本發(fā)明設(shè)計(jì)一種金黃色葡萄球菌的電化學(xué)檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，是人類的一種重要病原菌，能夠引起許多嚴(yán)重感染。典型的金黃色葡萄球菌為球形，直徑0.8um左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。其營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度37℃，最適生長(zhǎng)pH7.4且有較高的耐鹽性，是一種不利于人體的細(xì)菌。

金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33％，加拿大則高達(dá)45％，在我國(guó)每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也屢有報(bào)道。

金黃色葡萄球菌的表面蛋白A(Spa)能與免疫球蛋白的Fc部分相連，可使金黃色葡萄球菌進(jìn)入人體宿主后，不被調(diào)理吞噬。菌體中的分選酶A(SrtA)是表面蛋白錨定到菌體細(xì)胞壁這一過程的關(guān)鍵酶，它是一種膜結(jié)合巰基轉(zhuǎn)肽酶，由206個(gè)氨基酸組成，具有催化活性的Cys184位于分選酶特征基序LXTC上。SrtA通過識(shí)別革蘭氏陽性菌表面蛋白的C-末端分選信號(hào)中的LPXTG基序(Leu-Pro-X-Thr-Cly)，使LPXTG結(jié)構(gòu)在蘇氨酸和甘氨酸之間的肽鍵斷裂，并且有蘇氨酸(T)的羧基基團(tuán)與細(xì)胞壁五甘氨酸交聯(lián)橋的氨基基團(tuán)之間形成一個(gè)酰胺鍵，從而使其被錨定到細(xì)胞壁的肽聚糖上。

目前，國(guó)標(biāo)中對(duì)金葡菌的檢測(cè)方法包括微生物法和ELISA法。微生物法耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣。ELISA方法所耗時(shí)間相對(duì)較短，但其操作技巧性強(qiáng)，關(guān)鍵點(diǎn)的控制對(duì)結(jié)果影響大，檢出限高達(dá)10⁶CFU/mL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction，PCR)為國(guó)標(biāo)法之外研究的最成熟的金葡菌檢測(cè)方法，但是PCR法所需的試劑昂貴，整個(gè)檢測(cè)過程步驟復(fù)雜。由于該方法極其敏感，外源性DNA、試驗(yàn)條件控制不當(dāng)、引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇等均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些技術(shù)比傳統(tǒng)微生物法快速，比PCR法簡(jiǎn)單，但是需要貴重儀器，且檢出限高，一般為10⁵～10⁶CFU/ml?？焖?、高靈敏、高特異性的檢測(cè)技術(shù)研究意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為了解決上述中現(xiàn)有的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法。利用分選酶A(SrtA)能夠識(shí)別革蘭氏陽性菌表面蛋白C-末端分選信號(hào)中的LPXTG序列的特點(diǎn)，將分選酶A從菌液中提取、純化出來，采用共價(jià)結(jié)合的方法將其固定到羧基功能化的介孔碳納米材料O-CMK-3表面，制成碳糊電極，利用三電極檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)金葡菌，采用差分脈沖伏安法(DPV)引起電信號(hào)發(fā)生變化進(jìn)而推知金黃色葡萄球菌的存在。該電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)金葡菌較現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法具有無需標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間短、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的技術(shù)方案由以下部分組成。

1)有序介孔碳材料CMK-3的制備：1.25g蔗糖和0.14g濃硫酸溶解在5.0g水中，往該溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；0.75g蔗糖，0.08g濃硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入該混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；將得到的產(chǎn)品在氮?dú)夥罩?00℃煅燒6h，升溫速度2.5℃/min，最后將產(chǎn)品在氫氟酸中浸泡，洗滌、干燥。最終得到有序介孔碳材料CMK-3。

2)羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3的制備：將300mg CMK-3納米材料浸入到15mL 1.75mol/L的過硫酸銨溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴攪拌24h，洗滌、干燥，制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。

3)固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料O-CMK-3-M的制備：5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL緩沖液中，取30mg羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3加入溶液中，室溫下超聲分散30min，取1mL11.486mg/mL分選酶A加入Tris-HCL緩沖液中，37℃條件下150rpm震蕩培養(yǎng)8h，離心取沉淀，制得固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料。

4)取0.015g固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料，0.065g石墨，與24uL的液體石蠟研磨均勻，制成碳糊電極，沒入金黃色葡萄球菌菌液中檢測(cè)。檢測(cè)方法為差分脈沖伏安法(DPV)，條件為：起始點(diǎn)位0.2V，最高點(diǎn)位1.3V，電位增幅0.004V，脈沖寬度為0.06s，脈沖周期為0.02s，靜止時(shí)間0.5s，靈敏度1.0e-003A/V，檢測(cè)時(shí)間間隔為20min。

本發(fā)明采用的羧基功能化CMK-3具有納米尺度結(jié)構(gòu)，比表面積高、孔體積大等優(yōu)點(diǎn)；固定化分選酶A制成碳糊電極能夠?qū)崿F(xiàn)金黃色葡萄球菌的快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比無需標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)、檢測(cè)穩(wěn)定性良好、檢測(cè)簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行描述。

