本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方。

背景技術(shù)：

生物制藥是國(guó)家發(fā)展的重點(diǎn)項(xiàng)目之一。其獨(dú)特之處在于生物藥物只能用活性載體如細(xì)胞來(lái)表達(dá)。傳統(tǒng)的化學(xué)合成方式不能用于生物藥及疫苗的生產(chǎn)。作為生物制藥所必需的支柱性原材料，細(xì)胞培養(yǎng)基的等級(jí)和相應(yīng)生產(chǎn)工藝流程的放大直接反映了國(guó)家生物制藥工業(yè)的發(fā)展水平及藥物成本的高低。目前高等級(jí)無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)與生產(chǎn)技術(shù)及全球細(xì)胞培養(yǎng)基市場(chǎng)基本由sigma、life、hyclone等美國(guó)公司所壟斷，因此國(guó)內(nèi)生物制藥企業(yè)在供貨時(shí)間及成本上受制于人，這也是阻礙國(guó)內(nèi)企業(yè)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化和以低成本與國(guó)際生物制藥企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的主要因素之一。中國(guó)2010版藥典及gmp法規(guī)對(duì)國(guó)內(nèi)生物制藥企業(yè)所用細(xì)胞培養(yǎng)基提出了更高的要求，盡管已批準(zhǔn)的一些老產(chǎn)品還準(zhǔn)許使用含血清培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基已是當(dāng)前新藥物報(bào)批的必要條件。但由于國(guó)內(nèi)尚無(wú)高質(zhì)量的、產(chǎn)業(yè)化的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)企業(yè)所使用的高等級(jí)無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基還基本全部依賴進(jìn)口。本發(fā)明開發(fā)的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品居于國(guó)際先進(jìn)水平，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基高端產(chǎn)品的空白。

由于研發(fā)技術(shù)人員和工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的匱乏，目前國(guó)內(nèi)的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基研發(fā)和生產(chǎn)技術(shù)還處在較低水平。根據(jù)被默克（merck）公司收購(gòu)的國(guó)內(nèi)培養(yǎng)基公司，北京清大天一生物技術(shù)有限公司，2008年4月公布的數(shù)據(jù)顯示，清大天一的無(wú)血清培養(yǎng)基可以支持大約300mg/l的抗體產(chǎn)量。與目前國(guó)外培養(yǎng)基支持的平均2-3g/l的產(chǎn)量相比還有10倍的差距。這個(gè)差距意味著使用目前國(guó)內(nèi)最大的培養(yǎng)基公司的產(chǎn)品所生產(chǎn)的生物藥，要比使用國(guó)外培養(yǎng)基公司所生產(chǎn)的生物藥高10倍的價(jià)錢才能達(dá)到同樣的盈利。市場(chǎng)上另外一家國(guó)內(nèi)企業(yè)僅能生產(chǎn)配方公開并需配合血清一起使用的低端商業(yè)化產(chǎn)品，年產(chǎn)量不到30噸，供已批準(zhǔn)的老的疫苗產(chǎn)品使用。其余生物仿制藥及高端疫苗所使用的高附加值無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基全部依賴進(jìn)口。因此有必要自主研發(fā)屬于我國(guó)自己的無(wú)血清細(xì)胞大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，其無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品居于國(guó)際先進(jìn)水平，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)高等級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基高端產(chǎn)品的空白，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，包括以下原料：無(wú)機(jī)鹽成分、有機(jī)物成分、氨基酸及氨基酸鹽、能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物、維生素及抗氧化劑、蛋白質(zhì)及多肽、微量元素和顯色物質(zhì)；其培養(yǎng)流程分為：選定基礎(chǔ)配方、進(jìn)行組合篩選、結(jié)果鑒定評(píng)估、新配方試培養(yǎng)；并按以下方法配比：

s1：將上述原料加水溫為20℃-30℃的注射用水至950毫升，并輕微攪拌至溶解；

s2：加入2.438克碳酸氫鈉，并輕微攪拌溶解，再加注射用水至1升；

s3：選擇用1mol/l氫氧化鈉溶液或1mol/l鹽酸溶液調(diào)ph至所需值；

s4：用0.1μm直徑濾膜正壓過(guò)濾除菌，并將培養(yǎng)基溶液放置2℃-8℃下避光存儲(chǔ)。

優(yōu)選的，無(wú)機(jī)鹽成分具體的重量配比包括有：無(wú)水氯化鈣116.6mg、氯化鉀311.8mg、氯化鎂28.64mg、無(wú)水硫酸鎂48.84mg、氯化鈉6999.5mg、無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg和磷酸氫二鈉71.02mg。

