技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種利用枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)n14菌株控制滴灌灌水器堵塞的方法，屬于農(nóng)用微生物菌劑和節(jié)能環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，革蘭氏染色陽性，芽孢中生或近中生，菌落粗糙，能液化明膠，胨化牛奶，還原硝酸鹽，水解淀粉，為典型好氧菌廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動植物的體表，自身沒有致病性?？莶菅挎邨U菌可通過成功定殖于植物根際、體表或體內(nèi)，同病原菌競爭植物周圍的營養(yǎng)、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長，同時誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而具有生防的效果?？莶菅挎邨U菌還能夠產(chǎn)生類似細(xì)胞分裂素、植物生長激素的物質(zhì)，促進(jìn)植物的生長。例如：美國agraquest公司用枯草芽孢桿菌qst713菌株開發(fā)出活菌制劑殺菌劑serenadetm，并于2000年通過美國環(huán)保局(epa)的登記，用于防治多種作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害?？莶菅挎邨U菌mbi600在英國的microbiogroupltd.、日本的idemistukosanco.,ltd.等均已獲得注冊登記，并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，用于防治葉部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)?？莶菅挎邨U菌fzb24在德國、美國等國家進(jìn)行了注冊，并在德國bayer公司投入生產(chǎn)，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麥白粉病，還可作為增產(chǎn)促進(jìn)劑。隨著對枯草芽孢桿菌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品保健、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面具有廣泛應(yīng)用價值。

中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01210328716.5)中公開了一枯草芽孢桿菌t-500菌株，保藏編號為cgmccno.6058，對水稻稻瘟菌、水稻紋枯菌、水稻白葉枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、禾谷鐮刀菌、黃曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表現(xiàn)出較強的抑菌活性，并對其引起的病害有較好的防控作用，發(fā)酵培養(yǎng)基組成包括：碳源(蔗糖或淀粉)、氮源(黃豆粉、豆餅粉、玉米槳中的一種或幾種種混合)、微量元素(牛肉浸出膏、酵母膏或者魚粉中一種或兩種混合)。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01210229066.9)中公開了一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌cx31菌株，保藏編號為cctccno.m2012138，該菌株的培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01110205587.6)中公開了一株內(nèi)生枯草芽孢桿菌，保藏編號為cgmccno.4844，對胡椒瘟病有良好的防治效果，培養(yǎng)該菌株采用的培養(yǎng)基為：pda培養(yǎng)基。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01210215134.6)中公開了一株枯草芽孢桿菌rb菌株，保藏編號為cgmccno.6268，并公開了該菌株在處理污泥、禽畜糞便或作物稿桿中的應(yīng)用，該菌株的培養(yǎng)基采用玉米淀粉、紅糖、麥麩、魚粉、蔗糖和無機鹽來制備。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01210127519.7)中公開了一株枯草芽孢桿菌)kw119菌株，保藏編號為cgmccno.5789，其在雞腸道內(nèi)生境條件下產(chǎn)蛋白酶能力較高，其發(fā)酵培養(yǎng)基主要以豆粕為底物。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01110443948.0)中公開了一株枯草芽孢桿菌ch-001菌株，保藏編號為cctccno.m2011111，它對金黃色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，適用于動物蛋白飼料添加劑，其培養(yǎng)基主要成分為羽毛粉和無機鹽。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?01010129783.5)中公開了一株枯草芽孢桿菌ansb060菌株，保藏編號為cgmccno.3440，并公開了其在動物飼料中的應(yīng)用，其培養(yǎng)基主要成分為蛋白胨、葡萄糖和無機鹽。中國發(fā)明專利(申請?zhí)枺?00410101021.9)中公開了一株枯草芽孢桿菌b115菌株，保藏編號為cgmccno.1210，并公開了其用于制備漁用微生態(tài)水質(zhì)改良劑的方法，其培養(yǎng)基主要成分為豆餅粉、麩皮和玉米粉。

