本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株。

背景技術(shù)：

礦物質(zhì)營養(yǎng)缺乏，尤其是鈣、鐵、鋅缺乏，是當(dāng)今世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，是一種典型的隱性饑餓，易發(fā)于孕婦和兒童人群中，在全球的流行率遠(yuǎn)高于維生素營養(yǎng)缺乏。礦物質(zhì)營養(yǎng)不良對(duì)人體健康的負(fù)面影響從生命的早期便開始建立，會(huì)導(dǎo)致人體生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、認(rèn)知能力差、嗜睡、注意力難集中和更易發(fā)生重大感染性疾病，從而降低個(gè)體接受教育的能力、體力勞動(dòng)能力和壽命預(yù)期。礦物營養(yǎng)干預(yù)對(duì)于人們擺脫礦物質(zhì)營養(yǎng)缺乏的“貧窮陷阱”，提高人們的健康水平具有特別重要的意義。

生物礦化納米結(jié)構(gòu)在礦物質(zhì)營養(yǎng)干預(yù)實(shí)踐中具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，多聚磷酸體是存在于許多生物細(xì)胞中的一種主要由長(zhǎng)鏈多聚磷酸鹽構(gòu)成的生物礦化結(jié)構(gòu)。許多生物細(xì)胞（如原核和真核微生物、原生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物的血小板細(xì)胞和成骨細(xì)胞等）中會(huì)合成長(zhǎng)鏈（幾十到幾百個(gè)殘基不等）多聚磷酸鹽（polyp），并以此為主要成分，構(gòu)成一種納米或亞微米尺度的包涵體——多聚磷酸體（polyphosphatebodies,ppb），亦稱異染粒（volutingranules）或鈣酸體（acidocalcisomes）。近年來，許多研究證明多聚磷酸體與多種生物功能有關(guān)。不同于食品工業(yè)中常用的短鏈polyp，生物來源的長(zhǎng)鏈polyp很難被哺乳動(dòng)物腸道中的堿性磷酸酶水解，故能夠經(jīng)口到達(dá)腸道，以小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用方式被腸道上皮細(xì)胞吸收，并起到保護(hù)腸道組織免受氧化損傷、炎癥、纖維化和癌變等病變的益生作用。多聚磷酸體可以為細(xì)胞提供合成dna的原料以及儲(chǔ)存或提供細(xì)胞所需的礦物元素，具有開發(fā)成為一種天然納米礦物質(zhì)營養(yǎng)補(bǔ)充劑或強(qiáng)化劑的潛力。盡管多聚磷酸體的功能特性被逐漸認(rèn)可，但是目前還沒有利用微生物進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的案例，選擇一種合適的生產(chǎn)多聚磷酸體的“細(xì)胞工廠”對(duì)于其開發(fā)應(yīng)用意義重大。

聚球藻7002是近海的一種模式微藻，也是目前發(fā)現(xiàn)的分裂速度最快的藍(lán)細(xì)菌，具有天然的外源dna轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其全基因組也已被破譯，是目前公認(rèn)的一種理想的“工程微藻”構(gòu)建平臺(tái)。多株轉(zhuǎn)基因聚球藻7002藻株被先后構(gòu)建，具有大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)多種活性物質(zhì)的潛力。

盡管微藻進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法較為成熟，但是仍然面臨成功率低，誘導(dǎo)表達(dá)困難，表達(dá)效率不高，表達(dá)產(chǎn)物品質(zhì)不高等諸多問題和挑戰(zhàn)，同時(shí)，一些外源基因的表達(dá)會(huì)對(duì)微藻的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)帶來一些不利影響。因此在微藻轉(zhuǎn)基因的過程中，選擇合適的藻株、質(zhì)粒和目的基因至關(guān)重要。一株遺傳穩(wěn)定性好、表達(dá)效率高的藻株對(duì)于提高微藻的綜合利用價(jià)值具有非常重要的意義。

