本發(fā)明涉及分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種水體中微囊藻毒素的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度加劇，有害藍(lán)藻水華發(fā)生日趨頻繁。藍(lán)藻水華暴發(fā)不僅造成水質(zhì)下降，而且微囊藻、魚腥藻、顫藻等還向水體釋放微囊藻毒素，危害水生生態(tài)系統(tǒng)的安全。

微囊藻毒素(Microcystin,MC)基本結(jié)構(gòu)是由7個(gè)氨基酸組成的單環(huán)多肽，也稱7肽單環(huán)肝毒素，相對(duì)分子量在1000左右。由于多肽可變位置上氨基酸種類的變化，導(dǎo)致了MC的多樣性。迄今已發(fā)現(xiàn)90多種MCs異構(gòu)體,毒性較強(qiáng)、產(chǎn)量較大的MC是MC-LR、MC-RR和MC-YR(L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。MC具有肝臟毒性和腫瘤促進(jìn)作用，它不僅對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用，還可能通過飲用水和食物鏈的生物富集危害人類健康。

MC有數(shù)量眾多的異構(gòu)體和類似物，藍(lán)藻水華爆發(fā)時(shí)，水體中往往包含了復(fù)雜的MC混合物，有時(shí)還會(huì)有其他種類的藍(lán)藻毒素，監(jiān)測(cè)水體中的MC比較困難。只有及時(shí)發(fā)現(xiàn)水體中MC的存在，才能對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性處理，降低人體健康風(fēng)險(xiǎn)。

目前，MC對(duì)水環(huán)境的影響和對(duì)人類及水生生物的毒害性已經(jīng)越來越引起全世界的廣泛關(guān)注，這帶來了對(duì)其檢測(cè)方法的強(qiáng)烈需求。近年來發(fā)展了多種基于生物化學(xué)或者基于復(fù)雜分析儀器的MC檢測(cè)方法?，F(xiàn)有測(cè)定藻毒素的生物化學(xué)分析方法雖然能在幾小時(shí)內(nèi)測(cè)定微囊藻毒素的總量，但不能識(shí)別微囊藻毒素的種類，且生物化學(xué)法易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；現(xiàn)有測(cè)定微囊藻毒素的儀器分析方法，大多需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，消耗大量有毒有機(jī)試劑，目標(biāo)物分離時(shí)間較長(zhǎng)，這致使樣品測(cè)試的成本較高，對(duì)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)操作者的身體健康造成嚴(yán)重威脅，不利于大量樣品的快速檢測(cè)，無法做到實(shí)時(shí)、快速、原位的檢測(cè)要求。

國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于利用液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)水體中微囊藻毒素的方法， 這些報(bào)道與本發(fā)明的樣品預(yù)處理方式、進(jìn)樣方式、電離方法、檢測(cè)原理不同(Elisabeth J.Faassen,Miquel Lürling.Occurrence of the Microcystins MC-LW and MC-LF in Dutch Surface Waters and Their Contribution to Total Microcystin Toxicity.Marine drugs.11(2013)2643-2654.)。而且樣品同樣需要經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理。另外，國(guó)內(nèi)外也有利用直接分析離子源質(zhì)譜儀分析檢測(cè)丙酮、藥品、爆炸物的文獻(xiàn)報(bào)道，這些報(bào)道與本發(fā)明的樣品預(yù)處理方式、進(jìn)樣方式、離子源設(shè)置、檢測(cè)目的、檢測(cè)對(duì)象不同(Guangming Xu,Bo Chen,Guozhu Liu,Shouzhuo Yao.Rapid analysis of acetone in human plasma by derivatizating on desorption electrospray ionization.Analyst.2010,135(9):2415-2419.)。

現(xiàn)有技術(shù)中未發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速的微囊藻毒素質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，因此發(fā)展一種實(shí)時(shí)、快速的微囊藻毒素質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)極其重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種水體中微囊藻毒素的檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)水體中微囊藻毒素的實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，具體技術(shù)方案如下：

一種水體中微囊藻毒素的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法為直接分析離子源-質(zhì)譜法，包括以下步驟：(1)水樣前處理制備待測(cè)樣品；(2)將待測(cè)樣品用直接分析離子源電離；(3)質(zhì)譜檢測(cè)已離子化的待測(cè)樣品。