群體感應(yīng)的一個典型行為是生物膜形成。當(dāng)微生物個體達(dá)到一定密度時，群體感應(yīng)信號分子的基因表達(dá)會產(chǎn)生黏液多糖，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性生物膜的形成。較早的細(xì)菌群體感應(yīng)研究文獻(xiàn)集中在病原菌的研究方面，當(dāng)細(xì)菌達(dá)到足夠高的群體密度時，它們就能改變感染所需的基因表達(dá)以誘導(dǎo)大量的細(xì)胞合作進(jìn)行宿主感染，它們也能躲避宿主的免疫反應(yīng)，從而成功建立感染(dangl,etal.,nature.2001.411:826-833)。近年來，在環(huán)境微生物領(lǐng)域也開展了廣泛的研究，比如：在滴灌系統(tǒng)中，灌水器流道內(nèi)就非常容易形成微生物膜而引起堵塞(yan,etal.,journalofenvironmentalsciences,2009,21(6):834-841.)。我們分離出一株高效降解群體感應(yīng)信號分子的枯草芽孢桿菌n14菌株，用于防治灌水器流動內(nèi)微生物膜的形成，從而減緩堵塞發(fā)生，取得了良好的效果。

紅棗加工過程中會產(chǎn)生大量廢水，尤其是蜜棧(亦稱蜜棗)的加工，對紅棗蒸煮和清洗，以及對蜜棗表面糖蜜的清洗產(chǎn)生的廢水中有機物(主要是糖份)濃度非常高，cod濃度在30g/l以上，甚至經(jīng)常超過100g/l。這些高濃度廢水處理達(dá)標(biāo)非常困難，處理成本高昂，如果處理不當(dāng)極易帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染。而這些高濃度廢水中不含重金屬等有毒有害物質(zhì)，因此開發(fā)資源化利用技術(shù)是處理此類廢水的合理途徑。本發(fā)明利用此類廢水培養(yǎng)枯草芽孢桿菌n14菌株，獲得了較高的活菌數(shù)產(chǎn)率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)n14菌株控制滴灌灌水器堵塞的方法，并提供一種能夠資源化利用高濃度紅棗加工廢水培養(yǎng)該菌株的方法。

本發(fā)明所使用的菌株是由發(fā)明人從松樹的葉片上分離篩選出來的一株具有高效降解信號分子能力的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)n14菌株，該菌株于2009年11月02日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：cgmccno.3374，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。

本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法和菌劑制備過程如下：

1、紅棗加工廢水預(yù)處理及培養(yǎng)基的配制：將cod濃度大于10g/l的高濃度紅棗加工廢水的cod濃度調(diào)節(jié)為10～80g/l，再按照重量比加入0.1％～0.5％的硫酸銨和0.05％～0.2％的磷酸氫二鈉，于100～115℃加熱3～15分鐘，再用生物質(zhì)熱電廠的草木灰飽和水溶液調(diào)節(jié)ph到7.0～8.0，得到液體培養(yǎng)基。

2、液體種子制備：向裝有步驟1得到的液體培養(yǎng)基的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于50～55℃，120～200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)20～36小時，得到枯草芽孢桿菌液體種子。

3、液態(tài)發(fā)酵：分別向裝有步驟1得到的液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種體積比為2％～10％的第2步得到的液體種子，于50～55℃，通無菌空氣培養(yǎng)12～30小時；將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計數(shù)，活菌數(shù)都達(dá)到3×10⁹cfu/毫升以上。

4、液體菌劑制備：向第3步得到的發(fā)酵液中按照重量比加入0.3％～5％的甘油，得到液體菌劑，0～6℃低溫保存。

本發(fā)明所得菌劑用于防控滴灌灌水器堵塞的方法如下：

1、在滴灌系統(tǒng)的灌溉用水中按照體積比為0.01％～0.1％加入枯草芽孢桿菌液體菌劑，使水中的枯草芽孢桿菌濃度為3×10⁵cfu/毫升～3×10⁶cfu/毫升，用于正常滴灌，可降低灌水器堵塞發(fā)生概率。

