcgcgtaaaagcagtttggctc-3'；反向引物，如seqidno.4，5'-ctgctcatccggcgccatctctgt-3'。

對經(jīng)過驗證的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行qpcr篩選crlpaat基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。以rack1基因為內(nèi)參基因設(shè)計引物正向引物，如seqidno.11所示，5'-aggatgtgctgtccgtggctt-3'；反向引物，如seqidno.12所示，5'-acctgggccttcttgctggtgatgt-3'，目的基因正向引物如seqidno.13所示，5'-ccaactcagactccgctcctca-3'；反向引物，如seqidno.14所示，5'-agcctgtccccagcagtgtgat-3'。rtq-pcr反應(yīng)體系為：2×sybrmastermix10μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，cdna(50ngμl^-1)1μl，補(bǔ)充depc水至20μl。pcr反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min，95℃變性10s，61℃退火 30s，72℃延長30s，40個循環(huán)，熔解曲線：65℃至95℃，每0.05s增加0.5℃。

對于經(jīng)過qpcr驗證crlpaat基因在rna水平顯著提高的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體培養(yǎng)，將培養(yǎng)至第三天的對數(shù)期細(xì)胞離心并用缺氮tap液體培養(yǎng)基洗滌一次后接種到缺氮tap液體培養(yǎng)基中進(jìn)行油脂積累誘導(dǎo)。在缺氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后離心收獲藻細(xì)胞，冷凍干燥獲得凍干藻粉。利用修改后的blighanddyer方法提取了細(xì)胞內(nèi)總脂肪，過程為：稱取10mg凍干藻粉，加入6ml提取液1(甲醇:氯仿:88％甲酸＝20:10:1，v:v:v)，震蕩器上劇烈震蕩15-20min，加入3ml提取液2(0.2m磷酸，1m氯化鉀)，充分混勻后1000g離心5min，用巴斯德吸管吸取下層氯仿層至新的玻璃管中，氮氣吹干后加200μl氯仿復(fù)溶油脂。對提取的油脂進(jìn)行總脂肪酸分析和三酰甘油酯成分和含量分析。其中，總脂肪酸含量分析首先進(jìn)行轉(zhuǎn)甲酯化反應(yīng)，具體步驟為：在氯仿溶解的總脂肪中加入200μl氯仿甲醇(2:1,v/v)混合液，再加入300μl鹽酸甲醇(5:95,v/v)混合液，于85℃靜置1h，加入1ml正己烷，充分振蕩混勻后于室溫靜置3h，取200μl轉(zhuǎn)移至gc上樣瓶中并加入5μl十五烷用于定量。利用agilent7890bgc氣相色譜系統(tǒng)(火焰電離檢測器fid和hp-88柱(60m×0.25mm，0.2μm厚))定量分析了過表達(dá)藻株r16-1與對照(野生型cw15)的脂肪酸組成。氣相色譜條件：運(yùn)載氣體(氮氣)流速2mlmin^-1；不分流；注射器和fid溫度為250℃和280℃；柱箱溫度先50℃保持2min，然后以每分鐘增加25℃的速度至175℃，保持5min，繼續(xù)以每分鐘7℃速度增溫至210℃，保持2min，再以每分鐘2℃的速度升溫至230℃。分析三酰基甘油酯(triacylglyerol,tag)成分及含量首先要對提取的油脂進(jìn)行薄層層析(thinlayerchromatography,tlc)以分離tag，tlc操作如下：取10μl氯仿溶解的總脂依次在tlc板上點樣，待樣品點干燥后置于層析槽中， 展層劑配方如下：石油醚70ml，乙醚30ml，乙酸1ml。展層結(jié)束后用固體碘進(jìn)行可逆染色，將tag點從tlc板上刮取下來，轉(zhuǎn)入安捷倫甲酯化反應(yīng)瓶種，加入200μl上述氯仿甲醇溶劑后渦旋震蕩20min后加入300μl上述鹽酸甲醇進(jìn)行甲酯化和gc-ms分析，后續(xù)操作與上述總脂肪酸分析一致。

實驗結(jié)果表明，crlpaat過表達(dá)的衣藻轉(zhuǎn)化子r16-1的脂肪酸總含量比對照組提高了34.75％(圖8)。其中16:0脂肪酸占總脂肪酸的比例提高5％，c16:1的比例提高23.96％，18:1脂肪酸含量提高9.8％，18:0脂肪酸含量提高6.09％，其他脂肪酸含量略有下降(圖9)。過表達(dá)藻種r16-1中tag含量較野生型提高了15.99％(圖10)，tag中各脂肪酸各組分含量也有變化：16:0脂肪酸的含量提高了7.51％,16:1脂肪酸含量提高了13.30％，18:0脂肪酸含量提高了19.35％，c18:1,18:2及18:3脂肪酸的含量略有降低。此實驗證實在微藻表達(dá)系統(tǒng)中，過量表達(dá)crlpaat1具有提高總脂、tag、以及改變脂肪酸組成的能力(圖11)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。