本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可調(diào)節(jié)的熒光素酶分段融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著對亞細胞結(jié)構(gòu)和功能、分子生理和病理、細胞間和細胞內(nèi)信號通路研究的深入，人類對疾病和對生命本質(zhì)的認識不斷追朔到蛋白質(zhì)、基因水平。而許多生命活動是以蛋白質(zhì)分子的結(jié)合和解離來實現(xiàn)的，細胞的各種重要生理活動，細胞對外界環(huán)境及內(nèi)環(huán)境作用的反應(yīng)等，均是以蛋白質(zhì)間相互作用為紐帶，通過調(diào)控、介導(dǎo)細胞的生物學活性，形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，對蛋白質(zhì)相互作用的深入研究是認識和理解各種生命現(xiàn)象的必要前提。

熒光素酶在有氧的條件下通過催化底物氧化而產(chǎn)生熒光，發(fā)射波長范圍為400-600nm，峰值在450-500nm，且因其靈敏性高，特異性好，反應(yīng)迅速，無生物性毒害等優(yōu)勢，可實時靶向基因分子事件、細胞生命活動、動物生理病理等生物學過程，是研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的重要基礎(chǔ)，目前被廣泛應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物研發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域。

傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用的方法有酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標記等，但這些方法存在假陽性高，不能獲得定量化信息，在實際的生理環(huán)境中需要破碎細胞造成機械損傷，無法做到在活細胞生理條件下實時監(jiān)測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用等缺陷?，F(xiàn)今最為常見的活細胞蛋白質(zhì)相互作用模型有2種，一種是cfp和yfp等熒光蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)。這種技術(shù)由于熒光蛋白的量子產(chǎn)率低，供體與受體熒光光譜的差異小等問題，在實際開展中導(dǎo)致檢測通道間相互干擾，高背景噪音等現(xiàn)象，要求非?？量痰男蔬^程去除干擾降噪，這些都極大地限制了該技術(shù)進一步的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。另外一種是雙分子熒光互補技術(shù)用于細胞體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用動態(tài)研究。cn101620233a公開了一種利用雙分子熒光互補技術(shù)，基于橙紅熒光蛋白和遠紅熒光蛋白，進行檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。但雙熒光互補技術(shù)(bifc)實時性較差，其要求兩個片段在切開面能互補重新整合形成完整的熒光蛋白恢復(fù)熒光蛋白活性，此過程因組裝分子熒光互補體系的不同而存在時間上的差異，幾分鐘甚至到幾小時才能順利檢測到熒光互補信號，特別在活細胞體內(nèi)這樣一個復(fù)雜的環(huán)境，實際情況不得而知，僅僅通過光學信號強度改變來評估蛋白質(zhì)相互作用在極大程度上可能存在偏差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實際的需求，本發(fā)明提供。

為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種可調(diào)節(jié)的熒光素酶分段融合蛋白，所述融合蛋白包括熒光素酶n端蛋白、柔性肽段1、mbp蛋白、活性閥門、柔性肽段2和熒光素酶c端蛋白；

其中，所述熒光素酶n端蛋白和熒光素酶c端蛋白共同組成熒光素酶；所述活性閥門為一段4-8個疏水短肽氨基酸。

本發(fā)明制備得到的可調(diào)節(jié)的熒光素酶分段融合蛋白，其基于熒光素酶的高熒光強度，設(shè)計在熒光素酶基因的位點之間引入一段4～8個短肽鏈氨基酸序列作為“活性閥門”，并在該氨基酸序列的兩側(cè)引入一段疏水性并具有一定伸展性的柔性肽鏈以減小“閥門鑰匙”作用時造成的空間位阻，同時設(shè)計引入male基因表達mbp蛋白促進熒光素酶融合體的可溶性表達。這樣可將熒光素酶基因分開形成2個片段，分別為n端和c端的2個多肽鏈，當熒光素酶基因的n片段、c片段、“活性閥門”和male的融合片段在細胞內(nèi)共同表達時，融合體蛋白中的2個熒光素酶片段在空間距離上很靠近而產(chǎn)生相互作用可實現(xiàn)熒光互補，會形成完整的具有生物活性的熒光素酶，它能催化相應(yīng)的底物而產(chǎn)生熒光信號，實現(xiàn)動態(tài)相互作用模型的on模式。當向該體系加入“活性閥門”氨基酸序列的“閥門鑰匙”即特異性剪切酶時，因其特異性剪切作用，會將熒光素酶的2個片段在空間上切開，加入相應(yīng)的底物時，會形成2個不產(chǎn)生熒光信號的n片段和c片段，實現(xiàn)動態(tài)相互作用模型的off模式。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述活性閥門位于熒光素酶中間靠近n端位置。

