本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠腦垂體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

腦垂體(pituitarygland)又名腦下腺，是內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，位于間腦腹面，視交叉后方，與丘腦下部相連。垂體是生物體內(nèi)最重要的內(nèi)分泌腺。垂體前葉由促甲狀腺激素細(xì)胞、促性腺激素細(xì)胞、生長激素細(xì)胞等多種細(xì)胞構(gòu)成。垂體受下丘腦和靶器官激素的雙重調(diào)節(jié)，它在機體新陳代謝，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，機體的生長發(fā)育等方面均具有重要作用。體外培養(yǎng)垂體細(xì)胞可以被用于研究刺激促黃體素(luteinizinghormone，lh)合成和分泌機理，促卵泡素(folliclestimulatinghormone，fsh)的分泌調(diào)節(jié)。目前國內(nèi)外對于大鼠腦垂體細(xì)胞的分離與培養(yǎng)的研究較少，分離方法不成熟，獲得的細(xì)胞純度低，數(shù)量少。本發(fā)明旨在提供一種操作簡單、高效的獲得生長狀態(tài)好、純度高的大鼠腦垂體細(xì)胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠腦垂體細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)上述問題，本發(fā)明提供了一種大鼠腦垂體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，該方法操作簡單，細(xì)胞產(chǎn)量和成活率高，是一種較為理想的大鼠腦垂體細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。可以滿足多種生理生化實驗的要求。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括如下步驟：

(1)選取8d的雄性sd大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉；

(2)將大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常規(guī)消毒，用眼科剪剪去大鼠頸部被毛，無菌條件下十字切口，取出大鼠腦垂體，將腦垂體放入預(yù)冷無菌含雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)pbs液(濃度為0.008～0.015m，ph為7.2～7.4)中洗滌數(shù)次除去血漬，去除垂體包膜；

(3)無菌條件下，在預(yù)冷的pbs(濃度為0.008～0.015m，ph為7.2～7.4)中用眼科剪將腦垂體組織剪成1mm×1mm的碎塊；

(4)用37℃預(yù)熱的iii型膠原酶結(jié)合中性酶混合消化；

(5)用含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、4～6μg/ml胰島素的dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基(簡稱混合培養(yǎng)基)終止消化，用吸管吹打重懸，收集腦垂體細(xì)胞懸液用300～500鉬網(wǎng)篩過濾，所得濾液80～150g離心6分鐘，去掉上清液，保留沉淀(腦垂體細(xì)胞在沉淀中)，加入15ml的混合培養(yǎng)基并用吸管吹打重懸，重復(fù)上述操作3次；

(6)在細(xì)胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片，用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞懸液，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被細(xì)胞懸液充滿為止，置于顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)(四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10⁴)。計數(shù)完成后再加入培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至1×10⁵個/ml，接種至鋪多聚賴氨酸包被的的24孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)，5h后貼壁，2d后換體積分?jǐn)?shù)為5％大鼠血清dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)，4d后換體積分?jǐn)?shù)2.5％大鼠血清dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)，5d后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。每24h觀察細(xì)胞的生長狀況及形態(tài)變化；

(7)將培養(yǎng)7d的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化3～6分鐘后再300～500鉬篩網(wǎng)純化，300～400g離心5分鐘棄上清，所得細(xì)胞沉淀用dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基重懸后接種于處理后的培養(yǎng)板中；

(8)體外培養(yǎng)4～5d，細(xì)胞免疫熒光鑒定。

其中，步驟(1)所選的大鼠體重150±10g，8d雄性大鼠。

其中，步驟(2)所述的pbs已4℃預(yù)冷，pbs濃度為0.01m，ph為7.2～7.4；培養(yǎng)皿置于冰上。

其中，步驟(4)所述消化溫度為37℃，消化過夜(16h)，消化酶混合液由1.0～2.0g/l的iii型膠原酶和1.0～2.0g/l的中性酶混合并且攪勻后制得，所述兩種酶混合比例1∶1～1∶1.5。

其中，步驟(5)所述培養(yǎng)基為dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基，含10％大鼠血清，含100u/ml的青霉素、100u/ml的鏈霉素的雙抗，5μg/ml的胰島素。

