本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及裂殖壺菌delta-12脂肪酸脫飽和酶相關(guān)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

△12脂肪酸脫飽和酶(脂肪酸脫氫酶或fad2)是胞內(nèi)膜結(jié)合酶，負(fù)責(zé)在單不飽和脂肪酸碳鏈的第12位和13位碳原子之間引入一個(gè)雙鍵，形成多不飽和脂肪酸，是催化胞內(nèi)油酸到亞油酸代謝途徑的酶。

現(xiàn)已有多個(gè)△12脂肪酸脫飽和酶申請(qǐng)，如us20090186362，us20070254299，us20070028328，us20060263867，us20060263866，us20050043527，us20031072398，us9057083，us7262343，us7214491，us2009186362，us2003172398，wo2004104167，cn104212819，cn102220352，cn102199661，cn102021188。該基因一般用于構(gòu)建產(chǎn)多不飽和脂肪酸重組微生物或植物，如杜邦公司cn200480019580.3中的重組酵母，澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織的cn200980154876.9和cn201210006139.8中的重組細(xì)胞，用于生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸；巴斯夫公司的cn200580007428.8中，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸專(zhuān)利等等，都有用到△12脂肪酸脫飽和酶。雖然選作產(chǎn)脂重組生物的宿主大多都具備較高的產(chǎn)脂肪酸能力，但為了獲得更高效率，突破宿主自身的代謝調(diào)控束縛，一般都需要以重組表達(dá)的方式，構(gòu)建一整套的脂肪酸脫飽和、延長(zhǎng)系統(tǒng)，包含△9，△12和/或△15三個(gè)脂肪酸脫飽和酶，實(shí)現(xiàn)亞油酸、亞麻酸合成的加強(qiáng)，然后根據(jù)產(chǎn)物的需要選擇△6，或△6，△5，或△6，△5，△4脫飽和酶，用來(lái)特異地生產(chǎn)c18:4sda，c20:4ara，c20:5epa，c22:6dha等脂肪酸。基本上△12是改造必需的基因。

裂殖壺菌(schizochytrium)又稱裂壺藻，屬于破囊壺菌科的一類(lèi)海洋真菌。裂壺菌能夠積累大量活性物質(zhì)，如dha、胡蘿卜素、蝦青素。采用葡萄糖或甘 油做碳源發(fā)酵，細(xì)胞干重可達(dá)到150克/升，油脂占細(xì)胞干重能到70％以上，dha占總脂肪酸35％以上，且主要以甘三酯形式存在，少量以卵磷脂形式存在〔魏萍等，裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)dha研究進(jìn)展，食品工業(yè)科技，2010，20:398-404〕。

裂殖壺菌內(nèi)有兩套脂肪酸合成途徑，其中fas(fattyacidsynthase)系統(tǒng)直接產(chǎn)物為c14:0和c16:0脂肪酸，然后通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)、去飽和系統(tǒng)衍生為其他產(chǎn)物。pks(polyketidesynthaseorpufasynthase)系統(tǒng)直接產(chǎn)物為c22:5(dpa)和c22:6(dha)。有研究者通過(guò)添加放射性底物的方式研究了裂壺藻內(nèi)脂肪酸的代謝途徑〔lippmeieretal.characterizationofbothpolyunsaturatedfattyacidbiosyntheticpathwaysinschizochytriumsp.,lipids,2009,44:621-630〕。該文章發(fā)現(xiàn)裂壺藻內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到△9以及△12兩種脂肪酸脫飽和酶的活性，但裂壺藻在多篇公開(kāi)發(fā)表的發(fā)酵結(jié)果中可以檢出油酸(△9脫飽和酶的產(chǎn)物)，但亞油酸始終未見(jiàn)報(bào)道，因此目前認(rèn)為裂壺藻內(nèi)不存在△12脫飽和酶，這是經(jīng)典fas產(chǎn)物衍生途徑無(wú)法產(chǎn)生dha的主要原因。