本發(fā)明中，活性閥門可以插入熒光素酶的任何位置，優(yōu)選為中間靠近n端的位置，如gaussia熒光素酶的arg93和cys94，renilla熒光素酶的leu110和pro111位點及gly229和lys230都是可行的。

優(yōu)選地，所述活性閥門的氨基酸序列包括iegr，enlypqg，plgmwsr，plgvr，lvprgs，ddddk，levlfqgp或levlfqgp中的任意一種。

優(yōu)選地，所述熒光素酶包括gaussia熒光素酶、renilla熒光素酶、cypridina熒光素酶或redfirefly熒光素酶中的任意一種。

優(yōu)選地，所述柔性肽段1和柔性肽段2分別獨立選自gggs，(gggs)2，(gggs)3，(gggs)4，gsgs，(gsgs)2，(gsgs)3，(gsgs)4中的任意一種。

本發(fā)明中，所述柔性肽段可減少特異性酶切造成的空間位阻。

第二方面，本發(fā)明提供一種dna片段，所述dna片段編碼如第一方面所述的融合蛋白。

第三方面，本發(fā)明提供一種表達載體，所述表達載體含有至少一個拷貝的如第二方面所述的dna片段。

第四方面，本發(fā)明提供一種重組的宿主細胞，所述宿主細胞含有第三方面所述的表達載體。

第五方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的可調(diào)節(jié)的熒光素酶分段融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)選取插入位點，采用分段克隆，逐段構(gòu)建包含熒光素酶n端蛋白、柔性肽段1、mbp蛋白、活性閥門、柔性肽段2和熒光素酶c端蛋白的重組載體；

(2)將重組載體轉(zhuǎn)化到克隆菌種，篩選含有所述融合蛋白基因序列的陽性轉(zhuǎn)化菌；

(3)從所述陽性轉(zhuǎn)化菌中提取所述重組載體，并轉(zhuǎn)化到表達菌中，得到含有所述融合蛋白的基因序列的陽性表達菌，對所述陽性表達菌擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述融合蛋白表達；

(4)融合蛋白的表達及純化。

第六方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的可調(diào)節(jié)的熒光素酶分段融合蛋白用于蛋白動態(tài)相互作用的模型的構(gòu)建和檢測。

優(yōu)選地，所述檢測可用于核酸、蛋白、細菌、病毒或重金屬離子的檢測。

本發(fā)明中的蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用模型，不僅可直接對體系中能夠影響熒光素酶片段的生物標記物進行定量檢測，也可通過在兩個片段的柔性肽鏈末端修飾生物標志物，如dna、rna、核酸類似物、蛋白、抗體、多肽等，利用生物分子誘導(dǎo)熒光素酶片段重建互補on模式，從而實現(xiàn)對多種生物標記物的靶向物質(zhì)檢測。

優(yōu)選地，所述模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1’)將制備得到的熒光素酶分段融合蛋白與底物進行混合，用酶標儀檢測體系中的生物發(fā)光強度；

(2’)向步驟(1)的體系中加入剪切酶，孵育，再加入底物，混勻后通過酶標儀檢測體系中的生物發(fā)光強度。

優(yōu)選地，所述底物的濃度為0.1-1μg/μl，例如可以是0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl、0.6μg/μl、0.7μg/μl、0.8μg/μl、0.9μg/μl或1μg/μl，優(yōu)選為0.2-0.8μg/μl，進一步優(yōu)選為0.5μg/μl。

優(yōu)選地，所述底物為腸腔素、熒光素或海螢熒光素中的任意一種或至少兩種的混合。

優(yōu)選地，所述剪切酶為factorxa因子蛋白酶，煙草蝕紋病毒(tev)蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶-9，基質(zhì)金屬蛋白酶-2，凝血酶，腸激酶，prescission蛋白酶或人鼻病毒3c蛋白酶中的任意一種。

本發(fā)明中，剪切酶作為“活性閥門”的“閥門鑰匙”，能夠特異性的剪切“活性閥門”，將熒光素酶的2個片段在空間上切開，加入相應(yīng)的底物時，會形成2個不產(chǎn)生熒光信號的n片段和c片段，實現(xiàn)動態(tài)相互作用模型的off模式。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)針對熒光共振能量的高信噪比和傳統(tǒng)雙熒光互補的技術(shù)時差性等問題，通過構(gòu)建一種融合蛋白質(zhì)片段互補模型，實現(xiàn)生物發(fā)光；