在其中一些實(shí)施例中，所述直接分析離子源選自電噴霧解吸電離源、介質(zhì)阻擋放電離子源、電噴霧萃取電離源中的一種。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述直接分析離子源為電噴霧解吸電離源；步驟(1)所述水樣前處理的方法為：取待測(cè)水樣，用孔徑為Φ40～Φ120mm的玻璃纖維濾膜進(jìn)行真空抽濾，將濾液滴在樣品臺(tái)上加熱至50～80℃干燥30～200秒，制得待測(cè)樣品；步驟(2)的參數(shù)設(shè)置如下：電噴溶液管路與樣品臺(tái)的角度為30～80°，電噴溶液管路與樣品的距離為1～3mm，質(zhì)譜儀大氣壓接口與樣品臺(tái)的角度為10～60°，質(zhì)譜儀大氣壓接口與樣品的距離為1～5mm。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)所述玻璃纖維濾膜的孔徑為Φ50～Φ70， 所述干燥的溫度為50℃～60℃，所述干燥的時(shí)間為85～95秒；步驟(2)的參數(shù)設(shè)置如下：電噴溶液管路與樣品臺(tái)的角度為45～55°，電噴溶液管路與樣品的距離為1mm，質(zhì)譜儀大氣壓接口與樣品臺(tái)的角度為30～40°，質(zhì)譜儀大氣壓接口與樣品的距離為2.5～3.5mm。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述直接分析離子源為電噴霧萃取電離源；步驟(1)所述水樣前處理的方法為：取待測(cè)水樣，用孔徑為Φ40～Φ120mm的玻璃纖維濾膜進(jìn)行真空抽濾，濾液即為待測(cè)樣品；步驟(2)的參數(shù)設(shè)置如下：電噴溶液管路與進(jìn)樣管路之間的角度為20～150°，電噴溶液管路出口與進(jìn)樣管路出口之間的距離為1～20mm，進(jìn)樣管路和質(zhì)譜儀大氣壓接口之間的角度為100～170°，電噴溶液管路(或進(jìn)樣管路)出口和質(zhì)譜大氣壓接口處的距離為5～20mm，待測(cè)樣品溶液的流量為1-40μL/min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)所述玻璃纖維濾膜的孔徑為Φ50～Φ70；步驟(2)的參數(shù)設(shè)置如下：電噴溶液管路與進(jìn)樣管路的之間的角度為45～55°，電噴溶液管路出口與進(jìn)樣管路出口之間的距離為3～7mm，進(jìn)樣管路和質(zhì)譜儀大氣壓接口之間的角度為150～160°，電噴溶液管路(或進(jìn)樣管路)出口和質(zhì)譜儀大氣壓接口處的距離為8～12mm，待測(cè)樣品溶液的流量為15～25μL/min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)所述電離用到的電噴溶液選自甲醇、水、乙腈、甲酸、乙酸中的一種或多種，電噴溶液的流量為1～50μL/min，電噴溶液被施加的電壓為3～5kV。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)所述電離用到的電噴溶液為體積比為80：19：1的甲醇、水和乙酸的混合液或體積比為1:1的乙腈和水的混合液，電噴溶液的流量為8～12μL/min，電噴溶液被施加的電壓為3kV或5kV。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)所述電離用到的霧化氣為氮?dú)?、氦氣或氙氣，霧化氣的線速度為200～350m/s。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)所述電離用到的霧化氣為氮?dú)?，霧化氣的線速度為180～220m/s。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種直接分析離子源-質(zhì)譜檢測(cè)水體中微囊藻毒素的方法，通過直接分析電離源將水樣中微囊藻毒素電離后，進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行定性和定量分析?，F(xiàn)有技術(shù)通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法檢測(cè)微囊藻毒素，需要對(duì)樣品進(jìn)行反復(fù)的萃取和富集，耗時(shí)耗力，檢測(cè)效率低，該方法對(duì)水樣的萃取和富集過程包含在了檢測(cè)過程中，從而簡(jiǎn)化了預(yù)處理，只需要對(duì)水樣進(jìn)行簡(jiǎn)單的過濾或者過濾加快速烘干的前處理，即可直接檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，能夠滿足實(shí)時(shí)、快速、原位的檢測(cè)要求，解決了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中樣品前處理復(fù)雜，難以實(shí)時(shí)快速檢測(cè)水體中微囊藻毒素的問題。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可同時(shí)進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析，可以同時(shí)分析多種微囊藻毒素，為實(shí)際操作提供了便利性。

