本發(fā)明屬于干細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種用于人間充質干細胞的無血清培養(yǎng)基，本發(fā)明還涉及利用該培養(yǎng)基分離、純化培養(yǎng)人間質干細胞的方法。

背景技術：

細胞治療己成為生物治療領域中最活躍的一個部分，規(guī)范化的細胞治療研究已成為現代醫(yī)學的重要組成。當前我國細胞治療中常用的細胞類型是成體來源的細胞，如免疫細胞、骨髓干細胞、臍血和臍帶來源的造血或間充質干細胞等。

間充質干細胞(mesenchymalstemcell，msc)來源廣泛，也較易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，免疫原性低，無道德倫理問題的限制，所以在免疫治療和基因治療方面有著巨大的應用前景。如自體或異基因骨髓或臍血造血干細胞移植用于治療血液病、惡性腫瘤等；或骨髓和臍帶來源的間充質干細胞經移植后轉化為肝樣細胞、成骨細胞、心肌細胞、汗腺細胞等。

目前，用于間充質干細胞的分離、純化培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要是在基礎培養(yǎng)基的基本上添加一定濃度的動物血清如胎牛血清（fbs），動物血清含有異種蛋白質，使用動物血清培養(yǎng)和擴增的自體間充質干細胞在用于臨床治療時，可致受者體內產生抗體，從而引起免疫反應。因此，不含血清的培養(yǎng)基成為人們研究的熱點。如中國專利“一種間充質干細胞無血清培養(yǎng)基”（申請?zhí)枮?01110420539.9，公告號為cn102433302a）公開了一種主要由堿性成纖維細胞生長因子、人表皮細胞生長因子、重組人胰島素、人血白蛋白、亞硒酸鈉、左旋卡尼丁和白藜蘆醇等組分組成的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含血清，含有多種生長因子，并且通過加入左旋卡尼丁和白藜蘆醇可有效改善間充質干細胞生長狀態(tài)。但是，該無血清培養(yǎng)基只能將臍帶間充質干細胞數目擴增大約1000倍，其專利說明書中也只提及了使用該培養(yǎng)基用于臍帶間充質干細胞最多經過10次傳代培養(yǎng)時，能夠保證臍帶間充質干細胞的生物學特性不變。

與上例相同，目前可見的間充質干細胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)技術普遍存在著培養(yǎng)成本高、擴增數量有限[擴增數量一般可在(1-2)×10⁸]、擴增時間長、干細胞易分化等不足，直接影響臨床應用的安全性。保持人間充質干細胞的干性（即原始未分化性），并大量擴增，從而應用于臨床研究是細胞治療研究的重要內容之一。但是為能夠實現該方法的臨床有效應用，對該人間充質干細胞的有效的規(guī)?；囵B(yǎng)并保持其干性則成為了主要難題。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對現有技術的不足，提供一種用于分離、純化培養(yǎng)人間充質干細胞的無血清培養(yǎng)基，該無血清培養(yǎng)基能提高人間充質干細胞的分離純化效率，以該無血清培養(yǎng)基為基礎加入亞油酸（la）、人源ab型血清、血小板衍生生長因子（pdgf）、表皮細胞生長因子（egf）用于人間充質干細胞擴增培養(yǎng)時，可提高擴增速度、減少擴增時間，并能始終保持干細胞的干性。

本發(fā)明所采用的技術方案如下：

一種用于人間充質干細胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基組分包括基礎培養(yǎng)基、mcdb、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）、人血清白蛋白（hsa）、青鏈霉素（pen/strep）以及地塞米松（dex）；所述基礎培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基。上述無血清培養(yǎng)基以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb20~100ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）50~400μl、人血清白蛋白（hsa）50~100μl、青鏈霉素（pen/strep）0.5~2ml、地塞米松（dex）5~20μl、余下為基礎培養(yǎng)基。

進一步地，上述無血清培養(yǎng)基以1升計算，各組分的用量優(yōu)選為：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、余下為基礎培養(yǎng)基。

本發(fā)明用于人間充質干細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1）人間充質干細胞原代分離培養(yǎng)

自人臍帶分離出人間充質干細胞后，或自骨髓血或臍帶血分離出單個核細胞后，于上述組分的無血清培養(yǎng)基中進行分離純化培養(yǎng)；

2）擴增多次傳代培養(yǎng)

將步驟1）原代分離培養(yǎng)得到的間充質干細胞，于如下組分的擴增培養(yǎng)基進行擴增傳代培養(yǎng)：

mcdb20~100ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）50~400μl、人血清白蛋白（hsa）50~100μl、青鏈霉素（pen/strep）0.5~2ml、地塞米松（dex）5~20μl、亞油酸（la）1~10ml、人源ab型血清1~10ml、血小板衍生生長因子（pdgf）