不過(guò)，有文章報(bào)道了裂壺藻親緣菌破囊壺菌(thraustochytrium)中發(fā)現(xiàn)了△12脂肪酸脫飽和酶〔takanorimatsuda,etal.,theanalysisof△12-fattyaciddesaturasefunctionrevealedthattwodistinctpathwaysareactivefrothesynthesisofpolyunsaturatedfattyacidsinthraustochytriumaureumatcc34304，journaloflipidresearch,2012〕。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從裂壺藻基因組中擴(kuò)增出△12-脫飽和酶的基因，并將之構(gòu)建到裂壺藻內(nèi)進(jìn)行內(nèi)源性表達(dá)。結(jié)果在重組裂壺藻胞內(nèi)檢測(cè)到了亞油酸，而野生型菌或轉(zhuǎn)化有其他脂肪酸脫飽和酶的重組裂壺藻中未能檢出。表明該基因具有△12-脫飽和酶活性。

具體而言，本發(fā)明提供一種多肽，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

本發(fā)明第二方面提供一種多核苷酸序列，其編碼seqidno:2所示的氨基酸序列。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸序列具有seqidno:1所示的核苷酸序列。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸序列由seqidno:1所示的核苷酸序列組成。

本發(fā)明還提供一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物含有本發(fā)明所述的多核苷酸序列。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建物含有seqidno:1所示的核苷酸序列。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建物是克隆載體或表達(dá)載體。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建物含有35s啟動(dòng)子。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建物以pgapzαa質(zhì)粒為骨架。

本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞含有本發(fā)明所述核酸構(gòu)建物。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為微生物細(xì)胞。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種裂壺藻，所述裂壺藻與野生型相比能產(chǎn)生亞油酸。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述裂壺藻含有含本發(fā)明所述的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，與野生型相比，所述裂壺藻產(chǎn)c16:1、c18:2、c20:4和/或epa的能力提高。

本發(fā)明還提供一種制備產(chǎn)亞油酸的裂壺藻的方法，所述方法包括將含本發(fā)明的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入所述裂壺藻細(xì)胞中的步驟。

本發(fā)明還提供一種提高裂壺藻產(chǎn)c16:1、c18:2、c20:4和/或epa的方法，所述方法包括將含本發(fā)明的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入所述裂壺藻細(xì)胞中的步驟。

附圖說(shuō)明

圖1顯示dha的產(chǎn)生途徑。裂壺藻脂肪酸的合成天然地被阻斷在c18:2的產(chǎn)生這一步，18:3、18:4、20:3、20:4、20:5等功能性脂肪酸無(wú)法合成，fas產(chǎn)物的脂肪酸停留在功能較弱的c16:0階段。

圖2顯示本發(fā)明載體酶切產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。m為takara公司dl5000dnamarker。1-4泳道分別為12des-1,12des-2,12des-3，12des-4四個(gè) 克隆提取得到的重組質(zhì)粒酶切結(jié)果。

圖3顯示本發(fā)明一個(gè)載體的結(jié)構(gòu)圖譜。

圖4顯示在ncbi上用seqidno:2所示的氨基酸序列進(jìn)行blastp分析的結(jié)果。同源比對(duì)結(jié)果表明，本發(fā)明所述蛋白屬于膜結(jié)合的脂肪酸脫飽和酶家族。

圖5顯示本發(fā)明氨基酸序列的同源性對(duì)比結(jié)果。結(jié)果顯示，同源性最高的目標(biāo)為thrausotchytriumaureum的△12脂肪酸脫飽和酶，氨基酸一致性最高為47％。

圖6顯示為重組裂壺藻菌落pcr檢驗(yàn)的電泳照片。a中m為takara公司dl5000dnamarker。1-8泳道分別為s12des-1，s12des-2，s12des-3，s12des-4，s12des-5，s12des-6，s12des-7，s12des-8，8個(gè)抗性陽(yáng)性菌落pcr檢驗(yàn)結(jié)果。b中m為takara公司dl5000dnamarker。4-1,4-2，4-3，4-4，4-5，4-6，4-7，4-8分別為轉(zhuǎn)化有4des基因的重組裂壺藻菌落pcr檢驗(yàn)電泳。5-1，5-2，5-3，5-4，5-5，5-6，分別為轉(zhuǎn)化有5des基因的重組裂壺藻菌落pcr檢驗(yàn)電泳。