附圖說明

圖1、2為本發(fā)明制得的有序介孔碳材料CMK-3的SEM照片；

圖3為本發(fā)明制得的羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3的紅外光譜圖；

圖4為本發(fā)明制得的固定化分選酶納米復(fù)合材料O-CMK-3-M的紅外光譜圖；

圖5為本發(fā)明制得的羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3的X射線光電子能譜圖；

圖6、7為本發(fā)明制得的固定化分選酶納米復(fù)合材料O-CMK-3-M的X射線光電子能譜圖；

圖8為本發(fā)明固定化分選酶納米復(fù)合材料O-CMK-3-M檢測(cè)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

具體實(shí)施例

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

將1.25g蔗糖和0.14g濃硫酸溶解在5.0g水中，往該溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；0.75g蔗糖，0.08g濃硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入該混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；將得到的產(chǎn)品在氮?dú)夥罩?00℃煅燒6h，升溫速度2.5℃/min，最后將產(chǎn)品在氫氟酸中浸泡，洗滌、干燥。最終得到有序介孔碳材料CMK-3。

將300mg CMK-3納米材料浸入到15mL 1.75mol/L的過硫酸銨溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴攪拌24h，洗滌、干燥，制得制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。

5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL緩沖液中，取30mg羧基功能化CMK-3加入溶液中，室溫下超聲分散30min，取1mL 11.486mg/mL分選酶加入Tris-HCL緩沖液中，37℃條件下150rpm震蕩培養(yǎng)8h，離心取沉淀，制得固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料O-CMK-3-M。

取0.015g固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料，0.065g石墨，與24uL的液體石蠟研磨均勻，制成碳糊電極，沒入金黃色葡萄球菌菌液中檢測(cè)。檢測(cè)方法為差分脈沖伏安法(DPV)，條件為：起始點(diǎn)位0.2V，最高點(diǎn)位1.3V，電位增幅0.004V，脈沖寬度為0.06s，脈沖周期為0.02s，靜止時(shí)間0.5s，靈敏度1.0e-003A/V。

經(jīng)上述方法測(cè)的結(jié)果有明顯的且規(guī)律的峰電流值。

實(shí)施例2

將1.25g蔗糖和0.14g濃硫酸溶解在5.0g水中，往該溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；0.75g蔗糖，0.08g濃硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入該混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；將得到的產(chǎn)品在氮?dú)夥罩?00℃煅燒6h，升溫速度2.5℃/min，最后將產(chǎn)品在氫氟酸中浸泡，洗滌、干燥。最終得到有序介孔碳材料CMK-3。

將300mg CMK-3納米材料浸入到15mL 1.75mol/L的過硫酸銨溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴攪拌24h，洗滌、干燥，制得制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。

5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL緩沖液中，取30mg羧基功能化CMK-3加入溶液中，室溫下超聲分散30min，取1mL 11.486mg/mL分選酶加入Tris-HCL緩沖液中，37℃條件下120rpm震蕩培養(yǎng)8h，離心取沉淀，制得固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料O-CMK-3-M。

取0.015g固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料，0.065g石墨，與24uL的液體石蠟研磨均勻，制成碳糊電極，沒入金黃色葡萄球菌菌液中檢測(cè)。檢測(cè)方法為差分脈沖伏安法(DPV)，條件為：起始點(diǎn)位0.2V，最高點(diǎn)位1.3V，電位增幅0.004V，脈沖寬度為0.06s，脈沖周期為0.02s，靜止時(shí)間0.5s，靈敏度1.0e-003A/V。

經(jīng)上述方法測(cè)的結(jié)果未見有明顯的且規(guī)律的峰電流值。

實(shí)施例3

將1.25g蔗糖和0.14g濃硫酸溶解在5.0g水中，往該溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；0.75g蔗糖，0.08g濃硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入該混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升溫至160℃加熱6h；將得到的產(chǎn)品在氮?dú)夥罩?00℃煅燒6h，升溫速度2.5℃/min，最后將產(chǎn)品在氫氟酸中浸泡，洗滌、干燥。最終得到有序介孔碳材料CMK-3。

將300mg CMK-3納米材料浸入到15mL 1.75mol/L的過硫酸銨溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴攪拌24h，洗滌、干燥，制得制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。

5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL緩沖液中，取30mg羧基功能化CMK-3加入溶液中，室溫下超聲分散30min，取1mL 11.486mg/mL分選酶加入Tris-HCL緩沖液中，37℃條件下180rpm震蕩培養(yǎng)8h，離心取沉淀，制得固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料O-CMK-3-M。

取0.015g固定化分選酶介孔碳納米復(fù)合材料，0.065g石墨，與24uL的液體石蠟研磨均勻，制成碳糊電極，沒入金黃色葡萄球菌菌液中檢測(cè)。檢測(cè)方法為差分脈沖伏安法(DPV)，條件為：起始點(diǎn)位0.2V，最高點(diǎn)位1.3V，電位增幅0.004V，脈沖寬度為0.06s，脈沖周期為0.02s，靜止時(shí)間0.5s，靈敏度1.0e-003A/V。

經(jīng)上述方法測(cè)的結(jié)果未見有明顯的且規(guī)律的峰電流值。