優(yōu)選的，有機(jī)物成分具體的重量配比包括有：4-丁二胺二鹽酸鹽0.081mg、丙酮酸鈉55mg、鹽酸吡哆醛2mg、鹽酸吡哆醇0.031mg。

優(yōu)選的，氨基酸及氨基酸鹽具體的重量配比包括有：l-亮氨酸59.05mg、l-賴氨酸鹽酸鹽91.25mg、l-蛋氨酸17.24mg、l-苯丙氨酸35.48mg、l-絲氨酸26.25mg、l-蘇氨酸53.45mg、l-丙氨酸4.45mg、l-天門冬酰胺7.5mg、l-天門冬氨酸6.65mg、l-半胱氨酸鹽酸鹽26.34mg、l-谷氨酸11.03mg、l-精氨酸鹽酸鹽147.5mg、l-脯氨酸17.25mg、l-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg、l-色氨酸9.02mg、l-谷氨酰胺365mg、l-酪氨酸38.4mg、甘氨酸28.13mg、l-纈氨酸52.85mg、l-組氨酸鹽酸鹽31.48mg、l-異亮氨酸54.47mg、l-羥脯氨酸6.82mg。

優(yōu)選的，能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物具體添加的重量配比包括有：亞油酸0.042mg、肌醇12.6mg、氯化膽堿8.98mg、煙酰胺2.02mg、d-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、次黃嘌呤2mg。

優(yōu)選的，維生素及抗氧化劑具體的重量配比包括有：硫辛酸0.105mg、維生素h0.0035mg、d-泛酸鈣2.24mg、葉酸2.65mg、核黃素0.219mg、鹽酸硫胺2.17mg、維生素b20.4mg、維生素b120.68mg、維生素c-2-磷酸鹽87.54mg。

優(yōu)選的，蛋白質(zhì)及多肽具體的重量配比包括有：轉(zhuǎn)鐵蛋白4000mg、胰島素1200mg、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2.0mg、表皮生長(zhǎng)因子1.65mg、人血清白蛋白856.36mg、孕酮150mg。

優(yōu)選的，微量元素具體的重量配比包括有：五水硫酸銅0.0013mg、九水硝酸鐵0.05mg、七水硫酸亞鐵0.417mg、七水硫酸鋅0.432mg、二水氟化銀0.0085mg、十八水硫酸鋁0.049mg、二水氯化鋇0.0092mg、八水硫酸鎘0.0008mg、七水硫酸鈷0.0057mg、九水硝酸鉻0.0038mg、水合偏鍺酸鈉0.0009mg、五水亞硒酸鈉0.013mg、溴化鉀0.0071mg、二水碘化鈉0.0007mg、七水硫酸錳0.0025mg、九水硅酸鈉0.034mg、二水偏釩酸鈉0.06mg、二水鉬酸鈉0.074mg、六水二氯化鎳0.0086mg、氯化銣0.0017mg、三水錫酸鉀0.0054mg、二水硝酸氧鋯0.004mg。