(2)熒光素酶具有高的熒光強度，良好的酶穩(wěn)定性和分泌活性，不需要外界光源的激發(fā)，無散射、穿透率高、通過生物的自身發(fā)光，大大減少可能由發(fā)射光源帶來的背景干擾并具有極高的信噪比；

(3)通過短肽鏈氨基酸序列作為“活性閥門”并以特異性剪切酶作為“閥門鑰匙”的活性調(diào)節(jié)方式，實現(xiàn)一種新型的熒光互補蛋白開關(guān)模式，可用于評估其他蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用如配體與底物的結(jié)合作用、能產(chǎn)生新結(jié)合位點的相互作用、使蛋白去活化的蛋白-蛋白相互作用、改變蛋白作用底物特異性的蛋白-蛋白相互作用等；

(4)可以用作現(xiàn)今開發(fā)的多種熒光素酶雙熒光互補體系的正對照；

(5)可以在模型中間設(shè)計引入其他模塊實現(xiàn)生物傳感功能，特別在醫(yī)藥領(lǐng)域，可針對蛋白質(zhì)靶點的藥物設(shè)計實現(xiàn)高通量藥物篩選。

附圖說明

圖1為本發(fā)明以gaussia熒光素酶為例的表達載體構(gòu)建示意圖；

圖2為本發(fā)明gaussia熒光素酶的蛋白表達sds-page電泳分析圖；

圖3為本發(fā)明gaussia熒光素酶發(fā)射光譜圖；

圖4為本發(fā)明構(gòu)建的一種熒光素酶分段融合蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用模型的示意圖；

圖5為本發(fā)明利用本發(fā)明構(gòu)建的模型，通過免疫夾心法實現(xiàn)熒光互補動態(tài)模型用于檢測生物標記物的示意圖。

具體實施方式

為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。

實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1gausssia熒光素酶融合片段的制備

(1)選擇該熒光素酶融合體基因的表達載體為pet21a，再通過篩選熒光素酶合適的插入位點，最終選擇在arg93和cys94之間插入外源片段，即形成n片段ngluc1(1～93aa)和c片段cgluc1(94～185aa)；

(2)以重組載體pet28a-gluc1為模板，設(shè)計擴增ngluc1片段時，在引物5’端引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位點，而設(shè)計擴增cgluc1片段時，在引物5’端引入hindⅲ和notⅰ酶切位點，并且都設(shè)計引入柔性肽鏈(ggggs)4以減少特異性酶切造成的空間位阻；

設(shè)計的引物序列如下：

gluc1上游引物(bamhⅰ)：

5’-cgcggatccatgaagcccaccgagaacaacgaag-3’；

ngluc1下游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcgctgccgcctccgccgcttcctccgcctccgcttccgcctccgccgcgtcctgggatgaacttcttc-3’；

cgluc1上游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggaggcggcagctgccacacctacgaaggcg-3’；

gluc1下游引物(notⅰ)：

5’-aaggaaaaaagcggccgcgtcgtcgtctccgtcgtcgtctccttagtcgtcgtctccgtcgtcg-3’。

以載體pmal-c2x為模板，設(shè)計引物5’端引入ecorⅰ和hindⅲ酶切位點擴增male基因，并設(shè)計引入“活性閥門”的短肽鏈氨基酸序列factorxacleavagesite(ile-glu-gly-arg)。

設(shè)計的引物如下：

male上游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcatgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcg-3’；

male下游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttccttccctcgatcccgaggtt-3’。

(4)在克隆融合體片段時采用分段克隆的方式，首先構(gòu)建重組載體pet21a-ngluc1，其次構(gòu)建包含有“活性閥門”factorxacleavagesite的重組載體pet21a-ngluc1-male，最后構(gòu)建含有“活性閥門”重組載體pet21a-ngluc1-male-cgluc1，構(gòu)建的載體如圖1所示；

(5)利用t4dna連接酶將具有粘性末端的基因片段與具有同樣粘性末端的載體在22℃下孵育連接，隨后通過42℃熱處理轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)復(fù)蘇并涂布到lb平板(含有100μg/ml氨芐青霉素)篩選，挑取菌落進行菌落pcr和雙酶切鑒定陽性克??；

(6)對菌落進行液體lb培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通過基因測序鑒定正確的克隆；

(7)將測序鑒定正確的質(zhì)粒熱處理轉(zhuǎn)化到bl21(de3)大腸桿菌表達菌株，并進行甘油菌保種凍存以備用。

實施例2熒光素酶融合體和gaussia熒光素酶的表達及純化

(1)菌株活化：將凍存的甘油菌pet21a-ngluc1-male-cgluc1和pet28a-gluc1分別接種到lb液體培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)中37℃，225rpm培養(yǎng)過夜活化菌株；