圖7顯示分別對(duì)野生型(wt)以及分別轉(zhuǎn)入了△4脫飽和酶、△5脫飽和酶和△12脫飽和酶的重組菌的脂質(zhì)氣相色譜分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

裂壺藻脂肪酸的合成天然地被阻斷在c18:2的產(chǎn)生這一步，18:3、18:4、20:3、20:4、20:5等功能性脂肪酸無(wú)法合成，fas產(chǎn)物的脂肪酸停留在功能較弱的c16:0階段。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)裂壺藻中△12脫飽和酶基因。該基因的發(fā)現(xiàn)，使基于裂壺藻fas系統(tǒng)的脂肪酸組成優(yōu)化成為可能。通過(guò)該基因活性的加強(qiáng)，促進(jìn)fas系統(tǒng)產(chǎn)物向傳統(tǒng)多不飽和脂肪酸合成途徑的轉(zhuǎn)移，充分發(fā)揮裂壺藻高效產(chǎn)脂的性能，從而得到dha+功能油脂的優(yōu)秀生產(chǎn)菌株。

本發(fā)明的△12脫飽和酶具有如seqidno:2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明還包括在seqidno:2所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行保守性取代時(shí)所獲得的多肽。這種保守性取代通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能?！靶阅芟嘟蛳嗨频陌被帷卑ɡ?，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在本發(fā)明多肽中用來(lái)自同一側(cè)鏈類(lèi)的另一氨基酸殘基替換一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)，將不會(huì)在實(shí)質(zhì)上影響其活性。

本發(fā)明因此包括在seqidno:2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，同時(shí)保留seqidno：2所具備的脂肪酸脫飽和酶活性的由seqidno:2衍生的多肽。所述幾個(gè)通常為10個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選8個(gè)以內(nèi)，更優(yōu)選5個(gè)以內(nèi)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用常規(guī)的技術(shù)手段判斷seqidno:2所示的氨基酸序列中哪些氨基酸殘基可被取代或刪除。例如，通過(guò)比對(duì)來(lái)自不同種屬、活性相同或類(lèi)似或明顯不同的序列，可以判斷這些序列中哪些氨基酸殘基是可以被取代或刪除?？刹捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法(包括本發(fā)明所公開(kāi)的方法)驗(yàn)證這樣的序列是否具備本發(fā)明所述的酶活。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢(shì)必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動(dòng)分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的n-末端、c-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、麥芽糖e結(jié)合蛋白、蛋白a、或xa因子或凝血酶或腸激酶的蛋白水解酶位點(diǎn)。本發(fā)明氨基酸序列的氨基端或羧基端還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。這些標(biāo)簽可用于對(duì)蛋白進(jìn)行純化。使用的標(biāo)簽例子包括poly-arg，如rrrrr；poly-his2-10個(gè)(通常6個(gè))，如hhhhhh；flag，即dykddddk；strep-tagii，即wshpqfek；和c-myc，即wqkliseedl。應(yīng)理解，這些氨基酸序列的存在不會(huì)影響到所得多肽的活性。因此，本發(fā)明也包括在本發(fā)明多肽的c末端和/或n末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸所得的多肽，這些多肽仍具有本文所述的pnppc水解活性。

因此，本發(fā)明也包括與seqidno:2所示的氨基酸序列具有至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％，更優(yōu)選至少99％序列相同性的氨基酸序列。可采用常規(guī)的手段計(jì)算比對(duì)的兩條序列的序列相同性，例如，采用ncbi提供blastp，采用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對(duì)。

根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。

本申請(qǐng)包括本發(fā)明多肽的編碼序列。seqidno:1顯示了本發(fā)明多肽的編碼序列之一。所述“編碼序列”包括與seqidno:1高度同源的序列或在嚴(yán)格條件下與seqidno：1雜交的核苷酸序列或與上述分子高度同源的家族基因分子。編碼本發(fā)明多肽的序列可以與seqidno：1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼包含seqidno：2所示的氨基酸序列，但與seqidno：1所示的核苷酸序列有差別的核苷酸序列。

