本發(fā)明屬于生物制藥工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有抑菌效果的芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株、及其分離方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：條紋斑竹鯊（chiloscylliumplagiosum）屬于軟骨魚綱(chondrichthyes)、須鯊目（orectolformes）須鯊科(orectolebidea)、斑竹鯊屬(chiloscyllium)，是一種小型底棲種類，卵生，主要生活在淺海層多藻類生長(zhǎng)的巖礁環(huán)境中，在我國(guó)的東海、南海均有分布。鯊魚機(jī)體的免疫功能令人矚目，目前的研究主要集中在肝臟功能、養(yǎng)殖生物學(xué)、核型染色體研究等方面。鯊魚胃腸道內(nèi)是一個(gè)精彩的微生物世界，但是目前未見有與其胃腸道微生物相關(guān)的基礎(chǔ)研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明主要是提供一種從條紋斑竹鯊腸道內(nèi)分離得到一株具有抑菌效果的芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）的技術(shù)，該技術(shù)包括對(duì)條紋斑竹鯊腸道的處理、原菌液的獲取、菌群的分離固體培養(yǎng)基。經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)及重復(fù)抑菌實(shí)驗(yàn)證明該菌株具有明顯抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的作用，其有望應(yīng)用于抗菌藥物的制備中，能為海洋抗菌藥物制備提供新的良好的材料來源。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種具有抑菌效果的芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株，其特征在于，分離自條紋斑竹鯊，并于2016年11月24日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為cgmccno.13337。所述芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株的單菌落形態(tài)如圖1所示。所述芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株的分離過程如下：條紋斑竹鯊，來自廣東海域，購(gòu)回后放于遮光水箱內(nèi)暫養(yǎng)數(shù)日后，對(duì)其進(jìn)行手術(shù)取其腸道，75%的酒精擦拭外表面后于紫外超凈臺(tái)內(nèi)解剖其腸道，取出腸道內(nèi)容物及粘膜液，使用生理鹽水稀釋，得到原菌液。以稀釋涂布的方法涂布于海水lb固體培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，海水lb固體培養(yǎng)基成分：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂13g，1000ml人工海水，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，在121℃下滅菌20min，每個(gè)玻璃平板內(nèi)倒入約20ml培養(yǎng)基。人工海水為本實(shí)驗(yàn)室自配，由蒸餾水加適量海鹽溶解的母液配制而成，ph約為7.0。所述芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株的遺傳學(xué)特征：用細(xì)菌基因組試劑盒提取細(xì)菌基因dna后，利用通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，連接質(zhì)粒載體，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，培養(yǎng)后測(cè)序。該菌株的16srdna基因序列為：gacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgta（如圖2所示）。將該序列與genbank中已登錄的部分菌株的16srdna基因序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果表明該菌株屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）。本發(fā)明還提供芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株在制備抗菌藥物中的應(yīng)用；所述抗菌藥物是海洋抗菌藥物。本發(fā)明還提供芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株在抑制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種具有抑菌效果的微生物菌劑，其活性成分包括芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株。本發(fā)明還提供上述微生物菌劑的制備方法，包括芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵步驟。本發(fā)明具有以下顯著創(chuàng)新點(diǎn)和有益效果：（1）材料來源選自淺海層的條紋斑竹鯊，近年來，對(duì)于條紋斑竹鯊肝臟功能、機(jī)體免疫功能的研究有了初步的進(jìn)展，鯊魚腸道內(nèi)微生物世界豐富多彩，功能也將會(huì)呈現(xiàn)多樣化的趨勢(shì)，探索鯊魚機(jī)體免疫功能與腸道微生物的關(guān)聯(lián)性是本發(fā)明的目的，我們也將此作為探索海洋微生物資源的起點(diǎn)；（2）得到的可抑制枯草芽孢桿菌的芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus），具有應(yīng)用于抗菌藥物制備中的潛力，這為研制新一代的海洋抗菌藥物打下了基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1所示的是本發(fā)明的單菌落形態(tài)圖。圖2所示的是本發(fā)明gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）的16srdna序列圖。圖3所示的是本發(fā)明gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）的pcr鑒定電泳圖。圖4所示的是本發(fā)明gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中左上為空白培養(yǎng)基，右下為gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌液，中間為稀釋100倍的氨芐抗生素。具體實(shí)施方式以下是對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的具體描述。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