納米尺度的活性物質(zhì)在功能上具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。聚球藻可以積累多聚磷酸體，且粒徑為納米尺度，更容易被細(xì)胞吸收利用。多聚磷酸體的積累受ppk基因的調(diào)控，可以通過導(dǎo)入重組ppk基因外源質(zhì)粒的方法，誘導(dǎo)聚球藻過表達(dá)ppk基因以達(dá)到納米多聚磷酸體過度積累的目的。在轉(zhuǎn)基因過程中選擇合適的同源基因以及含有相應(yīng)藻株容易啟動(dòng)的啟動(dòng)子的質(zhì)粒會(huì)大幅提高外源基因表達(dá)的成功率。相比較于其他微生物，利用聚球藻進(jìn)行相關(guān)外源基因的表達(dá)具有許多難以比擬的優(yōu)勢(shì)：（1）聚球藻7002為天然感受態(tài)細(xì)胞，自然狀態(tài)下可以吸收外源質(zhì)粒，方便進(jìn)行外源基因?qū)耄唬?）微藻作為光自養(yǎng)生物，分裂速度快，生產(chǎn)效率高，可以利用海水在光照下進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，不會(huì)帶來侵占耕地、能源浪費(fèi)等問題，且海水中豐富的礦物元素可以豐富多聚磷酸體的元素組成，提高其功能特性；（3）微藻本身的營養(yǎng)價(jià)值非常高，在轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)相關(guān)活性物質(zhì)的同時(shí)，所獲得的藻體及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物等都可以用于功能保健食品和藥物開發(fā)等進(jìn)行高值化利用；（4）外源基因表達(dá)穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性好。

通過轉(zhuǎn)基因方法獲得高產(chǎn)納米多聚磷酸體藻株對(duì)于提高微藻的研究利用價(jià)值以及納米多聚磷酸體的廣泛應(yīng)用具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株及制備方法。本發(fā)明在聚球藻7002藻株的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入含有ppk同源基因的重組psyn_1質(zhì)粒，通過誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)以達(dá)到積累納米多聚磷酸體的目的。該藻株能夠快速積累大量的納米多聚磷酸體，遺傳穩(wěn)定性好，可操作性強(qiáng)。

本發(fā)明另一方面涉及上述轉(zhuǎn)基因藻株的應(yīng)用，用于發(fā)酵生產(chǎn)納米多聚磷酸體；納米多聚磷酸體可以應(yīng)用于提高腸道免疫功能性產(chǎn)品的開發(fā)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案為：

一種高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株，該藻株是在聚球藻7002藻株的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入含有ppk同源基因的重組psyn_1質(zhì)粒而得到的轉(zhuǎn)基因聚球藻7002藻株。

上述高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株的制備方法，包括如下步驟：

1）目的基因的提取、克隆和修飾：提取聚球藻7002的基因組，根據(jù)聚球藻7002ppk基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，引物兩端添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，通過pcr得到目的基因，純化備用；

2）目的基因重組到克隆質(zhì)粒，利用大腸桿菌對(duì)克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行繁殖，分別對(duì)兩種質(zhì)粒進(jìn)行抽提純化；

3）對(duì)抽提得到的上述兩種質(zhì)粒分別用兩種相同的限制酶進(jìn)行酶切，酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，純化后的表達(dá)質(zhì)粒和ppk基因按照摩爾濃度1:5-1:10的比例，利用dna連接酶連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，通過大腸桿菌進(jìn)行克隆繁殖，提取純化備用；

4）將步驟3）提純后的重組表達(dá)質(zhì)粒加入到聚球藻7002中進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，再利用含鹽酸壯觀霉素的固體平板對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選；

5）對(duì)篩選得到的藻株進(jìn)行質(zhì)粒提取，利用ppk基因特異性引物擴(kuò)增，對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列鑒定，得到重組ppk基因的聚球藻7002藻株。

上述步驟2）中的表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為psyn_1表達(dá)質(zhì)粒。

上述步驟3）中利用dna連接酶于16℃連接1-3h。

上述步驟4）具體為，將步驟3）重組后的質(zhì)粒加入到濃縮10-15倍的新鮮培養(yǎng)液洗滌過的生產(chǎn)狀態(tài)良好的、od750=1-2的聚球藻7002，進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化24h即可，再利用含抗生素的固體平板對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選。

上述高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株在高產(chǎn)納米多聚磷酸體上的應(yīng)用；其中，在該轉(zhuǎn)基因藻株的培養(yǎng)基中添加0.5-5μm的鎳離子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；且對(duì)聚球藻7002轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中添加有10μg/l的鹽酸壯觀霉素。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