編碼本發(fā)明多肽的序列包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。

本發(fā)明的多肽的編碼序列或其片段通常可以用pcr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于pcr擴(kuò)增法，可先采用常規(guī)的技術(shù)手段從裂壺藻中獲取基因組dna，然后再根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，用于從裂壺藻基因組dna中擴(kuò)增出△12脫飽和酶基因。

因此，本發(fā)明也包括本發(fā)明編碼序列的片段，所述片段通常長(zhǎng)10～40個(gè)堿基，能作為引物或探針使用。“片段”在本文中指全長(zhǎng)序列的連續(xù)的一部分序列。

本發(fā)明另一方面也涉及一對(duì)引物，其核苷酸序列如seqidno:3和4所示。

本發(fā)明也涉及包括核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物含有本發(fā)明的編碼序列以及與該編碼序列操作性連接并指導(dǎo)該編碼序列在宿主細(xì)胞中在合適的條件下表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列。編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸可以各種方式被操作， 以保證該多肽的表達(dá)。在其插入載體之前該多核苷酸序列的操作可能根據(jù)該表達(dá)載體而是合乎需要或必需的。利用重組dna方法來(lái)改變多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。

調(diào)控序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，為由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列包含接到多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合啟動(dòng)子，并且可以從編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。適用于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列例子包括35s啟動(dòng)子。

調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，為由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼該多肽的核苷酸序列的3′末端可操作連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。

調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，對(duì)宿主細(xì)胞翻譯重要的mrna的非翻譯區(qū)。簽到序列與編碼該多肽的核苷酸序列的5′末端可操作連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。

調(diào)控序列也可以是編碼與多肽的氨基酸末端連接的氨基酸序列并且指導(dǎo)該編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)。核苷酸序列編碼序列的5′端可固有地包含天然連接具有編碼分泌多肽的編碼區(qū)節(jié)段的翻譯閱讀框的信號(hào)肽編碼區(qū)。備選地，編碼序列的5′端可包含與該編碼區(qū)外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列非天然地包含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)。備選地，外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替換天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)，即分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，都可用于本發(fā)明。

本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明多核苷酸的重組表達(dá)載體。在此各種核酸和調(diào)控序列可被連接在一起以產(chǎn)生可能包括一個(gè)或多個(gè)容許在這種位點(diǎn)插入或取代該編碼多肽的核苷酸序列的方便限制性位點(diǎn)的重組表達(dá)載體。在制造表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于載體中以使得該編碼序列可操作地連接用于表達(dá)適當(dāng)調(diào)控序列。

重組表達(dá)載體可以是能夠方便地經(jīng)受重組dna方法并且可導(dǎo)致感興趣的核苷酸序列表達(dá)的任何載體(如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇一般取決于載體與 其中被導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。

載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含用于保證自我復(fù)制的任何方式。備選地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，整合到基因組中并且與其已經(jīng)被整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用一起包含將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總dna的單個(gè)載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)容許容易選擇轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞的可選擇標(biāo)記。可選擇的標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供對(duì)抗生素或病毒的抗性、對(duì)重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營(yíng)養(yǎng)缺陷型等。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含容許該載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主個(gè)復(fù)制的元件。

一個(gè)以上拷貝的本發(fā)明的多核苷酸可被插入宿主細(xì)胞以增加該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)將至少一個(gè)附加拷貝的序列整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或通過(guò)包括可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因和該多核苷酸來(lái)獲得，其中包含擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因并且由此包含附加拷貝多核苷酸的細(xì)胞可通過(guò)在存在適當(dāng)?shù)倪x擇劑時(shí)培養(yǎng)該細(xì)胞來(lái)篩選。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，能為外源dna提供多種可插入的位置或插入方案。

本發(fā)明的表達(dá)載體更為優(yōu)選包含有連續(xù)6個(gè)組氨酸序列的小肽，有利于蛋白質(zhì)的提取和純化。

本發(fā)明也涉及包括被用于重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。包括本發(fā)明多核苷酸的載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使得該載體如早先說(shuō)明的作為染色體的組成部分或作為染色體外的自我復(fù)制載體來(lái)維持。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。

