本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

角膜緣干細(xì)胞為角膜和結(jié)膜、鞏膜交界部分，與角膜的鑒別的標(biāo)志是bowman氏膜的終止處；與結(jié)膜的鑒別標(biāo)志是不含杯狀細(xì)胞，角膜緣干細(xì)胞寬約1～2mm，此處僅有上皮層和基質(zhì)層，其上皮細(xì)胞層含10層細(xì)胞，排列不規(guī)則，細(xì)胞呈小的圓柱狀，核深染。其深部基質(zhì)細(xì)胞為一層小圓柱狀或立方形細(xì)胞，細(xì)胞核為卵圓形，與表面平行，在基底部乳頭形成，形成特殊的“柵欄”樣上皮結(jié)構(gòu)，其中含有色素和豐富的血管網(wǎng)，并與基底膜聯(lián)系緊密。角膜上皮為有序排列的單層非角質(zhì)化細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞的更新來源于角膜緣干細(xì)胞（lscs），對角膜透明、視力的維持起重要作用。更新過程進(jìn)行時，角膜緣干細(xì)胞向角膜中央遷移，并進(jìn)行分化，這一完整的過程大概需要14天。lscs缺乏是世界性、災(zāi)難性的眼科疑難病癥，嚴(yán)重威脅人類視覺質(zhì)量，目前缺乏有效治療手段。常見原因包括眼外傷、堿燒傷和免疫性眼病等，在臨床上，表現(xiàn)為角膜不透明化及視覺缺失；眼科檢查以角膜上結(jié)膜化、出現(xiàn)新生血管、瘢痕及瞼球粘連形成為診斷標(biāo)準(zhǔn)。

對于角膜緣干細(xì)胞缺乏傳統(tǒng)的治療手段包括羊膜移植和lscs移植，但羊膜移植可導(dǎo)致角膜上皮表型改變，而傳統(tǒng)的lscs移植需要組織多、醫(yī)源性損傷較大，臨床治療效果均不理想。自體角膜緣組織移植不適合雙眼角膜緣病變的患者。異體角膜緣組織移植存在排斥反應(yīng)。因此，采用體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植聯(lián)合穿透性角膜移植治療嚴(yán)重的角膜病變，近年來成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

對于角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)，目前方法主要采用多種不同的基底層如鼠源nih373滋養(yǎng)層、人源羊膜、纖維蛋白膠、myogel、等離子聚合物涂層、人重組膠原基底物等對角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。這些方法都能獲得上皮植片，并成功用于干細(xì)胞缺乏的補(bǔ)充用以治療眼表疾病。

現(xiàn)有角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法雖能獲得上皮細(xì)胞，但由于nih373細(xì)胞為外生非人源細(xì)胞，容易引起免疫反應(yīng)及鼠源衍生病原體的傳播；而人源羊膜由于難以獲得，耗費(fèi)大，需要進(jìn)一步檢測是否含有hiv，肝炎病毒等，且存在不透明，具有一定厚度的缺點(diǎn)，容易與角膜基質(zhì)整合，對角膜厚度和結(jié)構(gòu)有一定影響。上述因素都會影響培養(yǎng)得到的角膜緣干細(xì)胞在移植后眼部對光及視覺靈敏度，且現(xiàn)有方法只能用于角膜緣干細(xì)胞的一次性使用，無法對角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定分離及培養(yǎng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種新型的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有以下組分：5ml100×雙抗、10～20ng/ml人重組egf、5～10ug/ml胰島素、1～5x10^-9m3-碘甲狀腺原氨酸、0.2～1ug/ml氫化可的松、10～20ng/ml霍亂毒素、10～15%胎牛血清、余量為dmem和/或dmem/f12。

本發(fā)明建立了新型培養(yǎng)系統(tǒng)，以表皮生長因子egf、胰島素、3,3′,5-triiodo-l-thyronine（3-碘甲狀腺原氨酸）、氫化可的松、霍亂毒素等可促進(jìn)lscs增殖等因子作為培養(yǎng)基組分，能顯著提高角膜緣干細(xì)胞的純度和數(shù)量。