優(yōu)選的，顯色物質(zhì)為8.1mg的酚紅溶液。

優(yōu)選的，針對(duì)s4中培養(yǎng)基溶液的性狀為：溶解性、完全溶解、溶液澄明。

優(yōu)選的，針對(duì)s3中ph值調(diào)配：加nahco3為6.60-7.20，不加nahco3為5.50-6.10；滲透壓為：加nahco3為277-312，不加nahco3為234-258；其細(xì)菌內(nèi)毒素≤10eu/ml；微生物檢查≤1000cfu/g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，其無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品居于國(guó)際先進(jìn)水平，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)高等級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基高端產(chǎn)品的空白，其具備市場(chǎng)大、用途廣等優(yōu)點(diǎn)，所有以細(xì)胞為平臺(tái)生產(chǎn)的疫苗、大分子生物藥物（包括：?jiǎn)慰寺】贵w、重組蛋白藥）都需要使用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，解決了國(guó)內(nèi)進(jìn)口配方成本高的問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的整體流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例二示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例二示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例三示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例三示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，包括以下原料：無(wú)機(jī)鹽成分、有機(jī)物成分、氨基酸及氨基酸鹽、能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物、維生素及抗氧化劑、蛋白質(zhì)及多肽、微量元素和顯色物質(zhì)；其中，無(wú)機(jī)鹽成分具體的重量配比包括有：無(wú)水氯化鈣116.6mg、氯化鉀311.8mg、氯化鎂28.64mg、無(wú)水硫酸鎂48.84mg、氯化鈉6999.5mg、無(wú)水磷酸二氫鈉54.35mg和磷酸氫二鈉71.02mg；有機(jī)物成分具體的重量配比包括有：4-丁二胺二鹽酸鹽0.081mg、丙酮酸鈉55mg、鹽酸吡哆醛2mg、鹽酸吡哆醇0.031mg；氨基酸及氨基酸鹽具體的重量配比包括有：l-亮氨酸59.05mg、l-賴氨酸鹽酸鹽91.25mg、l-蛋氨酸17.24mg、l-苯丙氨酸35.48mg、l-絲氨酸26.25mg、l-蘇氨酸53.45mg、l-丙氨酸4.45mg、l-天門冬酰胺7.5mg、l-天門冬氨酸6.65mg、l-半胱氨酸鹽酸鹽26.34mg、l-谷氨酸11.03mg、l-精氨酸鹽酸鹽147.5mg、l-脯氨酸17.25mg、l-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg、l-色氨酸9.02mg、l-谷氨酰胺365mg、l-酪氨酸38.4mg、甘氨酸28.13mg、l-纈氨酸52.85mg、l-組氨酸鹽酸鹽31.48mg、l-異亮氨酸54.47mg、l-羥脯氨酸6.82mg；能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物具體添加的重量配比包括有：亞油酸0.042mg、肌醇12.6mg、氯化膽堿8.98mg、煙酰胺2.02mg、d-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、次黃嘌呤2mg；維生素及抗氧化劑具體的重量配比包括有：硫辛酸0.105mg、維生素h0.0035mg、d-泛酸鈣2.24mg、葉酸2.65mg、核黃素0.219mg、鹽酸硫胺2.17mg、維生素b20.4mg、維生素b120.68mg、維生素c-2-磷酸鹽87.54mg；蛋白質(zhì)及多肽具體的重量配比包括有：轉(zhuǎn)鐵蛋白4000mg、胰島素1200mg、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2.0mg、表皮生長(zhǎng)因子1.65mg、人血清白蛋白856.36mg、孕酮150mg；微量元素具體的重量配比包括有：五水硫酸銅0.0013mg、九水硝酸鐵0.05mg、七水硫酸亞鐵0.417mg、七水硫酸鋅0.432mg、二水氟化銀0.0085mg、十八水硫酸鋁0.049mg、二水氯化鋇0.0092mg、八水硫酸鎘0.0008mg、七水硫酸鈷0.0057mg、九水硝酸鉻0.0038mg、水合偏鍺酸鈉0.0009mg、五水亞硒酸鈉0.013mg、溴化鉀0.0071mg、二水碘化鈉0.0007mg、七水硫酸錳0.0025mg、九水硅酸鈉0.034mg、二水偏釩酸鈉0.06mg、二水鉬酸鈉0.074mg、六水二氯化鎳0.0086mg、氯化銣0.0017mg、三水錫酸鉀0.0054mg、二水硝酸氧鋯0.004mg；顯色物質(zhì)為8.1mg的酚紅溶液。

其培養(yǎng)流程分為：在配方庫(kù)中選定基礎(chǔ)配方、在培養(yǎng)箱中進(jìn)行組合篩選、用軟件進(jìn)行結(jié)果鑒定評(píng)估、新配方試培養(yǎng)；并按以下方法配比：

第一步：將上述原料加水溫為20℃-30℃的注射用水至950毫升，并輕微攪拌至溶解；

第二步：加入2.438克碳酸氫鈉，并輕微攪拌溶解，再加注射用水至1升；

第三步：選擇用1mol/l氫氧化鈉溶液或1mol/l鹽酸溶液調(diào)ph至所需值；其ph值調(diào)配：加nahco3為6.60-7.20，不加nahco3為5.50-6.10；滲透壓為：加nahco3為277-312，不加nahco3為234-258；其細(xì)菌內(nèi)毒素≤10eu/ml；微生物檢查≤1000cfu/g；

第四步：用0.1μm直徑濾膜正壓過(guò)濾除菌，并將培養(yǎng)基溶液放置2℃-8℃下避光存儲(chǔ)；其培養(yǎng)基溶液的性狀為：溶解性、完全溶解、溶液澄明。

實(shí)施例一：

一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，包括以下原料：無(wú)機(jī)鹽成分、有機(jī)物成分、氨基酸及氨基酸鹽、能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物、維生素及抗氧化劑、蛋白質(zhì)及多肽、微量元素和顯色物質(zhì)；按上述方法進(jìn)行人多能干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)。