宿主細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或單細(xì)胞微生物或非單細(xì)胞微生物。單細(xì)胞微生物例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等；或鏈霉菌細(xì)胞，例如 錢(qián)青紫鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和假單胞菌屬。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主是枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和大腸桿菌細(xì)胞。

宿主細(xì)胞也可以是真核生物，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、酵母或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(mén)(ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(basidiomycota)、壺菌門(mén)(chytridiomycota)、接合菌門(mén)(zygomycota)以及卵菌門(mén)等。

在更優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。如在此使用的“原核細(xì)胞”包括假單胞菌屬(pseudomonas)、芽孢桿菌屬(bacillus)、腸桿菌屬(enterobacter)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈霉菌屬(streptomyces)以及埃希氏菌屬(escherichia)的細(xì)菌。在更為優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬以及埃希氏菌屬的細(xì)胞。

在最優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、大腸桿菌(escherichiacoli)以及變鉛青鏈霉菌(streptomyceslividans)等。在另外最優(yōu)選方面，宿主細(xì)胞是大腸桿菌(escherichiacoli)細(xì)胞。

本發(fā)明還包括一種裂壺藻，與野生型相比，所述裂壺藻能產(chǎn)生亞油酸(c18:2)。優(yōu)選的是，與野生型相比，所述裂壺藻產(chǎn)c16:1、c18:2、c20:4、或epa的能力提高。

“野生型”裂壺藻在本文中指購(gòu)自atcc，編號(hào)atcc20888的裂壺藻。

本發(fā)明的裂壺藻優(yōu)選含有含本發(fā)明所述的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物。

可采用常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法將含本發(fā)明多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入裂壺藻中。轉(zhuǎn)染通常分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。前者外源dna/rna不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中，外源dna既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。轉(zhuǎn)染的技術(shù)手段包括化學(xué)轉(zhuǎn)染和物理轉(zhuǎn)染，前者如deae-葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質(zhì)體法，后者如顯微注射、電穿孔和基因槍等。

本發(fā)明還提供一種制備產(chǎn)亞油酸的裂壺藻的方法，所述方法包括將含本發(fā)明的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入所述裂壺藻細(xì)胞中的步驟。

本發(fā)明還提供一種提高裂壺藻產(chǎn)c16:1、c18:2、c20:4和/或epa的方法，所述方法包括將含本發(fā)明的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入所述裂壺藻細(xì)胞中的步驟。

本發(fā)明上述方法中，在將含本發(fā)明多核苷酸序列的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入裂壺藻細(xì)胞中后，可采用常規(guī)的發(fā)酵裂壺藻的方法進(jìn)行發(fā)酵，從而制備獲得含有c18:2、c16:1、c20:4和epa的脂質(zhì)。

下文將以具體實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施方式。實(shí)施例中所采用的反應(yīng)試劑、條件等，除非另有說(shuō)明，否則為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑、條件等。

實(shí)施例1

接種裂壺藻(schizochytriumsp.atcc20888)到50mlypd液體培養(yǎng)基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，ph6.5)中培養(yǎng)48h，4℃4000rpm離心5min收集菌體并用去離子水洗滌2遍，將菌體在液氮中磨碎，然后使用takara公司minibestuniversalgenomicdna提取試劑盒提取基因組dna。

以基因組dna為模板，分別使用引物12u：

aagcggcggccgcatgtgcaaggtcgagaccaag(seqidno:3)及引物12d：

gttctagaacgaggacctttgc(seqidno:4)；使用引物4u：

aaagcggccgcatgacggtcgggtacgacgag(seqidno:5)及引物4d：

aaatctagaacagcccgcgccgcatgc(seqidno:6)；使用引物5u：

aaagcggccgcatgggcaagggcagcgag(seqidno:7)；5d：

aaatctagaacgtcgcgcttggcgtcgccgac(seqidno:8)及takara公司la-taq酶擴(kuò)增疑似△12脫飽和酶基因，△4脫飽和酶基因，△5脫飽和酶基因。通過(guò)引物，在這三個(gè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的5’端引入noti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在3’端引入xbai限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