附圖說明

圖1為直接分析離子源-質(zhì)譜法檢測(cè)水體中微囊藻毒素的流程示意圖；

圖2為電噴霧解析電離源示意圖；

圖3為實(shí)施例1的電噴霧解析電離源示意圖；

圖4為電噴霧萃取電離源示意圖；

圖5為實(shí)施例2的電噴霧萃取電離源示意圖；

圖6為實(shí)施例1中含微囊藻毒素MC-RR和MC-LR的水樣的質(zhì)譜圖；

圖7為實(shí)施例2中含微囊藻毒素MC-RR和MC-LR的水樣的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1電噴霧解吸電離源-質(zhì)譜法檢測(cè)水體中的微囊藻毒素

一、實(shí)驗(yàn)儀器

按常規(guī)方法制備電噴霧解吸電離源，如圖2和圖3所示，主要部件包括：三維移動(dòng)平臺(tái)、電噴液管路、霧化器、樣品臺(tái)等，電離源的結(jié)構(gòu)和原理參考美國(guó)普渡大學(xué)的研究成果：R.Graham Cooks,Zheng Ouyang,Zoltan Takats,Justin M.Wiseman.Ambient Mass Spectrometry.Science 311(2006):1566-1570。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、水樣配制：稱取MC-RR 500μg和MC-LR 250μg，混合后用500μL甲醇溶解，再用純水定容至500ml，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中MC-RR、MC-LR的溶度分別為1μg/mL、0.5μg/mL。用環(huán)境水樣(按照GB/T 20466-2006檢測(cè)，未檢出微囊藻毒素)將微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋至MC-RR、MC-LR的溶度分別為10μg/L、5μg/L，作為待測(cè)溶液，儲(chǔ)存于冰箱中待測(cè)。

2、水樣前處理：取一定量水樣，用玻璃纖維濾膜(Φ60)在150mbar的條件下真空抽濾，濾液滴在樣品臺(tái)上加熱干燥90s(50℃)，制得待測(cè)樣品。

3、電離和檢測(cè)：

(1)儀器調(diào)試：調(diào)整電噴溶液管路與樣品臺(tái)的角度為50°，電噴溶液管路與樣品的距離為1mm，質(zhì)譜儀大氣壓接口與樣品臺(tái)的角度為35°，質(zhì)譜儀大氣壓接口與樣品的距離為3mm，電噴溶液的流量為10μL/min，霧化氣線速度為200m/s。

(2)進(jìn)樣和檢測(cè)：所用的電噴溶液(甲醇:水:乙酸的體積比為80：19：1)先被加以3kv的電壓，并從霧化器的內(nèi)套管中噴出,霧化器外套管噴出的高速氮?dú)庋杆賹⑷軇╈F化并使其加速，令帶電的液滴撞擊到待測(cè)樣品表面。待測(cè)樣品被高速液滴撞擊后發(fā)生濺射進(jìn)入氣相，同時(shí)由于氮?dú)獾拇祾吆透稍镒饔?，含有待測(cè)樣品的帶電液滴發(fā)生去溶劑化，進(jìn)入毛細(xì)管大氣壓接口，然后被質(zhì)譜儀的檢測(cè)器檢測(cè)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)施例用含微囊藻毒素MC-RR(10μg/L)和MC-LR(5μg/L)的水樣作為樣品，得到m/z＝519.79(MC-RR,[M+2H]²⁺)和m/z＝498.282(MC-LR,[M+2H]²⁺)的質(zhì)譜特征峰，MC-RR的特征峰面積為MC-LR的2倍，如圖6所示。試驗(yàn)結(jié)果表明：1對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單預(yù)處理后，可以直接檢測(cè)水體中的微囊藻毒素；2根據(jù)質(zhì)荷比，可以判定微囊藻毒素的種類；3根據(jù)微囊藻毒素的特征峰面積，可以對(duì)其進(jìn)行定量分析；4檢測(cè)結(jié)果中微囊藻毒素的質(zhì)荷比數(shù)值可以精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位，從而可以根據(jù)質(zhì)荷比將微囊藻毒素特征峰和雜質(zhì)峰分開。