10~100μl、表皮細胞生長因子（egf）50~100μl、加基礎培養(yǎng)基至1升。

在上述技術方案的基礎上，上述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養(yǎng)為自人臍帶分離人間充質干細胞，釆用貼壁法，包括如下步驟：

1）將剪碎的間距在0.2~0.5cm的臍帶小塊均勻平鋪在培養(yǎng)皿中；翻轉培養(yǎng)瓶置37℃4~6h；

2）4~6h后正置培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)12h過夜；

3)7~10天時觀察細胞爬出情況，換液1~2次將組織塊棄去，補足培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至可傳代。

上述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養(yǎng)為自人臍帶分離人間充質干細胞，釆用酶消化法，包括如下步驟：

1）將剪碎的臍帶裝入血清瓶中，加ⅱ型膠原酶2ml、pbs2ml，混勻后封口，置37℃過夜，過夜期間每隔2~6混勻；

2）次日，取消化好的組織塊，取上清移置于新管；

3）加1ml0.25%胰酶，置37℃消化5min；

4）加1ml培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基終止消化，補pbs至10ml；

5）3000~4000rpm離心10min；

6）棄去上清，加1ml培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基重懸沉淀，接種到培養(yǎng)皿/瓶，補足培養(yǎng)基培養(yǎng)；

7）每兩天觀察，每3天半量更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至可傳代。

另外，上述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養(yǎng)也可為臍帶華通氏膠來源的間充質干細胞的分離培養(yǎng)，可釆用上述的貼壁法或酶消化法。

上述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養(yǎng)為自骨髓血或臍帶血分離單個核細胞，釆用梯度離心法，包括如下步驟：

1）采集人骨髓血或健康臍帶血50ml，利用淋巴細胞分離液分離，收集單個核細胞；

2）置于培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基，調整細胞濃度為3×10⁶/ml，37℃、5％co2孵育24小時后收集貼壁細胞即得到分離純化的間充質干細胞。

與現有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果如下：

本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基可提高間充質干細胞的分離和純化效果，以該無血清培養(yǎng)基為基礎加入亞油酸（la）、人源ab型血清、血小板衍生生長因子（pdgf）、表皮細胞生長因子（egf）用于人間充質干細胞擴增培養(yǎng)時，可保持間充質干細胞的原始性，避免了分化，從而保證了人間充質干細胞的安全性，提高了細胞的擴增速度，減少了擴增時間，降低了成本。流式結果顯示，即使傳代30代，人間充質干細胞的形態(tài)仍均一。

本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基可用于自體骨髓血、臍帶血或臍帶華通氏膠來源的間充質干細胞的分離純化處理，通過加入la、人源ab型血清、pdgf和egf用于擴增培養(yǎng)時，可保證擴增的原始性，從而提高了該三種來源的人間充質干細胞對相關疾病的治療作用。

附圖說明

圖1為分離第7天的原代臍帶華通氏膠來源間充質干細胞的形態(tài)結構圖；

圖2為培養(yǎng)第7天的自體骨髓血來源的原代間充質干細胞的形態(tài)結構圖；

圖3為培養(yǎng)第7天的臍帶血來源的原代間充質干細胞的形態(tài)結構圖；

圖4為培養(yǎng)第60代的人間充質干細胞的形態(tài)結構圖；

圖5為第2代的cd29、cd45的流式細胞鑒定圖；

圖6為第2代的的cd34、c44的流式細胞鑒定圖；

圖7為第30代的人間充質干細胞cd29、cd45的流式細胞鑒定圖；

圖8為第30代的的cd34、c44的流式細胞鑒定圖。

具體實施方式

為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅用于幫助理解本發(fā)明，不應視為對本發(fā)明的具體限制。

如無具體說明，本發(fā)明的各種原料均可以通過市售得到；或根據本領域的常規(guī)方法制備得到。除非另有定義或說明，本文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域技術熟練入員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。除非另外說明，本文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域技術熟練人員所熟悉的意義相同。

本文中所用的術語“人間充質干細胞”是不同來源的人間充質干細胞，包括：人自體骨髓血來源，人臍帶血來源，人臍帶華通氏膠來源的細胞，在細胞形態(tài)、生長特性、表面標志物表達、移植到體內導致的免疫反應等方面均非常相似。

實施例1

人骨髓源間充質干細胞的分離、純化培養(yǎng)

1、材料與試劑

淋巴細胞分離液(ficoll)(天津灝洋生物科技有限公司)；培養(yǎng)基dmem(hyclone公司)、人ab血清(中心血站)；細胞計數試劑盒(cck-8)(日本dojindo公司)；凋亡試劑盒(日本dojindo公司)；表皮生長因子（egf）、血小板衍生生長因子（pdgf）、地塞米松（dex）、青鏈霉素（pen/strep）、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）、人血清白蛋白（hsa）均為peprotech公司產品；熒光標志的鼠抗人pe-cd29、fitc-cd34、pe-cd44、fitc-cd45抗體(美國ebioscience公司)；fc500流式細胞儀和相應軟件(美國beckmancoulter公司)。