人員通常理解的相同含義。實(shí)施例一材料和試劑：1.材料、菌種：條紋斑竹鯊來自廣東海域，枯草芽孢桿菌wb800n購(gòu)自德國(guó)mobitecgmbh公司。2.主要試劑：海鹽購(gòu)自仟湖魚業(yè)集團(tuán)；瓊脂粉（agar）購(gòu)自日本biosharp公司；蛋白胨（tryptone）、酵母提取物（yeastextract）購(gòu)自英國(guó)oxoid公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。lb固體培養(yǎng)基：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化鈉，15g瓊脂粉，1l去離子水。lb液體培養(yǎng)基：5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，10g氯化鈉，1l去離子水。1%瓊脂：10g瓊脂，1l去離子水。牛津杯法測(cè)抑菌活性的具體方法和步驟：1.分別接種50μl枯草芽孢桿菌wb800n和芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌液至5mllb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于220rpm，37℃搖床培養(yǎng)12h；2.傾倒1%瓊脂至凝固，待到滅菌過后的lb固體培養(yǎng)基冷卻至40-50℃時(shí)加入1/100wb800n菌液，混勻后倒板，凝固待用；3.將無菌牛津杯燒熱后固定于wb800n平板上，冷卻后，根據(jù)牛津杯容積加滿芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌液（實(shí)驗(yàn)組），陰性對(duì)照加滿的普通lb液體培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照加滿稀釋100倍的氨芐抗生素，于37℃正置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18h，觀察抑菌生長(zhǎng)情況（平皿上方需覆蓋濾紙）。結(jié)論：根據(jù)表1的抑菌圈直徑大小，可知芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）具有明顯的抑菌作用。表1芽孢桿菌gbacillus-9的抑菌試驗(yàn)結(jié)果（n=4）陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照組平均抑菌圈直徑/mm無明顯抑菌圈10.4±2.715.8±1.1實(shí)施例二材料與方法：1.樣品的制備：接種5ml芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）菌液至500mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）種子液；再接種500ml種子液至加有10llb液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，得到gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）發(fā)酵液。2.動(dòng)物：試驗(yàn)組江南某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)保育豬120頭，其中僵豬30頭；對(duì)照組為保育豬122頭，其中僵豬29頭；試驗(yàn)起始前者為35-38日齡，后者為36-38日齡。3.方法：試驗(yàn)組日糧中芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）培養(yǎng)液各1升/噸，試驗(yàn)組不添加。4.判定標(biāo)準(zhǔn)觀察各組整齊度、毛色、糞便量，統(tǒng)計(jì)各組死淘率、日增重、日耗料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.整齊度：試驗(yàn)組原來兩欄30頭僵豬，已與正常豬沒有區(qū)別；對(duì)照組的僵豬仍處于僵豬狀態(tài)。2.毛色：試驗(yàn)組自從飼喂第4天開始，毛色開始發(fā)亮，比對(duì)照組明顯有精神。3.糞便量：試驗(yàn)組糞便減少，氨味減輕。4.死淘率：試驗(yàn)組死亡2頭（由于急性鏈球菌致死），對(duì)照組死亡13頭（包括僵豬5頭）。5.日增重：結(jié)果見附表2，各數(shù)值為平均值。從表2可以看出，飼喂芽孢桿菌gbacillus-9（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicus）的試驗(yàn)組豬的體重增加量顯著高于對(duì)照組；料肉比結(jié)果明顯降低，說明養(yǎng)殖所用飼料成本可明顯降低。表2芽孢桿菌gbacillus-9動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的日增重結(jié)果起始重/kg結(jié)束重/kg增重/kg料肉比實(shí)驗(yàn)組14.536.221.71.99對(duì)照組15.330.214.92.78<110>南京錢塘洪泰生物科技有限公司<120>一種具有抑菌效果的芽孢桿菌gbacillus-9菌株及其分離方法和應(yīng)用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1364<212>dna<213><220><223><400>1seqidno.11gacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaac61ctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaa121ccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgc181attagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagg241gtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtaggg301aatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttc361ggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttg421acggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagg481tggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctg541atgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcag601aagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacacca661gtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcga721acaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggt781ttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgca841agactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat901tcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagatagg961acgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtga1021gatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagtt1081gggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatca1141tcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcga1201aaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaact1261cgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgtt1321cccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgta當(dāng)前第1頁(yè)12