亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一種原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻及其標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備與應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):11837126閱讀:737來(lái)源:國(guó)知局
一種原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻及其標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備與應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地涉及一種原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻及其標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備與應(yīng)用。



背景技術(shù):

貝類毒素具有強(qiáng)毒性和不可預(yù)見性等特點(diǎn),對(duì)消費(fèi)者健康安全和近海生態(tài)帶來(lái)嚴(yán)重威脅,是國(guó)際社會(huì)共同關(guān)注的生態(tài)災(zāi)害和重大海洋環(huán)境問(wèn)題?,F(xiàn)有8大類貝類毒素中,原多甲藻酸毒素(Azaspiracid,AZA)是最晚發(fā)現(xiàn)的一類新型脂溶性貝類毒素,但由于這類毒素毒性強(qiáng)、殘留高且代謝慢,因此成為歐盟、美國(guó)、加拿大等國(guó)家重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象,不僅將其限量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為160μg AZA-1eq/kg,監(jiān)控范圍包括AZA-1,AZA-2以及AZA-3三種同系物,3種同系物的結(jié)構(gòu)式質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖1、表1所示,而且在國(guó)際貿(mào)易中重點(diǎn)加以監(jiān)控。

表1 3種同系物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

AZA被認(rèn)為是已知貝類毒素中風(fēng)險(xiǎn)最大的一種,主要通過(guò)蓄積到貝類組織中對(duì)人類健康安全帶來(lái)威脅。AZA是現(xiàn)有貝類毒素中毒性較強(qiáng)的一種,對(duì)人類觀察到的最小效應(yīng)劑量(LOAEL)為0.4μg/kg b.w.,遠(yuǎn)低于麻痹性貝毒2μg/kg b.w.的水平。加上多種貝類對(duì)AZA的富集能力都極強(qiáng),最高則可達(dá)到8970μg/kg,為限量標(biāo)準(zhǔn)的56倍之多,比較而言,AZA在貝類中消除半衰期則長(zhǎng)達(dá)11天,不僅可長(zhǎng)時(shí)間存在于貝類中,而且消除過(guò)程中可代謝成數(shù)十種產(chǎn)物,其毒性和 風(fēng)險(xiǎn)性仍不明確,對(duì)消費(fèi)者帶來(lái)嚴(yán)重的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此,歐盟擬將貝類中AZA限量標(biāo)準(zhǔn)下調(diào)到30μg AZA-1eq/kg,并加強(qiáng)對(duì)這類毒素及其代謝物的監(jiān)控。

近幾年,已經(jīng)建立完善了多種AZA毒素的檢測(cè)方法,如生物檢測(cè)法、免疫分析法、細(xì)胞毒性檢測(cè)法及理化分析方法等。每一種方法都需要標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)定量和定性,以及質(zhì)控樣品對(duì)于檢測(cè)方法的控制。我國(guó)對(duì)于具有溯源、有證、實(shí)物標(biāo)樣的原多甲藻酸貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品或質(zhì)量控制樣品制備技術(shù)是個(gè)空白,尚未見有關(guān)其標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制報(bào)道。為了完成日??蒲信c監(jiān)測(cè)任務(wù),目前的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自加拿大海洋研究所,不僅存在到貨周期長(zhǎng)且出入境有嚴(yán)格的管理規(guī)定的問(wèn)題,尤其無(wú)法保證運(yùn)輸過(guò)程中的樣品穩(wěn)定性。

目前標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽(yáng)性貝類樣品經(jīng)過(guò)萃取純化后制備,存在諸多不足如下:由于貝類基質(zhì)復(fù)雜,標(biāo)準(zhǔn)品的制備步驟多,周期長(zhǎng);陽(yáng)性貝類采自自然條件下暴露中毒貝類,樣品來(lái)源不穩(wěn)定,批次間存在較大差異;標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度約10μg/mL溶液狀態(tài),每份體積為0.5mL,即不利于樣品的保存且取用時(shí)浪費(fèi),給檢測(cè)帶來(lái)巨大成本。

研制原多甲藻酸貝類毒素實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品可以滿足對(duì)貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品不斷日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求,解決國(guó)內(nèi)外貝類產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)重缺乏貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求,對(duì)提高食品安全檢測(cè)技術(shù)、解決技術(shù)壁壘、保障食品安全起到重大的作用,同時(shí)也提高我國(guó)在國(guó)際上的影響力。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明是針對(duì)目前原多甲藻酸毒素市售標(biāo)準(zhǔn)品的技術(shù)不足,提供一種原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻及其標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備與應(yīng)用。

本發(fā)明可提供原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻,用于原多甲藻酸毒素的粗提品制備。