pcr體系為50ul，組成為水13.5ul、2×gci緩沖液25ul、dntps6ul、引物各2ul(20μm母液)、la-tag0.5ul，模板1ul。

pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃變性5分鐘；12個(gè)循環(huán)的熱不對(duì)稱pcr：95℃30秒、63℃30、72℃1.5min、95℃30秒、63℃30、72℃1min、95℃30秒、44℃30、 72℃1.5min；72℃10分鐘。

pcr產(chǎn)物使用omega公司cyclepure試劑盒純化，純化物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。然后使用neb公司noti-hf酶切，酶切體系為水25μl，4#緩沖液10μl，pcr產(chǎn)物60μl，noti–hf5μl，酶切在37℃水浴中進(jìn)行2h。使用omega公司cyclepure試劑盒純化酶切的產(chǎn)物，純化物用去離子水洗脫成30μl。

使用引物35su：aaaagatctaatggcgaatgctagagcagctt(seqidno:9)及，35sd：aaccatggtcaagagtcccccgtgttctctcc(seqidno:10)及，以pcambia1301(cambia公司)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增35s啟動(dòng)子片段。

pcr體系為pcr體系為pcr體系為水18.1μl，dntps(各2.5mm)2μl，10×pcr緩沖液2.5μl，20um引物各1μl，0.4μlex-taqdna聚合酶。

pcr反應(yīng)條件為：95℃5分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃50s、52℃40s、72℃30s；72℃10min。

pcr產(chǎn)物使用omega公司cyclepure試劑盒純化回收后，使用neb公司noti-hf限制性內(nèi)切酶單切，體系為：水23μl；3#緩沖液5μl；pcr產(chǎn)物20μl；酶2μl。37℃酶切2h。然后使用omega公司cyclepure試劑盒回收純化，獲得35s啟動(dòng)子酶切的片段。

使用fermentas公司t4dna連接酶將基因酶切片段與35s啟動(dòng)子酶切載體連起來(lái)，連接體系為：水15.5μl，10×t4dna連接酶緩沖液2μl，基因片段2μl，載體片段0.5μl。連接條件為16℃2h。取連接物1μl作為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使用引物35su及12d；35su及4d；35su及5d分別擴(kuò)增12des、4des、5des的35s-基因構(gòu)建片段。pcr體系為水18.1μl，dntps(各2.5mm)2μl，10×pcr緩沖液2.5μl，20um引物各1μl，0.4μlex-taqdna聚合酶，模板1μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃5分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃50s、52℃40s、72℃90s；72℃10min。

pcr產(chǎn)物使用omega公司cyclepure試劑盒純化回收得到35s-12des片段，35s-4des片段，35s-5des片段，然后使用neb公司bglii、xbai限制性內(nèi)切酶雙切，體系為：水20μl；3#緩沖液5μl；pcr產(chǎn)物20μl；酶各2.5μl。37℃酶切2h。

然后使用omega公司cyclepure試劑盒回收純化，獲得35s啟動(dòng)子-基因的連接片段酶切物。同時(shí)使用bglii、xbai雙酶切pgapzαa質(zhì)粒，酶切體系為水20μl；3#緩沖液5μl；pcr產(chǎn)物20μl；酶各2.5μl。37℃酶切2h。然后使用 omega公司cyclepure試劑盒回收純化，得到載體酶切物。

使用fermentas公司t4dna連接酶將35s-12des、35s-4des、35s-5des酶切片段與載體酶切載物連起來(lái)，連接體系為：水15.5μl，10×t4dna連接酶緩沖液2μl，基因片段2μl，載體片段0.5μl。連接條件為16℃2h。

連接物取10ul加入到200ul大腸桿菌dh5α感受態(tài)(takara公司d9057)中，輕柔混勻，冰浴30分鐘后42℃水浴熱激90秒，立即冰浴2分鐘并加入800ul新鮮lb培養(yǎng)液(蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph7.0)，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)40分鐘后涂布50ul到lb平板(lb培養(yǎng)液加1.8％瓊脂粉，含zeocin50ug/ml)，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。