1、本發(fā)明巧妙地利用微藻進(jìn)行納米多聚磷酸體的生產(chǎn)，生產(chǎn)方式綠色環(huán)保，副產(chǎn)物（藻渣、次級(jí)代謝產(chǎn)物等）研究利用價(jià)值高。2、利用模式微藻聚球藻7002進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，操作簡(jiǎn)單，成功率高，遺傳穩(wěn)定性好。3、導(dǎo)入的基因?yàn)榫矍蛟?002同源ppk基因，外源質(zhì)粒psyn_1含有藍(lán)藻來源的啟動(dòng)子，更容易進(jìn)行翻譯和表達(dá)，同源基因表達(dá)刺激積累的多聚磷酸體不存在品質(zhì)問題。4、采用鎳離子誘導(dǎo)外源質(zhì)粒啟動(dòng)子啟動(dòng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因微藻過量積累多聚磷酸體，方法簡(jiǎn)單便捷；5、轉(zhuǎn)基因藻株具有高產(chǎn)多聚磷酸體的能力，且積累的多聚磷酸體為納米尺度，穩(wěn)定性良好，具有更小的粒徑，更容易被吸收利用。

同時(shí)，多聚磷酸體可以富集海水中豐富的礦物元素，可能具有更好的功能特性。顯然，本發(fā)明得到了研究利用價(jià)值很高的高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株，并得到了藻株制備及外源基因誘導(dǎo)表達(dá)的方法，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒構(gòu)建電泳圖；其中，a:泳道a:ppk與peasy-bluntzero重組克隆質(zhì)粒；泳道b:克隆質(zhì)粒雙酶切；泳道c:psyn_1表達(dá)質(zhì)粒；d:psyn_1質(zhì)粒雙酶切；泳道m(xù):1kbdnaladder；b:泳道a:ppk與psyn_1重組質(zhì)粒；泳道b:質(zhì)粒單酶切；泳道c:質(zhì)粒雙酶切；泳道m(xù):1kbdnaladder。

圖2為聚球藻7002細(xì)胞電鏡圖片；其中a:野生型；b:轉(zhuǎn)基因型。

圖3為納米多聚磷酸體粒徑和電鏡分析圖。

圖4為鎳離子濃度對(duì)納米多聚磷酸體產(chǎn)量的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件進(jìn)行。

實(shí)施例1：

1）目的基因的獲取

特異性引物設(shè)計(jì)：

ppk前引物:cccaagcttgaaggagataaaaagtatatgtcctctgcg

ppk后引物:cggggtaccctaatccaagctgtcctggag

前后引物分別添加hindiii和kpni酶切位點(diǎn)，前引物添加gaaggag序列的rbs序列。

pcr條件：50μl反應(yīng)體系，94℃5min，(94℃30s,60℃40s,1min72℃)循環(huán)30次;72℃反應(yīng)10min。

目的基因經(jīng)過常規(guī)方法純化、克隆后備用。

2）重組psyn_1質(zhì)粒的構(gòu)建：psyn_1質(zhì)粒和目的基因經(jīng)hindiii和kpni雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行連接，psyn_1質(zhì)粒100ng和ppk基因500ng，t4dna連接酶16℃連接3h，連接后的質(zhì)粒經(jīng)常規(guī)方法克隆，酶切鑒定質(zhì)粒的正確性，提純后備用。

3）重組轉(zhuǎn)基因藻株的構(gòu)建及篩選：100ng純化后的重組質(zhì)粒加入到濃縮15倍的新鮮培養(yǎng)基洗滌過的100μl聚球藻7002藻液（od750=1）中，自然狀態(tài)下靜置培養(yǎng)24h，取5μl涂布到含10μg/l鹽酸壯觀霉素的固體平板上進(jìn)行篩選，對(duì)篩選得到的單克隆藻株進(jìn)行鑒定，得到重組ppk基因的轉(zhuǎn)基因藻株。

4）轉(zhuǎn)基因藻株培養(yǎng)于含10μg/l的鹽酸壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，加入2μm的硝酸鎳對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)1周后檢測(cè)納米多聚磷酸體的含量。經(jīng)誘導(dǎo)的藻株的納米多聚磷酸體的含量相較野生株提高90%。

實(shí)施例2：

1）目的基因的獲取

特異性引物設(shè)計(jì)：

ppk前引物:cccaagcttgaaggagataaaaagtatatgtcctctgcg

ppk后引物:cggggtaccctaatccaagctgtcctggag

前后引物分別添加hindiii和kpni酶切位點(diǎn)，前引物添加gaaggag序列的rbs序列。

pcr條件：50μl反應(yīng)體系，94℃5min，(94℃30s,60℃40s,1min72℃)循環(huán)30次;72℃反應(yīng)10min。

