本發(fā)明涉及海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是涉及一種海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物工程技術(shù)中的重要技術(shù)與常用方法之一，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞代謝、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞環(huán)境應(yīng)急與免疫機(jī)制、藥物篩選與生物藥物表達(dá)生產(chǎn)等研究領(lǐng)域。在植物、哺乳動(dòng)物、魚(yú)類和昆蟲(chóng)的研究中，細(xì)胞與組織培養(yǎng)已經(jīng)成為不可或缺的研究手段，特別是在相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞環(huán)境應(yīng)激機(jī)制、以及遺傳與突變研究等方面，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為無(wú)法替代的手段，也是促進(jìn)現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展的重要技術(shù)。但是，在海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，因?yàn)楹Ｑ筌涹w動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)、功能分化、結(jié)構(gòu)與營(yíng)養(yǎng)需求等方面的特殊性，至今仍然沒(méi)有建立起永生細(xì)胞系，原代細(xì)胞培養(yǎng)仍然是主要依托的方法([1]villenaaj.revfishbiolfish,2003,13:111；[2]李建軍，黃寶玉.海洋通報(bào),2015(3):247-251)。然而，即使是原代細(xì)胞培養(yǎng)，目前可選擇用于海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)的試劑盒相關(guān)產(chǎn)品依然十分有限，嚴(yán)重影響了海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞學(xué)相關(guān)研究與應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展。

軟體動(dòng)物因?yàn)閼?yīng)用廣泛，其細(xì)胞培養(yǎng)研究是無(wú)脊椎動(dòng)物中開(kāi)展的最早最廣泛的，培養(yǎng)對(duì)象包括一些養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)貝類，組織細(xì)胞包括胚胎、鰓、外套膜、血細(xì)胞和心肌等多種組織來(lái)源。在20世紀(jì)70年代，hansen等([3]rinkevichb.jbiotechnol,1999,70:133)從淡水蝸牛成功建立了胚胎細(xì)胞系bge，這也是水生無(wú)脊椎動(dòng)物中唯一細(xì)胞系。但是，幾十年過(guò)去了，海洋軟體動(dòng)物至今還沒(méi)有成功建立一個(gè)細(xì)胞系，其細(xì)胞培養(yǎng)遭遇長(zhǎng)期的失敗，大部分細(xì)胞培養(yǎng)的嘗試，通常在體外只能培養(yǎng)比較短的時(shí)間，同時(shí)微生物污染一直威脅著原代細(xì)胞培養(yǎng)，也是最終培養(yǎng)失敗的主要原因之一。

至今，海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要集中在原代細(xì)胞培養(yǎng)條件的改進(jìn)方面，特別是培養(yǎng)基的優(yōu)化。相對(duì)較為成功的例子包括，merwe等([4]vandermerwem，auzoux-bordenaves，nieslerc.cytotechnology，2010，62(3):265－277.)報(bào)道成果原代培養(yǎng)了鮑外套膜血淋巴等組織細(xì)胞。odintsova等([5]odintsovana，dyachukva，nezlinlp.cellandtissueresearch，2010，339(3):625-637)報(bào)道將mytilustrossulus的幼體細(xì)胞原代培養(yǎng)了70多天。

目前，研究人員普遍認(rèn)識(shí)到海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求和生長(zhǎng)條件與脊椎動(dòng)物差異顯著。海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化多集中改善原代細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)因子與細(xì)胞生長(zhǎng)因子。l15基礎(chǔ)培養(yǎng)基是公認(rèn)的相對(duì)比較適合軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胎牛血清也普遍被用于海洋軟體動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)，小牛血清或者待培養(yǎng)動(dòng)物的組織提取液或血淋巴液也被報(bào)道能促進(jìn)原代細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂，他們的使用量大多控制在5-20％([6]chensnetal.methodscellsci,1999,21:183)。