本發(fā)明還提供一種角膜緣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，是將角膜緣組織清洗后，對角膜緣組織進(jìn)行酶解得角膜緣干細(xì)胞，加入上述角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)即可；所述酶解是一次酶解或者是二次酶解；所述二次酶解是先用iv膠原酶酶解，再用堿性蛋白酶酶解。

本發(fā)明所述角膜緣組織的一次酶解可以采用傳統(tǒng)的酶解方式，如利用復(fù)合酶酶解，或者單純用胰蛋白酶酶解，所述胰蛋白酶的酶解時間為10min～20min。

具體地，本發(fā)明所述角膜緣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法是：取48h內(nèi)人類死亡胎兒的角膜緣組織，利用含雙抗的pbs清洗后，進(jìn)行酶解，將酶解后的產(chǎn)物以角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，傳代。

本發(fā)明可以使用iv膠原酶及胰蛋白酶二次酶解分離，使角膜緣組織在二次酶解下充分酶解，從而保證獲得單個細(xì)胞、減少對細(xì)胞的損傷，增大細(xì)胞得率。

優(yōu)選地，當(dāng)采用二次酶解時，所述iv膠原酶的濃度為0.2～0.3%；該iv膠原酶溶解于dmem/f12中；所述iv膠原酶的酶解時間為2～3h；所述胰蛋白酶的酶解時間為10～20min。

優(yōu)選地，上述角膜緣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，是在加入角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)之前，先加入i型膠原蛋白。

具體地，所述角膜緣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法包括以下步驟：

s1.取48h內(nèi)人類死亡胎兒的角膜緣組織，利用含雙抗的pbs清洗后，先用0.2%iv膠原酶解2h，除去膠原酶液，加入0.25%胰蛋白酶液酶解消化10min～20min，加入含有fbs的dmem終止酶解消化，離心去除上清得分離后的角膜緣干細(xì)胞；

s2.將10%i型膠原蛋白置于冰浴中，培養(yǎng)皿加入i型膠原蛋白進(jìn)行包被后，再加入分離后的角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首先提供了角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有以下組分：

5ml100×雙抗、10～20ng/ml人重組egf、5～10ug/ml胰島素、1～5x10^-9m3-碘甲狀腺原氨酸、0.2～1ug/ml氫化可的松、10～20ng/ml霍亂毒素、10～15%胎牛血清、余量為dmem和/或dmem/f12；將各組分進(jìn)行優(yōu)化，能夠更好的維持角膜緣干細(xì)胞的低分化狀態(tài)，本發(fā)明采用i型膠原蛋白作為角膜緣干細(xì)胞生長的基底物質(zhì)對培養(yǎng)板等材料做涂層處理，提高了角膜緣干細(xì)胞的純度及穩(wěn)定性，以胎牛血清促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的生長，能夠選擇性的分離角膜緣干細(xì)胞，且分離培養(yǎng)所得的角膜緣干細(xì)胞的純度和數(shù)量皆較高，干性及增殖能力良好。試驗表明，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基分離角膜緣干細(xì)胞，細(xì)胞中p63、pax6抗體陽性率為96%～100%。

本發(fā)明建立了一種新型無滋養(yǎng)層、無載體的角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)方法，實現(xiàn)了均一、高效體外擴(kuò)增功能性的角膜緣干細(xì)胞，提供了快速穩(wěn)定的細(xì)胞來源。提高所得角膜緣干細(xì)胞的純度，改善所得角膜緣干細(xì)胞的品質(zhì)以建立細(xì)胞庫作為備用，為角膜緣干細(xì)胞特異性機(jī)制研究和移植治療提供了快速穩(wěn)定的細(xì)胞來源。

附圖說明

圖1為無載體，無滋養(yǎng)層人角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)（顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)）。

圖2為角膜緣干細(xì)胞特異性標(biāo)志免疫細(xì)胞化學(xué)染色；圖2a為p63（綠色，角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志）；圖2b為pax6（紅色）；圖2c為融合后（藍(lán)色為dap）。