2、培養(yǎng)基組分

1）無血清培養(yǎng)基

以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl，加dmem培養(yǎng)基至1升。

2）擴增培養(yǎng)基

以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、亞油酸（la）6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生長因子（pdgf）50μl、表皮細胞生長因子（egf）60μl，加dmem培養(yǎng)基至1升。

3、培養(yǎng)方法

包括如下步驟：

1）采集人骨髓血50ml，利用淋巴細胞分離液分離，收集單個核細胞；置于培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基，調整細胞濃度為3×10⁶/ml，37℃、5％co2孵育24小時后收集貼壁細胞即得到分離純化的間充質干細胞；

2）將經上述步驟1）所得的培養(yǎng)細胞，換用擴增培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)擴增培養(yǎng)傳代。

實施例2

人臍帶人間充質干細胞的分離培養(yǎng)

1、材料與試劑

同于實施例1

2、培養(yǎng)基組分

1）無血清培養(yǎng)基

以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl，加dmem培養(yǎng)基至1升。

2）擴增培養(yǎng)基

以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、亞油酸（la）6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生長因子（pdgf）50μl、表皮細胞生長因子（egf）60μl，加dmem培養(yǎng)基至1升。

3、培養(yǎng)方法（貼壁法）

包括如下步驟：

1）將剪碎的臍帶均勻平鋪（小塊間距在0.2-0.5cm）在培養(yǎng)皿中，加培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基，翻轉培養(yǎng)瓶置37℃4-6h；

4-6h后正置培養(yǎng)瓶，動作輕柔，培養(yǎng)12h過夜；

7-10天時觀察細胞爬出較多時，換液時將組織塊棄去，可通過1-2次換液逐步棄去；

2）將經上述步驟1）原代分離培養(yǎng)得到的間充質干細胞，于擴增培養(yǎng)基進行擴增傳代培養(yǎng)。

在本實施例的培養(yǎng)過程中，于不同時間點，利用倒置相差顯微鏡觀察人間充質干細胞的生長形態(tài)、通過免疫熒光及流式細胞儀檢測人間充質干細胞標記基因的表達情況。各種檢測結果如下：

人間充質干細胞分離培養(yǎng)的形態(tài)結構如圖1所示，由圖1可以看出，培養(yǎng)貼壁后的人間充質干細胞發(fā)生明顯形變，呈克隆樣生長，初步呈現樣人間充質干細胞形態(tài)；逐漸的，人間充質干細胞形態(tài)較為均一，呈現典型樣人間充質干細胞形態(tài)。

換用擴增培養(yǎng)基擴增至第2代的流式結果如圖5、6所示，再大量擴增至第30代，人間充質干細胞形態(tài)仍均一，流式結果如圖7、8所示，由此表明，本分離、純化和擴增技術可以大量擴增人間充質干細胞并能保持人間充質干細胞的未分化性。

實施例3

人臍帶人間充質干細胞的分離培養(yǎng)

1、材料與試劑

同于實施例1

2、培養(yǎng)基組分

1）無血清培養(yǎng)基

以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl，加dmem培養(yǎng)基至1升。

2）擴增培養(yǎng)基

以1升計算，各組分的用量如下：

mcdb50ml、胰島素鐵硒傳遞蛋白（its）200μl、人血清白蛋白（hsa）60μl、青鏈霉素（pen/strep）1ml、地塞米松（dex）10μl、亞油酸（la）6ml、人源ab型血清5ml、血小板衍生生長因子（pdgf）50μl、表皮細胞生長因子（egf）60μl，加dmem培養(yǎng)基至1升。

3、培養(yǎng)方法（酶消化法）

包括如下步驟：

1）將剪碎的臍帶裝入血清瓶中，加ⅱ型膠原酶2ml，加pbs2ml，混勻后封口，置37℃過夜，期間每隔一段時間混勻；

次日，取消化好的組織塊，取上清移置新管（15ml離心管）；

加1ml（0.25%胰酶，置37℃消化5min；

加1ml培養(yǎng)基終止消化，補pbs至10ml；

3000~4000rpm離心10min；

棄去上清，加1ml培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基重懸沉淀，接種到培養(yǎng)皿，補足培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；

每兩天觀察，每3天半量更換擴增培養(yǎng)基；

2）將經上述步驟1）原代分離培養(yǎng)得到的間充質干細胞，于擴增培養(yǎng)基進行擴增傳代培養(yǎng)。

盡管上文對本發(fā)明的具體實施方式給予了詳細描述和說明，但是應該指明的是，我們可以依據本發(fā)明的構想對上述實施方式進行各種等效改變和修改，其所產生的功能作用仍未超出說明書所涵蓋的精神時，均應在本發(fā)明的保護范圍之內。