雖然研究者們對(duì)海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)展了大量探索性的研究工作，但是目前仍然沒(méi)有適用于海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的普適性方法、培養(yǎng)基以及試劑盒，海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工作進(jìn)展十分緩慢。多種海洋軟體動(dòng)物是我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖種類，具有重要的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有些還有很好的藥用價(jià)值，在基礎(chǔ)海洋水產(chǎn)生物的研究中也具有重要地位。因此，海洋軟體動(dòng)物的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因功能學(xué)、育種學(xué)等各領(lǐng)域的研究方興未艾，非常需要穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)體系提供不可或缺的研究手段，在缺乏細(xì)胞系的情況下，發(fā)明可用于快速建立海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞分離與原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法和相應(yīng)的快捷試劑盒，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒及其用途，

所述海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒設(shè)有包裝盒、洗液i瓶、洗液ii瓶、洗液iii瓶、溶液a瓶、溶液b瓶、溶液c瓶、使用說(shuō)明書(shū)；

所述洗液i瓶、洗液ii瓶、洗液iii瓶、溶液a瓶、溶液b瓶、溶液c瓶、使用說(shuō)明書(shū)設(shè)在包裝盒內(nèi)；

所述洗液i瓶?jī)?nèi)裝有洗液i，所述洗液i含有100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml慶大霉素的無(wú)菌濾過(guò)海水；

所述洗液ii瓶?jī)?nèi)裝有洗液ii，所述洗液ii含有200μg/ml氨芐青霉素、200μg/ml鏈霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml慶大霉素的無(wú)菌濾過(guò)海水；

所述洗液iii瓶?jī)?nèi)裝有洗液iii，所述洗液iii用無(wú)菌超純水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化鈉、3.36g/ledta-2na、8g/l枸鹽酸鈉ph＝7.25的與海水等滲的螯合緩沖液；

所述溶液a瓶?jī)?nèi)裝有溶液a，所述溶液a是用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓摩爾濃度為1000mosmol/kg的胰蛋白酶消化液；

所述溶液b瓶?jī)?nèi)裝有溶液b，所述溶液b是在l-15細(xì)胞培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、鏈霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、慶大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化鈉20.2g/l、氯化鉀0.54g/l、氯化鎂3.9g/l、氯化鈣0.6g/l、硫酸鎂1g/l、人重組表皮生長(zhǎng)因子10ng/ml、海綿吡咯醛烷烴100ng/ml、谷氨酰胺2mmol/l；

所述溶液c瓶?jī)?nèi)裝有溶液c，所述溶液c是含透析fbs與透析血淋巴液體積比為2︰1的血清系統(tǒng)。

所述洗液i最好分裝入3瓶100ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

所述洗液ii最好分裝入3支100ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

所述洗液iii最好分裝入50ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

所述溶液a最好分裝入15ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

所述溶液b最好分裝入50ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

所述溶液c最好分裝入10ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

所述海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒可在多種海洋軟體動(dòng)物多種體細(xì)胞的無(wú)菌分離與體外原代培養(yǎng)中應(yīng)用，所述多種海洋軟體動(dòng)物多種體細(xì)胞包括牡蠣、鮑、文蛤、扇貝、貽貝等軟體動(dòng)物的鰓、外套膜、肌肉、血淋巴等多種組織細(xì)胞。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了適合海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)適合條件，解決了現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞快速分離與原代細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)體系快速建立的問(wèn)題，建立海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞快速分離與原代細(xì)胞無(wú)菌方法，給出海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒。

本發(fā)明的有益效果：使用本發(fā)明可以快速簡(jiǎn)便地將海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行體外分離制備與培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞存活率高，受微生物污染率低，細(xì)胞可傳代和繼代培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)20～90天。本發(fā)明的主要技術(shù)原理是通過(guò)使用含有多種廣譜抗生素聯(lián)用的無(wú)菌濾過(guò)海水經(jīng)8次短(30s)時(shí)間劇烈震蕩，對(duì)海洋軟體動(dòng)物組織進(jìn)行清洗即可除去幾乎所有附著于組織上的微生物，大大減少微生物污染的概率；海水等滲的金屬離子螯合緩沖液和與海水等滲的胰蛋白酶消化液，都能夠保證在分離培養(yǎng)過(guò)程中，使海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞處于穩(wěn)定性滲透壓環(huán)境中；添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子及與細(xì)胞相近滲透壓和ph的細(xì)胞培養(yǎng)液為細(xì)胞提供了合適的生長(zhǎng)條件，且培養(yǎng)過(guò)程僅用少量無(wú)菌離心管、無(wú)菌濾紙等常用耗材，使得細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)易準(zhǔn)備，使原本復(fù)雜的原代細(xì)胞制備和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，變得非常簡(jiǎn)便，同時(shí)還能保障原代細(xì)胞的高活性和低污染率。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明中試劑盒包裝與內(nèi)含物示意圖。