2、對于滴灌系統(tǒng)流量已經(jīng)明顯下降的灌水器，即發(fā)生堵塞的灌水器，在灌溉用水中按照體積比為0.1％～0.5％加入枯草芽孢桿菌液體菌劑；將滴灌管浸入裝有菌液的水槽中，確保灌水器完全被浸沒；用抽吸泵連接滴灌管抽水，反沖洗灌水器；采用間歇式反沖洗方式，抽吸1-10分鐘，停止抽吸浸泡15-30分鐘，抽吸-浸泡交替進(jìn)行，直至滴灌流量恢復(fù)正常。

具體實施方式：

由本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌能夠高效降解群體感應(yīng)信號分子，并且能促進(jìn)植物生長，改善農(nóng)作物品質(zhì)。具體實施方式如下：

實施例1：枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)和菌劑制備

(1)紅棗加工廢水預(yù)處理及培養(yǎng)基的配制：將cod濃度大于10g/l的高濃度紅棗加工廢水的cod濃度調(diào)節(jié)為50g/l，再按照重量比加入0.3％的硫酸銨和0.1％的磷酸氫二鈉，于100℃加熱5分鐘，再用生物質(zhì)熱電廠的草木灰飽和水溶液調(diào)節(jié)ph到7.5，得到液體培養(yǎng)基。

(2)液體種子制備：向裝有步驟1得到的液體培養(yǎng)基的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于50～55℃，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24小時，得到枯草芽孢桿菌液體種子。

(3)液態(tài)發(fā)酵：分別向裝有步驟1得到的液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種體積比為5％的第2步得到的液體種子，于50～55℃，通無菌空氣培養(yǎng)30小時；將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計數(shù)，活菌數(shù)都達(dá)到3×10⁹cfu/毫升以上。

(4)液體菌劑制備：向第3步得到的發(fā)酵液中按照重量比加入1％的甘油，得到液體菌劑，0～6℃低溫保存。

實施例2：枯草芽孢桿菌微生物菌劑應(yīng)用于預(yù)防滴灌灌水器堵塞

滴灌系統(tǒng)采用城市生活污水處理廠的二級出水，通過高5米的自動水位控制水箱(水位波動在20厘米以內(nèi))向滴灌系統(tǒng)供水，并在系統(tǒng)的入口加設(shè)120目篩網(wǎng)式過濾器、流量表、閥門等控制和測量設(shè)備。設(shè)置3套滴灌系統(tǒng)，第一套滴管系統(tǒng)只用二級出水；第二套系統(tǒng)的二級出水中加入枯草芽孢桿菌菌劑，使水中的枯草芽孢桿菌濃度為3×10⁵cfu/毫升；第三套系統(tǒng)的二級出水中加入枯草芽孢桿菌菌劑，使水中的枯草芽孢桿菌濃度為1×10⁶cfu/毫升。三套系統(tǒng)同時運行，5個月后，第一套系統(tǒng)灌水器堵塞率達(dá)到38％，第二套系統(tǒng)灌水器堵塞率為25％，第三套系統(tǒng)灌水器堵塞率為17％。結(jié)果表明，灌溉用水中加入菌劑可以顯著降低滴管系統(tǒng)灌水器的堵塞率。

用以上3組滴灌系統(tǒng)進(jìn)行滴灌小油菜，結(jié)果表明，添加菌劑灌溉的小油菜生物量明顯大于不添加菌劑的小油菜，表明菌劑提高了小油菜的產(chǎn)量；添加菌劑灌溉的小油菜硝酸鹽含量明顯小于不添加菌劑的小油菜，表明菌劑提高了小油菜的品質(zhì)。

實施例3：枯草芽孢桿菌微生物菌劑應(yīng)用于恢復(fù)已堵塞的滴灌灌水器流量

對于滴灌系統(tǒng)流量已經(jīng)下降了40％的灌水器，在灌溉用水中按照體積比為0.2％加入枯草芽孢桿菌液體菌劑；將滴灌管浸入裝有0.2％菌液的水槽中，確保灌水器完全被浸沒；用抽吸泵連接滴灌管抽水，反沖洗灌水器；采用間歇式反沖洗方式，抽吸2分鐘，停止抽吸浸泡20分鐘，抽吸-浸泡交替進(jìn)行7-10次，滴灌流量可恢復(fù)到起始流量的85％以上。