人多能干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：在配制好的培養(yǎng)基溶液中加入新鮮配制的bfgf(即：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，每升培養(yǎng)基加入bfgf2mg)、β-巰基乙醇(每升培養(yǎng)液加入β-巰基乙醇7μl)；維持人多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)，使多能干細(xì)胞自我更新、增殖，從而達(dá)到增加細(xì)胞數(shù)量、擴(kuò)大儲(chǔ)備、可進(jìn)行后續(xù)分裝、保種的目的；與當(dāng)前市場(chǎng)同類產(chǎn)品(dmem/f12+knockoutsr(invitrogen公司)、stemprohescsfm培養(yǎng)基、knockout^tmcts^tmzenofree培養(yǎng)基)相比，在細(xì)胞集落形態(tài)方面并無(wú)差異；人多能干細(xì)胞在未分化狀態(tài)下表達(dá)一種特異性蛋白，即ssea-4(stagespecificembryonicantigen-4，階段特異性胚胎抗原-4)，本配方培養(yǎng)基與市場(chǎng)同類產(chǎn)品之間就ssea-4⁺陽(yáng)性細(xì)胞占比而言，并無(wú)顯著性差異。

實(shí)施例二：

請(qǐng)參閱圖2-3：一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，包括以下原料：無(wú)機(jī)鹽成分、有機(jī)物成分、氨基酸及氨基酸鹽、能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物、維生素及抗氧化劑、蛋白質(zhì)及多肽、微量元素和顯色物質(zhì)；按上述方法進(jìn)行心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)，其培養(yǎng)流程分為：懸滴培養(yǎng)3天+懸浮培養(yǎng)2天+貼壁培養(yǎng)5天，同時(shí)加入維生素c(每升培養(yǎng)液加入ascorbicacid128.05mg)。

心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)：利用人類多能干細(xì)胞系imr90-1(wicellresearchinstitute,madison,wi,usa)，誘導(dǎo)培養(yǎng)之前先通過(guò)電轉(zhuǎn)染的手段將報(bào)告基因mhc-egfp(肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白表達(dá)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)開始之后，一旦干細(xì)胞向心肌分化，開始表達(dá)心肌特異性的mhc之時(shí)，就會(huì)有綠色熒光出現(xiàn))轉(zhuǎn)染至imr90-1，隨后用不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)(分別為imem+15%sr(invitrogen公司)、imem+15%胎牛血清、本配方培養(yǎng)基（無(wú)血清）、dmem/f12+15%胎牛血清、dmem(高糖)+15%胎牛血清)對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，按照?qǐng)D2標(biāo)示的日程，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，以資對(duì)比不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效能；從對(duì)比結(jié)果顯示，以第3、5、7天細(xì)胞的存活率及第7天生成的心肌細(xì)胞占比為評(píng)價(jià)指標(biāo)(圖3)，可知本培養(yǎng)基優(yōu)于當(dāng)前市場(chǎng)上的同類產(chǎn)品(*p<0.05差異具有顯著性，與其他任一相比)。

實(shí)施例三：

請(qǐng)參閱圖4-5：一種用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，包括以下原料：無(wú)機(jī)鹽成分、有機(jī)物成分、氨基酸及氨基酸鹽、能量物質(zhì)及代謝中間產(chǎn)物、維生素及抗氧化劑、蛋白質(zhì)及多肽、微量元素和顯色物質(zhì)；按上述方法進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)：在配制好的培養(yǎng)基溶液以hs-5細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層，同時(shí)加入nt-3(每升培養(yǎng)基加入nt-31342mg)。

神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)：利用人類多能干細(xì)胞系ips-1(wicellresearchinstitute,madison,wi,usa)，通過(guò)將其與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞系hs-5共培養(yǎng)(圖4)，來(lái)達(dá)到將多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)培養(yǎng)的目的；擬對(duì)比的當(dāng)前市場(chǎng)同類產(chǎn)品有dmem/f12+10%胎牛血清、knockoutdmem+10%sr(invitrogen公司)、neurobasal培養(yǎng)基；按照?qǐng)D4的培養(yǎng)法誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，以細(xì)胞存活率、nestin⁺細(xì)胞(nestin是由神經(jīng)前體細(xì)胞特異性表達(dá)出的一種細(xì)胞表面標(biāo)志物)的占比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，來(lái)對(duì)比不同培養(yǎng)基對(duì)多能干細(xì)胞神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的效能；對(duì)比結(jié)果顯示，盡管在細(xì)胞存活率方面，多種培養(yǎng)基并無(wú)顯著性差異，但就nestin⁺細(xì)胞占比而言，本配方培養(yǎng)基優(yōu)于當(dāng)前市場(chǎng)同類產(chǎn)品(圖5；*p<0.05差異具有顯著性，與其他任一相比)。

綜上所述：本用于人類多潛能干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的配方，其無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品居于國(guó)際先進(jìn)水平，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)高等級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基高端產(chǎn)品的空白，其具備市場(chǎng)大、用途廣等優(yōu)點(diǎn)，所有以細(xì)胞為平臺(tái)生產(chǎn)的疫苗、大分子生物藥物（包括：?jiǎn)慰寺】贵w、重組蛋白藥）都需要使用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，解決了國(guó)內(nèi)進(jìn)口配方成本高的問(wèn)題。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。