圖2是用本發(fā)明制備的牡蠣鰓細(xì)胞體外原代培養(yǎng)1-7天細(xì)胞密度變化顯微圖。

圖3是使用本發(fā)明制備的牡蠣鰓細(xì)胞體外原代培養(yǎng)1-7天細(xì)胞密度變化趨勢(shì)圖。

圖4是用本發(fā)明分離牡蠣鰓細(xì)胞體外原代培養(yǎng)傳代21天細(xì)胞活力變化趨勢(shì)圖。

圖5是使用本發(fā)明分離雜色鮑鰓細(xì)胞體外連續(xù)原代培養(yǎng)30天細(xì)胞狀態(tài)顯微圖(100×)。在圖5中，a為剛分離并濾過(guò)的細(xì)胞；b為培養(yǎng)3天的細(xì)胞；c為培養(yǎng)6天的細(xì)胞；d為培養(yǎng)9天的細(xì)胞；e為培養(yǎng)15天的細(xì)胞；f為培養(yǎng)25天的細(xì)胞；g為培養(yǎng)30天的細(xì)胞。

圖6是使用本發(fā)明進(jìn)行雜色鮑外套膜原代培養(yǎng)8天后產(chǎn)生的貼壁細(xì)胞克隆(200×)。

圖7是使用本發(fā)明制備的雜色鮑細(xì)胞體外原代培養(yǎng)培養(yǎng)20天后,用75％乙醇固定，pi染色，流式細(xì)胞儀分析其前散和側(cè)散熒光比例,對(duì)細(xì)胞類群進(jìn)行分類。

圖8是使用本發(fā)明制備的使用本發(fā)明制備的雜色鮑細(xì)胞體外原代培養(yǎng)20天細(xì)胞類群分布與數(shù)量的流式分析。

圖9是使用本發(fā)明制備的雜色鮑細(xì)胞體外原代培養(yǎng)20天細(xì)胞類群周期分布的流式分析。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。

參見(jiàn)圖1，所述海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒實(shí)施例設(shè)有包裝盒1、3支洗液i瓶2、3支洗液ii瓶3、3支洗液iii瓶4、1支溶液a瓶5、1支溶液b瓶6、1支溶液c瓶7、使用說(shuō)明書(shū)8。

所述、3支洗液i瓶2、3支洗液ii瓶3、3支洗液iii瓶4、1支溶液a瓶5、1支溶液b瓶6、1支溶液c瓶7、使用說(shuō)明書(shū)8設(shè)在包裝盒1內(nèi)。

所述洗液i瓶?jī)?nèi)裝有洗液i，所述洗液i含有100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml慶大霉素的無(wú)菌濾過(guò)海水；

所述洗液ii瓶?jī)?nèi)裝有洗液ii，所述洗液ii含有200μg/ml氨芐青霉素、200μg/ml鏈霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml慶大霉素的無(wú)菌濾過(guò)海水；

所述洗液iii瓶?jī)?nèi)裝有洗液iii，所述洗液iii用無(wú)菌超純水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化鈉、3.36g/ledta-2na、8g/l枸鹽酸鈉ph＝7.25的與海水等滲的螯合緩沖液；

所述溶液a瓶?jī)?nèi)裝有溶液a，所述溶液a是用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓摩爾濃度為1000mosmol/kg的胰蛋白酶消化液；