本發(fā)明可提供應(yīng)用本方法制備的原多甲藻酸毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

本發(fā)明提供該原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一種原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻,于2016年4月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,分類命名為:Azadinium poporum AZDY06,保藏地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué),生物保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2016181。

利用上述產(chǎn)毒藻制備原多甲藻酸毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法,包括步驟如下:

(1)從培養(yǎng)的原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻、原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻培養(yǎng)液或攝食原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻之后的貝類陽(yáng)性樣品中提取原多甲藻酸毒素,獲得粗提毒素提取液;

(2)將步驟(1)所述粗提毒素提取液用硅膠柱和快速色譜柱進(jìn)行凈化,硅膠柱用的洗脫液分別用正己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇混合溶液;快速色譜柱的洗脫液為乙腈/H2O的混合液;

進(jìn)一步,所述步驟(2)中的乙腈/H2O的混合液中乙腈與H2O的體積比為3:2,另加有0.1%(體積比)的三乙胺。

(3)將步驟(2)凈化后的樣品過(guò)高效液相色譜柱,用含0.1%(體積比)甲酸的乙腈/水混合液進(jìn)行洗脫,收集目標(biāo)色譜峰,冷凍干燥,制得白色固體標(biāo)準(zhǔn)樣品;

將上述標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性,分析純度并定量;

檢驗(yàn)所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性。

進(jìn)一步,步驟(1)中從原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻中提取毒素的方法:將海水抽提過(guò)濾后,滅菌,加入2/f培養(yǎng)基,接種原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻,培養(yǎng)條件為溫度:20℃,光照強(qiáng)度:60%,光暗比為12h:12h,用玻璃纖維濾膜收集指 數(shù)期(>107cells/L)藻細(xì)胞,所述的指數(shù)期為藻細(xì)胞>107cells/L;將上述藻細(xì)胞用丙酮溶解,超聲細(xì)胞破碎,然后超濾離心,收集上清液。

進(jìn)一步,所述步驟(1)從原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻培養(yǎng)液中提取原多甲藻酸毒素的方法:用大孔吸附樹脂富集上述產(chǎn)毒藻培養(yǎng)液中AZA毒素,減壓旋蒸至干,用乙酸乙酯與氯化鈉水溶液進(jìn)行液相分散萃取后,所述乙酸乙酯與氯化鈉水溶液體積比為3:1,取出乙酸乙酯層,旋蒸至干后加入乙酸乙酯溶解,備用。

進(jìn)一步,所述步驟(1)從貝類陽(yáng)性樣品中提取原多甲藻酸毒素的方法:取出干凈的可食部分貝肉,在篩子上平鋪瀝水5min,然后將貝肉均質(zhì)、混勻,用10倍體積純甲醇分兩次提取樣品后,離心,收集上清液,50℃旋蒸濃縮至干,甲醇溶解后,備用。

附圖說(shuō)明

圖1是原多甲藻酸毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式;

圖2是本發(fā)明的原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品制備工藝流程示意圖;

圖3是本發(fā)明的原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的二級(jí)碎片譜圖:a、AZA1,b、AZA2,c、AZA3;1,2,3分別表示三種能量下20eV,35eV和50eV;

圖4是本發(fā)明的原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)譜圖:a、AZA1,b、AZA2,c、AZA3;

原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻,于2016年4月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,分類命名為:Azadinium poporum AZDY06,保藏地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué),生物保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2016181。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。

實(shí)施例1

一種原多甲藻酸毒素的產(chǎn)毒藻,于2016年4月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,分類命名為:Azadinium poporum AZDY06,生物保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2016181。

利用產(chǎn)毒藻制備原多甲藻酸毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法,具體工藝流程見圖2,

(1)原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻的培養(yǎng)與其毒素提取:將海水抽提過(guò)濾后,滅菌,加入2/f培養(yǎng)基,接種AZA產(chǎn)毒藻(Azadinium poporum)。溫度:20℃,光照強(qiáng)度:60%,光暗比為12h:12h。玻璃纖維濾膜收集指數(shù)期(>107cells/L)藻細(xì)胞;將上述藻細(xì)胞,用丙酮溶解,20%強(qiáng)度超聲細(xì)胞破碎,間隔0.2s一次。然后用10k超濾離心管1000×g超濾離心1min,收集上清液,獲得粗提毒素;

或原多甲藻酸毒素產(chǎn)毒藻培養(yǎng)液中的毒素富集與濃縮:用HP20大孔吸附樹脂富集上述產(chǎn)毒藻培養(yǎng)液中AZA毒素,減壓旋蒸至干,用乙酸乙酯與氯化鈉水溶液(體積比為3:1)進(jìn)行液相分散萃取后,取出乙酸乙酯層,旋蒸至干后加入乙酸乙酯溶解,獲得粗提毒素;