(2)菌株發(fā)酵：按1:100的比例將活化的菌液接種到新鮮的lb液體培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)至od600達到0.4～0.6，即為菌種的生長對數(shù)期；

(3)誘導(dǎo)表達：加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷iptg(終濃度為1mm)在28℃下誘導(dǎo)熒光素酶融合體的高速表達，4℃下11000rpm離心10min收集菌體，棄去上清lb培養(yǎng)基，加入一定量的結(jié)合緩沖液(20mmna3po4,0.5mnacl,40mmimidazole,ph7.4)懸浮菌體；

(4)超聲破碎細胞：利用超聲波破碎菌體，超聲3sec，間隔4sec，超聲時間30min后4℃離心高速分離去除不溶性蛋白，獲得上清可溶性蛋白；

(5)親和層析純化蛋白：利用ni柱中的填料硫酸鎳與表達載體上的組氨酸標簽融合蛋白能特異性結(jié)合的原理去除雜蛋白，再用咪唑洗脫液(20mmna3po4,0.5mnacl,150mmimidazole,ph7.4)的競爭性結(jié)合到ni柱填料，將組氨酸融合蛋白從柱子上洗脫下來，得到的蛋白經(jīng)透析去除咪唑得到熒光素酶融合體目的蛋白，純化后的蛋白電泳圖如圖2所示。

實施例3熒光素酶融合體蛋白動態(tài)相互作用模型的構(gòu)建

(1)實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的on模式

在96孔白色的酶標板中加入1×pbs(ph7.4)緩沖液，分別加入已用緩沖液稀釋到一定濃度的熒光素酶融合體蛋白，迅速加入終濃度為0.5μg/μl的腸腔素(coelenterazine)底物，保證該體系的總體積為200μl，充分混勻后，立即使用酶標儀檢測體系中的生物發(fā)光強度(熒光素面的發(fā)射光譜圖如圖3所示，檢測波長在480-500nm)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用模型的on模式。并以gaussia熒光素酶作為對照組評估該模型；

(2)實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的off模式

向反應(yīng)體系中加入一定濃度的剪切酶factorxaprotease，混勻并孵育一段時間后，迅速加入終濃度為0.5μg/μl的腸腔素底物，充分混勻后立即通過酶標儀檢測體系中的生物發(fā)光強度，實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用模型的off模式；

并通過2種模式的比較評估該熒光素酶融合體蛋白動態(tài)相互作用模型，模型示意圖如圖4所示。

(3)剪切酶factorxaprotease的工作曲線

將底物腸腔素與一定濃度的factorxaprotease加入該反應(yīng)體系，反應(yīng)一段時間，觀察熒光信號的變化，通過對熒光強度的測量，繪制檢測factorxaprotease濃度工作曲線，分析剪切酶factorxaprotease調(diào)節(jié)模型動態(tài)相互作用情況。

(4)檢測剪切酶factorxaprotease的濃度

將底物腸腔素與待測樣品加入體系，反應(yīng)一段時間，觀察熒光信號的變化，通過對熒光強度的測量，結(jié)合工作曲線，計算得到目標factorxaprotease的濃度。

實施例4海腎熒光素酶融合片段的制備

(1)選擇該熒光素酶融合體基因的表達載體為pet21a，再通過篩選熒光素酶合適的插入位點，最終選擇在leu110和pro111之間插入外源片段，即形成n片段nrluc8(1～110aa)和c片段crluc8(111～311aa)。

(2)以重組載體pbad-rluc8為模板，設(shè)計擴增ngluc1片段時，在引物5’端引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位點，而設(shè)計擴增cgluc1片段時，在引物5’端引入hindⅲ和notⅰ酶切位點，并且都設(shè)計引入柔性肽鏈(ggggs)4以減少特異性酶切造成的空間位阻。

設(shè)計的引物序列如下：

rluc8上游引物(bamhⅰ)：

5’-cgcggatccatgtccaaggtgtacgaccccgag-3’，

nrluc8下游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcgctgccgcctccgccgcttcctccgcctccgcttccgcctccgccaaggttcagcagctcgaaccaag-3’；

crluc8上游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggaggcggcagcccaaagaaaatcatctttgtgggccac-3’，

rluc8下游引物(notⅰ)：

5’-aaggaaaaaagcggccgcgtcgtcgtctccgtcgtcgtctccctgctcgttcttcagcacgc-3’；

以載體pmal-c2x為模板，設(shè)計引物5’端引入ecorⅰ和hindⅲ酶切位點擴增male基因，并設(shè)計引入“活性閥門”的短肽鏈氨基酸序列factorxacleavagesite(ile-glu-gly-arg)。