所述溶液b瓶?jī)?nèi)裝有溶液b，所述溶液b是在l-15細(xì)胞培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、鏈霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、慶大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化鈉20.2g/l、氯化鉀0.54g/l、氯化鎂3.9g/l、氯化鈣0.6g/l、硫酸鎂1g/l、人重組表皮生長(zhǎng)因子10ng/ml、海綿吡咯醛烷烴100ng/ml、谷氨酰胺2mmol/l；

所述溶液c瓶?jī)?nèi)裝有溶液c，所述溶液c是含透析fbs與透析血淋巴液體積比為2︰1的血清系統(tǒng)。

以下給出具體實(shí)施例。

實(shí)施例1

所述海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒由包裝盒、3支100ml洗液i、3支100ml洗液ii、50ml洗液iii、15ml溶液a、50ml溶液b、10ml溶液c、使用說(shuō)明書(shū)組成。

其中其中洗液i是含有100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml慶大霉素的無(wú)菌濾過(guò)海水，分裝入3支100ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

洗液ii是含有200μg/ml氨芐青霉素、200μg/ml鏈霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml慶大霉素的無(wú)菌濾過(guò)海水,分裝入3支100ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

洗液iii是用無(wú)菌超純水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化鈉、3.36g/ledta-2na、8g/l枸鹽酸鈉ph＝7.25的與海水等滲的螯合緩沖液，分裝入50ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

溶液a是用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓為1200mosmol/kg的胰蛋白酶消化液,分裝入15ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

溶液b是在l-15細(xì)胞培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、鏈霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、慶大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化鈉20.2g/l、氯化鉀0.54g/l、氯化鎂3.9g/l、氯化鈣0.6g/l、硫酸鎂1g/l、人重組表皮生長(zhǎng)因子10ng/ml、吡咯醛烷烴10ng/ml、2mmol/l谷氨酰胺，分裝入50ml無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

溶液c是含透析fbs與透析血淋巴液比例為2:1的血清系統(tǒng)，分裝入10無(wú)菌密封瓶，貼上標(biāo)簽，-20～4℃保存。

需自準(zhǔn)備材料：無(wú)菌50ml塑料清洗管6支、無(wú)菌15ml離心管2支)、直徑35/60mm無(wú)菌培養(yǎng)板1個(gè)，無(wú)菌鑷子和眼科剪各2把、20cm無(wú)菌鑷子1把，0.1/1ml移液槍及滅菌槍頭一套，50ml無(wú)菌試管、75％消毒酒精適量，15ml、50ml離心管架各一個(gè)，小型臺(tái)式渦旋震蕩器一臺(tái)。

實(shí)施例2

先在6支50ml無(wú)菌離心管中分別倒入洗液i和洗液ii15ml各3支，再將洗液iii倒入另外兩支15ml無(wú)菌離心管各5ml，將其按從洗液i到洗液iii的順序編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8，并立刻蓋上蓋子。

使用無(wú)菌眼科手術(shù)剪和鑷子從軟體動(dòng)物上取下較為潔凈的組織塊約200mg，剪成1cm2大小，小心放入含10ml洗液i的無(wú)菌試管中，充分渦旋震蕩清洗30s，重復(fù)3次。

小心取出組織塊，放入含10ml洗液ii的無(wú)菌試管中，充分渦旋震蕩清洗30s，重復(fù)3次。

小心取出組織塊，夾入含5ml洗液iii的15ml無(wú)菌試管中，充分渦旋震蕩清洗10s，重復(fù)2次。

取出組織塊放入無(wú)菌消化盤(pán)中，用無(wú)菌眼科手術(shù)剪將組織塊盡量剪碎，加入1.5ml酶解液，在消化時(shí)使用1ml移液器(移液槍頭剪去尖端)反復(fù)吸打，約5～8min后，組織塊消化完全，消化液無(wú)明顯大顆粒即可。

消化液中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液5400μl，血清系統(tǒng)600μl，用移液器吸打混勻。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)以上細(xì)胞混懸液用溶液c或培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，分盤(pán)培養(yǎng)，或進(jìn)行過(guò)濾、計(jì)數(shù)等實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例3