實(shí)施例2電噴霧萃取電離源-質(zhì)譜法檢測(cè)水體中的微囊藻毒素

一、實(shí)驗(yàn)儀器

按常規(guī)方法制備電噴霧萃取電離源，如圖4和圖5所示，主要部件包括：三維移動(dòng)平臺(tái)、電噴液管路、霧化器、進(jìn)樣管路等，離子源的結(jié)構(gòu)和原理參考Chen等的設(shè)計(jì)：Chen,H.W.；Venter,A.；Cooks,R.G.,Extractive electrospray ionization for direct analysis of undiluted urine,milk and other complex mixtures without sample preparation.Chem.Commun.19(2006):2042-2044.

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、水樣配制：稱取MC-RR 750μg和MC-LR 250μg，混合后用500μL甲醇溶解，再用純水定容至500ml，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中MC-RR、MC-LR的溶度分別為1.5μg/mL、0.5μg/mL。用環(huán)境水樣(按照GB/T 20466-2006檢測(cè)，未檢出微囊藻毒素)將微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋至MC-RR、MC-LR的溶度分別為15μg/L、5μg/L，作為待測(cè)溶液，儲(chǔ)存于冰箱中待測(cè)。其他濃度比例的微囊藻毒素水樣也按照上述方法配置。

2、水樣前處理：取一定量水樣，用玻璃纖維濾膜(Φ60)在150mbar的條件下真空抽濾，制得待測(cè)樣品溶液。

3、電離和檢測(cè)：

(1)儀器調(diào)試：調(diào)整電噴溶液管路出口與進(jìn)樣管路之間的角度為50°，電噴溶液管路出口與進(jìn)樣管路出口之間的距離為5mm，進(jìn)樣管路和質(zhì)譜儀大氣壓接口之間的角度為155°，電噴溶液管路(或進(jìn)樣管路)出口和質(zhì)譜儀大氣壓接口處的距離為10mm。電噴溶液的流量為10μL/min，待測(cè)樣品溶液流量為20μL/min，霧化氣的線速度為200m/s。

(2)進(jìn)樣和檢測(cè)：所用的電噴溶液(乙腈:水的體積比為1:1)先被加以5kv的電壓，并從霧化器的內(nèi)套管中噴出,霧化器外套管噴出的高速氮?dú)庋杆賹⑷軇╈F化并使其加速；待測(cè)樣品溶液在進(jìn)樣管路中同樣被高速氮?dú)忪F化；電噴溶液和待測(cè)樣品溶液的霧滴同時(shí)進(jìn)入質(zhì)譜儀大氣壓接口前的三維空間里，電噴溶液對(duì)樣品進(jìn)行微萃取和離子化，然后進(jìn)入質(zhì)譜儀大氣壓接口，被質(zhì)譜儀的檢測(cè)器檢測(cè)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)施例用含微囊藻毒素MC-RR(15μg/L)和MC-LR(5μg/L)的水樣作為樣品，得到m/z＝519.79(MC-RR,[M+2H]²⁺)和m/z＝498.282(MC-LR,[M+2H]²⁺)的質(zhì)譜特征峰，MC-RR的特征峰面積為MC-LR的3倍，如圖7所示。試驗(yàn)結(jié)果表明：1對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單預(yù)處理后，可以直接檢測(cè)水體中的微囊藻毒素；2根據(jù)質(zhì)荷比，可以判定微囊藻毒素的種類；3根據(jù)微囊藻毒素的特征峰面積，可以對(duì)其進(jìn)行定量分析；4檢測(cè)結(jié)果中微囊藻毒素的質(zhì)荷比數(shù)值可以精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位，從而可以根據(jù)質(zhì)荷比將微囊藻毒素特征峰和雜質(zhì)峰分開。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。