目的基因經(jīng)過常規(guī)方法純化、克隆后備用。

2）重組psyn_1質(zhì)粒的構(gòu)建：psyn_1質(zhì)粒和目的基因經(jīng)hindiii和kpni雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行連接，psyn_1質(zhì)粒100ng和ppk基因1μg，t4dna連接酶16℃連接1h，連接后的質(zhì)粒經(jīng)常規(guī)方法克隆，酶切鑒定質(zhì)粒的正確性，提純后備用。

3）重組轉(zhuǎn)基因藻株的構(gòu)建及篩選：100ng純化后的重組質(zhì)粒加入到濃縮10倍的新鮮培養(yǎng)基洗滌過的100μl聚球藻7002藻液（od750=2）中，自然狀態(tài)下靜置培養(yǎng)24h，取5μl涂布到含10μg/l鹽酸壯觀霉素的固體平板上進(jìn)行篩選，對(duì)篩選得到的單克隆藻株進(jìn)行鑒定，得到重組ppk基因的轉(zhuǎn)基因藻株。

4）轉(zhuǎn)基因藻株培養(yǎng)于含10μg/l鹽酸壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，加入1μm的硝酸鎳對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)1周后檢測(cè)納米多聚磷酸體的含量。經(jīng)誘導(dǎo)的藻株的納米多聚磷酸體的含量相較野生株提高150%。

如圖1所示，a圖中兩種質(zhì)粒被雙酶切以后，被切割成含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的兩段。泳道b中約2000bp的片段為目的基因ppk片段，泳道d約4000b片段為切割后的質(zhì)粒，泳道d只有一條條帶是因?yàn)榱硪欢伪磺懈畹牟糠址浅６?，電泳結(jié)果觀察不到。如圖1.b所示，含ppk基因的重組psyn_1質(zhì)粒單酶切后得到了6000bp左右的片段，為目的基因約2000bp和psyn_1質(zhì)粒約4000bp，雙酶切后又分別得到了預(yù)期分子量大小的質(zhì)粒和目的基因，酶切鑒定結(jié)果證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)合基因測(cè)序結(jié)果，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

如圖2所示，圖中黑色斑點(diǎn)為多聚磷酸體，可以看到轉(zhuǎn)基因型的多聚磷酸體數(shù)量（8-11個(gè)）顯著多于野生型細(xì)胞中的數(shù)量（2-5個(gè)），且多聚磷酸體的粒徑大多低于100nm。

如圖3所示，圖3.a為通過水煮、純化等方法得到的納米多聚磷酸體的粒徑分析結(jié)果，粒徑結(jié)果顯示大多數(shù)粒徑在100nm以下，14nm和40nm兩種粒徑的較多。對(duì)提取得到納米多聚磷酸體進(jìn)行電鏡觀察，圖3.b，可以看到提取后納米多聚磷酸體維持了很好的納米形態(tài)。

如圖4所示，鎳離子可以誘導(dǎo)psyn_1質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，不同濃度鎳離子的誘導(dǎo)效果不同，wild組為野生型對(duì)照組，其他組添加了不同濃度的鎳離子，縱坐標(biāo)熒光值可以反映多聚磷酸體的含量，但是dapi熒光法反映的是多聚磷酸體表面的polyp含量，所以實(shí)際產(chǎn)量大于熒光值反應(yīng)的數(shù)值。

通過本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因藻株而制備的納米多聚磷酸體的產(chǎn)量較原生藻株提高90-150%，且轉(zhuǎn)基因微藻具有更好的環(huán)境適應(yīng)性，包括溫度耐受性和重金屬離子耐受能力。本發(fā)明中的藻株積累的ppb為納米尺度，粒徑范圍為十幾納米到一百納米不等，相比較其他生物來源的多聚磷酸體具有更小的粒徑，且分離得到的納米多聚磷酸體的穩(wěn)定性良好。本發(fā)明中的藻株遺傳穩(wěn)定性好，目前已穩(wěn)定表達(dá)超過1年。

序列表

<110>中國海洋大學(xué)

<120>高產(chǎn)納米多聚磷酸體的轉(zhuǎn)基因藻株及其制備方法

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cccaagcttgaaggagataaaaagtatatgtcctctgcg39

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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