取牡蠣組織標(biāo)本，操作步驟同實(shí)施例2，最終獲得懸浮圓球狀牡蠣鰓細(xì)胞。其連續(xù)原代培養(yǎng)、繼代、傳代21天的細(xì)胞密度、細(xì)胞活性變化趨勢(shì)、以及細(xì)胞顯微圖請(qǐng)見(jiàn)圖2～4。

利用本發(fā)明分離雜色鮑鰓細(xì)胞體外連續(xù)原代培養(yǎng)30天細(xì)胞活性變化如表1所示。

表1

使用本發(fā)明分離雜色鮑鰓細(xì)胞體外連續(xù)原代培養(yǎng)30天細(xì)胞狀態(tài)顯微圖(100×)參見(jiàn)圖5，使用本發(fā)明進(jìn)行雜色鮑外套膜原代培養(yǎng)8天后產(chǎn)生的貼壁細(xì)胞克隆(200×)參見(jiàn)圖6。

使用本發(fā)明制備的雜色鮑細(xì)胞體外原代培養(yǎng)培養(yǎng)20天后,用75％乙醇固定，pi染色，流式細(xì)胞儀分析其前散和側(cè)散熒光比例,對(duì)細(xì)胞類群進(jìn)行分類參見(jiàn)圖7，細(xì)胞經(jīng)75％乙醇固定過(guò)夜，pi染色30min，rna酶處理30min，流式細(xì)胞儀分析前散熒光(反應(yīng)細(xì)胞大小)和側(cè)散熒光(反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)含顆粒大小與數(shù)量)比例,據(jù)此對(duì)細(xì)胞類群進(jìn)行分類分析，表明培養(yǎng)的細(xì)胞屬于同一類群，同時(shí)有少量聚集和細(xì)胞碎片產(chǎn)生。

使用本發(fā)明制備的使用本發(fā)明制備的雜色鮑細(xì)胞體外原代培養(yǎng)20天細(xì)胞類群分布與數(shù)量的流式分析參見(jiàn)圖8，細(xì)胞經(jīng)75％乙醇固定過(guò)夜，pi染色30min，rna酶處理30min，流式細(xì)胞儀分析，fl3通道采集pi熒光信號(hào)強(qiáng)度，分析細(xì)胞染色體倍性，表明體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有不同的染色體倍數(shù)，處于不同的細(xì)胞周期(粉紅色為分裂后的單倍體細(xì)胞，綠色為處于染色體復(fù)制過(guò)程中的細(xì)胞，尚未到藍(lán)色所表示的染色體復(fù)制完成的二倍體階段，黃色可能為二聚體細(xì)胞)。據(jù)此進(jìn)一步表明培養(yǎng)的細(xì)胞屬于同一類群，而且都在增殖生長(zhǎng)中，保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

使用本發(fā)明制備的雜色鮑細(xì)胞體外原代培養(yǎng)20天細(xì)胞類群周期分布的流式分析參見(jiàn)圖9，細(xì)胞經(jīng)75％乙醇固定過(guò)夜，pi染色30min，rna酶處理30min，流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞大部分處于g0g1期，部分處于亞g1期，并有少量細(xì)胞碎片，s期和m期的細(xì)胞較少，表明培養(yǎng)的細(xì)胞處于同一類群，同時(shí)生長(zhǎng)節(jié)奏較為一致。

本發(fā)明克服了當(dāng)前海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞制備培養(yǎng)過(guò)程費(fèi)時(shí)、活性低、易污染的問(wèn)題。本發(fā)明的海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒操作簡(jiǎn)便，在短時(shí)間內(nèi)(30min)即可完成海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞的分離制備與體外培養(yǎng)，極大程度地提高了原代細(xì)胞培養(yǎng)的存活率，受微生物污染的概率低，建立原代細(xì)胞培養(yǎng)體系成功率高。海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)試劑盒適用于多種海洋軟體動(dòng)物多種體細(xì)胞的培養(yǎng)，包括牡蠣、鮑、文蛤、扇貝、貽貝等軟體動(dòng)物的鰓、外套膜、肌肉、血淋巴等多種組織細(xì)胞的無(wú)菌分離與體外原代培養(yǎng)。