設(shè)計的引物如下：

male上游引物(ecorⅰ)：

5’-ccggaattcatgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcg-3’，

male下游引物(hindⅲ)：

5’-cccaagcttccttccctcgatcccgaggtt-3’；

(4)在克隆融合體片段時采用分段克隆的方式，首先構(gòu)建重組載體pet21a-nrluc8，其次構(gòu)建包含有“活性閥門”factorxacleavagesite的重組載體pet21a-nrluc8-male，最后構(gòu)建含有“活性閥門”重組載體pet21a-nrluc8-male-crluc8；

(5)利用t4dna連接酶將具有粘性末端的基因片段與具有同樣粘性末端的載體在22℃下孵育連接，隨后通過42℃熱處理轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α，經(jīng)37℃培養(yǎng)復(fù)蘇并涂布到lb平板(含有100μg/ml氨芐青霉素)篩選，挑取菌落進行菌落pcr和雙酶切鑒定陽性克隆；

(6)對菌落進行液體lb培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通過基因測序鑒定正確的克??；

(7)將測序鑒定正確的質(zhì)粒熱處理轉(zhuǎn)化到bl21(de3)大腸桿菌表達菌株，并進行甘油菌保種凍存以備用。

實施例5熒光素酶融合體和海腎熒光素酶的表達及純化

(1)菌株活化：將凍存的甘油菌pet21a-nrluc8-male-crluc8和pet28a-rluc8分別接種到lb液體培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)中37℃，225rpm培養(yǎng)過夜活化菌株；

(2)菌株發(fā)酵：按1:100的比例將活化的菌液接種到新鮮的lb液體培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)至od600達到0.4～0.6，即為菌種的生長對數(shù)期。

(3)誘導(dǎo)表達：加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷iptg(終濃度為1mm)在30℃下誘導(dǎo)熒光素酶融合體的高速表達。4℃下11000rpm離心10min收集菌體，棄去上清lb培養(yǎng)基，加入一定量的結(jié)合緩沖液(20mmna3po4,0.5mnacl,40mmimidazole,ph7.4)懸浮菌體；

(4)超聲破碎細胞：利用超聲波破碎菌體，超聲3sec，間隔4sec，超聲時間30min后4℃離心高速分離去除不溶性蛋白，獲得上清可溶性蛋白；

(5)親和層析純化蛋白：利用ni柱中的填料硫酸鎳與表達載體上的組氨酸標簽融合蛋白能特異性結(jié)合的原理去除雜蛋白，再用咪唑洗脫液(20mmna3po4,0.5mnacl,100mmimidazole,ph7.4)的競爭性結(jié)合到ni柱填料，將組氨酸融合蛋白從柱子上洗脫下來，得到的蛋白經(jīng)透析去除咪唑得到熒光素酶融合體目的蛋白。

實施例6熒光素酶融合體蛋白動態(tài)相互作用模型的構(gòu)建

(1)實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的on模式

在96孔白色的酶標板中加入1×pbs(ph7.4)緩沖液，分別加入已用緩沖液稀釋到一定濃度的熒光素酶融合體蛋白，迅速加入終濃度為0.5μg/μl的腸腔素(coelenterazine)底物，保證該體系的總體積為200μl，充分混勻后，立即使用酶標儀檢測體系中的生物發(fā)光強度，實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用模型的on模式。并以gaussia熒光素酶作為對照組評估該模型。

(2)實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用的off模式

向反應(yīng)體系中加入一定濃度的剪切酶factorxaprotease，混勻并孵育一段時間后，迅速加入終濃度為0.5μg/μl的腸腔素底物，充分混勻后立即通過酶標儀檢測體系中的生物發(fā)光強度，實現(xiàn)蛋白質(zhì)動態(tài)相互作用模型的off模式。并通過2種模式的比較評估該熒光素酶融合體蛋白動態(tài)相互作用模型。

(3)單克隆抗體夾心誘導(dǎo)熒光素酶片段互補體系的構(gòu)建

分別在nrluc8和crluc8的柔性肽鏈末端修飾上單抗a和單抗b，使得兩種單抗在對應(yīng)抗原(生物標記物)存在的情況下，形成免疫夾心，誘導(dǎo)nrluc8和crluc8靠近重建熒光素酶互補體系on模式，加入腸腔素底物，充分混勻后立即通過酶標儀檢測體系中的熒光強度變化。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。