圖3為利用實施例1所述培養(yǎng)基培養(yǎng)12天后的細(xì)胞形態(tài)圖（顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)，10×）。

圖4為利用對比例1所述培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)圖（顯微鏡下形態(tài)，10×）。

圖5為利用對比例2所述培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)圖（顯微鏡下形態(tài)，10×）。

圖6為利用對比例3所述培養(yǎng)基培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)圖（顯微鏡下形態(tài)，10×）。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

10%i型膠原蛋白溶液：1mli型膠原蛋白溶解于9mldmem/f12培養(yǎng)基中。

iv膠原酶：以dmem/f12培養(yǎng)基配制成0.2wt%iv膠原酶溶液。

人重組egf儲備液：以pbs配制，配成5μg/mlegf儲備液。

胰島素儲備液：以0.005mhcl配制，濃度為2.5g/l。

3,3′,5-triiodo-l-thyronine儲備液：13.6mg3,3′,5-triiodo-l-thyronine溶解于15ml0.02mnaoh中，加入85mlpbs；取0.1ml配制好的液體，添加pbs至20ml，以作為儲備液，濃度為：10^-6m。

氫化可的松儲備液：5mg氫化可的松溶于1ml無水乙醇中，加入pbs至25ml，濃度為200μg/ml。

霍亂毒素儲備液：1mg霍亂毒素溶于1ml無菌細(xì)胞培養(yǎng)級純水中，取其中0.1ml，加入pbs至20ml，濃度為：5ug/ml。

實施例1

角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基：220mldmem，220mldmem/f12，50mlfbs，5ml100×雙抗（100iu青霉素、100ug/ml鏈霉素），1ml人重組egf儲備液，1ml胰島素儲備液，1ml3,3′,5-triiodo-l-thyronine儲備液，1ml氫化可的松儲備液，1ml霍亂毒素儲備液，放置于4℃保存，使用前37℃復(fù)溫。

在手術(shù)顯微鏡下，用組織鑷和角膜剪剪取人角膜緣組織于無菌環(huán)境中用含雙抗（青霉素-鏈霉素，1×）的pbs沖洗2次，每次5min；再用剪刀把組織剪碎。

根據(jù)組織塊的體積，每1cm³組織塊加入5ml0.2wt%iv膠原酶液，37℃輕柔振蕩消化2h后，除去iv膠原酶液，加入5ml0.25%胰蛋白酶液，均勻混懸細(xì)胞后，用100μm網(wǎng)篩過濾，再置于37℃進(jìn)一步消化15min，加入含10％fbs的dmem終止消化，1000rpm離心5min，棄除上清。

將10%i型膠原蛋白置于冰浴中，6孔板中每孔加入1ml10%i型膠原蛋白進(jìn)行包被，置于37℃，含5％co2培養(yǎng)箱中孵育40min，用pbs沖洗，除去pbs。

加入2ml復(fù)溫的角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸消化后的細(xì)胞，分別種植于包被有10%i型膠原蛋白的孔中，置于37℃，含5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，并在顯微鏡中觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。

實施例2

實驗方法同實施例1，唯一不同的是，本實施例所用的角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基組成為：204.5mldmem，204.5mldmem/f12，75mlfbs，5ml100×雙抗（100iu青霉素、100ug/ml鏈霉素），2ml人重組egf儲備液，2ml胰島素儲備液，2.5ml3,3′,5-triiodo-l-thyronine儲備液，2.5ml氫化可的松儲備液，2ml霍亂毒素儲備液。

對比例1

實驗方法同實施例1，唯一不同的是egf在角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為2ug/ml，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長緩慢，喪失表皮細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞呈梭形。

對比例2

實驗方法同實施例1，唯一不同的是，血清濃度從10%降低到2%（即fbs的加入量為10ml），結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的細(xì)胞變大，細(xì)胞核變小，細(xì)胞貼壁能力差等。

對比例3

實驗方法同實施例1，唯一不同的是胰島素在角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為2ug/ml，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長緩慢，表皮細(xì)胞的形態(tài)不明顯，細(xì)胞與細(xì)胞間連接松散，死亡細(xì)胞較多。