或貝類陽(yáng)性樣品中原多甲藻酸毒素的毒素提取與濃縮:用清水將貝殼外表洗凈。撬開貝殼,切斷閉殼肌,用水淋洗,去除內(nèi)部泥沙及其它異物,仔細(xì)取出貝肉,切勿割破貝體,在篩子上平鋪瀝水5min,然后將貝肉均質(zhì)、混勻。嚴(yán)禁加熱或用麻醉劑開殼。對(duì)扇貝樣品,只取可食部分。用10倍體積純甲醇分兩次提取樣品后,離心,收集上清液,40℃旋蒸濃縮至干,10mL甲醇溶解后,獲得粗提毒素;

(2)粗提毒素的凈化:將上述粗提毒素與silica gel(100-200目)混勻拌樣蒸干后,添加到預(yù)填(200-300目)silica gel萃取柱中(3×35cm),洗脫液為正己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇混合液(體積比9:1)、乙酸乙酯/甲醇混合 液(體積比7:3),先后分別用減壓過(guò)柱,所述的洗脫液各300mL,除了正己烷均含0.1%(體積比)甲酸,收集7:3的乙酸乙酯/甲醇洗脫液,旋蒸至干,備用;

(3)將步驟(2)所得樣品,用乙腈/H2O的混合液溶解后,加載到苯基己基(19.9×2cm)填充柱,用乙腈/H2O的混合液,4mL/min洗脫,收集樣品5mL,所述乙腈/H2O的混合液中乙腈/H2O體積比為3:2,另加0.1%(體積比)三乙胺;

(4)制備色譜:將步驟(2)收集的樣品分次手動(dòng)進(jìn)樣100uL,用半制備高效液相色譜光電二極管陣列(PDA)檢測(cè)(210nm),配Cosmosil nacalai Tesque C18(5μm,250×10mm)色譜柱,30℃,用乙腈/水(13:7,含0.1%甲酸)在2mL/min,進(jìn)行洗脫,收集目標(biāo)色譜峰,冷凍干燥,制得白色固體標(biāo)準(zhǔn)樣品。

(5)封裝所屬標(biāo)準(zhǔn)樣品:準(zhǔn)確稱取100μg樣品,分裝至2mL安培瓶中,乙炔噴燈封口,加貼唯一性標(biāo)示,凍存;

(6)分別用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法的二級(jí)碎片譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜庫(kù)匹配(見圖3)和高分辨液相色譜儀測(cè)定精確質(zhì)量數(shù)(見圖4)兩種方式進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,三個(gè)能量段(CE為20,35以及50eV)二級(jí)譜圖匹配度Fit值大于85%,且高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度小于3×10-7,兩種檢測(cè)方法均證明所分離標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為高純度AZA1,AZA2以及AZA3。

(7)定量并檢驗(yàn)所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性;

從樣品中隨機(jī)抽取10瓶,分別用甲醇移取稀釋,定容至10mL容量瓶,制成濃度為10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,分析標(biāo)準(zhǔn)樣品的AZA含量。所有試材以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下測(cè)試,分別稀釋至500ng/mL,200ng/mL,以及100ng/mL的溶液,以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè),單個(gè)濃度測(cè)試6次,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。每個(gè)樣品分三個(gè)批次進(jìn)行測(cè)試,標(biāo)準(zhǔn)品中AZA的對(duì)數(shù)值呈正態(tài)分布,結(jié)果見表2。

表2原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性試驗(yàn)

表3原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻檢驗(yàn)結(jié)果

從表3的結(jié)果分析可知,P=0.67>0.05,充分說(shuō)明了試驗(yàn)結(jié)果間沒(méi)有顯著性差異, 證明樣品均一,且標(biāo)準(zhǔn)樣品純度約為99.4%。

(8)穩(wěn)定性試驗(yàn)

將包裝完好的標(biāo)準(zhǔn)樣品置于+18℃條件下儲(chǔ)藏12個(gè)月以及置于+60℃條件下儲(chǔ)藏30天,分別抽取三組按照上述稀釋步驟檢測(cè),用于測(cè)定樣品穩(wěn)定性,具體試驗(yàn)結(jié)果見表4、表5:

表4 +18℃條件下儲(chǔ)藏12個(gè)月

表5 +60℃條件下儲(chǔ)藏30天

以上結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)樣品在兩種極限環(huán)境條件下穩(wěn)定性較好。

本發(fā)明方法制備的原多甲藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品,其毒素組分包括AZA1,AZA2,AZA3。

當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1