隨機(jī)接種4株具抗性的菌落到5mllb培養(yǎng)液中(含50ug/mlzeocin)，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使用axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并使用bglii、xbai雙酶切鑒定，酶切體系為：水11μl；3#緩沖液2μl；質(zhì)粒產(chǎn)物6μl；酶各1μl。同時(shí)酶切pgapaαa空質(zhì)粒對(duì)照。酶切在37℃水浴中保溫2h。酶切產(chǎn)物直接使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。酶切產(chǎn)物理論大小為1.9kb的基因片段+2.3kb的剩余載體。電泳結(jié)果如圖2所示，載體圖譜如圖3所示。

將載體送出測(cè)序，所得序列如seqidno:1所示。推測(cè)的氨基酸序列如seqidno:2所示。

將上述氨基酸序列在ncbi上進(jìn)行blastp分析，同源比對(duì)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，該基因?qū)儆谀そY(jié)合的脂肪酸脫飽和酶家族。

同源性最高的目標(biāo)為thrausotchytriumaureum的△12脂肪酸脫飽和酶，氨基酸一致性最高為47％，如圖5所示。

實(shí)施例2

按照cn02812059所述的方法，將所構(gòu)建的載體使用基因槍法轉(zhuǎn)化到裂壺藻細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含100ug/ml博萊霉素的平板(2％葡萄糖，1％酵母粉，2％蛋白胨，1.8％海鹽，2％瓊脂)，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。

將抗性菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上，再次進(jìn)行培養(yǎng)。直至菌落長(zhǎng)出。挑選單菌落進(jìn)行菌落pcr。在無(wú)菌pcr中加入10μl無(wú)菌的0.5％tritonx-100水溶液，挑裂壺藻單菌落進(jìn)去并懸浮均勻，將pcr管水浴煮沸10min，稍微離心后取上清作為模板，進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增。pcr使用引物對(duì)35su及aoxtt引物： ggcaaatggcattctgacat(seqidno:11)，pcr體系為水33.5μl，10×pcr緩沖液5μl，dntps4μl，aoxtt1μl，35su1μl，rtaq酶0.5μl，模板5μl。pcr程序?yàn)閜cr反應(yīng)條件為：95℃5分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃50s、50℃40s、72℃2min；72℃10min。所得pcr檢驗(yàn)陽(yáng)性的菌標(biāo)記為12des。按照相同的步驟，得到4des、5des的重組裂壺藻。分別為表達(dá)疑似△4脂肪酸脫飽和酶基因的重組裂壺藻，表達(dá)疑似△5脂肪酸脫飽和酶基因的重組裂壺藻。

挑選菌落pcr陽(yáng)性的裂壺藻s12des-1，s4des-1及s5des-1，接種到種子培養(yǎng)基中(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，1.8％海鹽，ph6.5)，28℃200rpm搖床培養(yǎng)2天得到種子液。然后按10％的比例轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，1.8％海鹽，ph6.5)，28℃200rpm培養(yǎng)4天。

室溫下，于4000rpm離心5min收集細(xì)胞，60℃烘箱烘干，并在研缽中磨成粉。按照文獻(xiàn)公開(kāi)的方法(蔣霞敏，鄭亦周，14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究，《水生生物學(xué)報(bào)》，2003，27(3):243-247)提取脂質(zhì)并甲酯化，進(jìn)行氣象色譜分析。

顯然，野生型菌株(wt)以及轉(zhuǎn)化有其他脫飽和酶基因的重組菌(△4脫飽和酶，△5脫飽和酶)都沒(méi)有檢出亞油酸(c18:2)，而轉(zhuǎn)化有△12脫飽和酶的重組菌有亞油酸的明顯變化，油酸的含量顯著降低。表明本發(fā)明所獲基因有△12脂肪酸脫飽和的活力。此外，c16:1的含量也顯著增加，懷疑該基因可能還有△9脫飽和酶的活力。

幾株藻內(nèi)脂肪酸組成為：