其中，步驟(5)所述所得腦垂體細(xì)胞懸液用400鉬網(wǎng)篩過濾，所得濾液100g離心6分鐘。

其中，步驟(7)所述細(xì)胞的純化方法為將培養(yǎng)7d的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化4分鐘后再次400鉬篩網(wǎng)純化，350g離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基重懸后接種于處理后的培養(yǎng)板中。

本發(fā)明建立了一種簡單、高效的分離培養(yǎng)大鼠腦垂體細(xì)胞的方法，所得細(xì)胞數(shù)量多、純度高、活性好，細(xì)胞成活率達95％以上，細(xì)胞純度達96％以上；采用sd大鼠為材料，來源廣泛；采用膠原酶和中性酶聯(lián)合消化方法，克服了垂體分離困難的難題，減少了細(xì)胞損傷，所得細(xì)胞懸液粘度小、易過濾，并且細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞存活率高；本發(fā)明采用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板，細(xì)胞生長狀態(tài)好，可滿足腦垂體細(xì)胞實驗的要求，多聚賴氨酸包被比apes包被制作更簡單，更易保存；本方法經(jīng)濟實用，簡便易行，有利于建立體外實驗?zāi)Ｐ图?xì)胞，研究垂體細(xì)胞的分泌特性，用于研究藥物、促激素等對垂體激素合成與釋放的調(diào)節(jié)作用。以及靶器官激素對垂體的反饋調(diào)控機理研究。

附圖說明

圖1培養(yǎng)7d的大鼠腦垂體細(xì)胞圖片(100×)

圖2培養(yǎng)7d的大鼠腦垂體細(xì)胞圖片(200×)

圖3培養(yǎng)7d大鼠腦垂體細(xì)胞免疫熒光圖片(100×)

圖4培養(yǎng)7d大鼠腦垂體細(xì)胞免疫熒光圖片(200×)

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不限于下述實施例。

本實驗所用的實驗儀器與試劑如下：

外科手術(shù)器械一套，低溫離心機(td24b-ws，上海)，電子分析天平(sartorius，美國)，超凈工作臺(hj-cj-1d，上海)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(sanyomco-17ai，日本)，血細(xì)胞計數(shù)板(25×16，上海)。

dmem/f12(1∶1)購于corning公司，青霉素-鏈霉素雙抗于gibco購買，大鼠血清購買于bioind公司，pbs自制(8.0gnal、0.2gkcl、0.2gkh2po4、1.44gna2hpo4溶于1000ml去離子水中，調(diào)整ph為7.2～7.4，非特殊指出，本專利所用的pbs皆為此配方)，胰酶購買于bioind公司，iii型膠原酶購買于德國serva公司，nephrin抗體。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括如下步驟：

(1)選取體重150±10g，8d雄性sd大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉；

(2)將大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常規(guī)消毒，用眼科剪剪去大鼠頸部被毛，無菌條件下十字切口，取出大鼠腦垂體，將腦垂體放入預(yù)冷無菌含雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)的pbs(濃度為0.01m，ph為7.2～7.4)液中洗滌數(shù)次除去血漬，去除垂體包膜；

(3)無菌條件下，在預(yù)冷的pbs(濃度為0.01m，ph為7.2～7.4)中用眼科剪將腦垂體組織剪成1mm×1mm的碎塊；

(4)用37℃預(yù)熱的iii型膠原酶結(jié)合中性酶混合消化，消化過夜(16h)，所述消化酶溶液由1.5g/l的iii型膠原酶和1.5g/l的中性酶(1∶1.2)混合并且攪勻后制得；

5)用含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、5μg/ml胰島素的dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基(簡稱混合培養(yǎng)基)終止消化，用吸管反復(fù)吹打，收集腦垂體細(xì)胞懸液用400鉬網(wǎng)篩過濾，所得濾液100g離心6分鐘，去掉上清液，所得細(xì)胞沉淀加入15ml培養(yǎng)基并用吸管吹打重懸，100g離心6分鐘，重復(fù)上述操作3次；

(6)在細(xì)胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片，用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止，置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)(四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10⁴)。對于壓線的細(xì)胞只計數(shù)在上線和左線者，對于細(xì)胞團按單個細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)完成后再加入培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至1×10⁵個/ml，接種至鋪3-4μg/cm²多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)版中，置于37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)，5h后貼壁，2d后換體積分?jǐn)?shù)為5％大鼠血清dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)，4d后換體積分?jǐn)?shù)2.5％大鼠血清dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)，5d后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。每24h觀察細(xì)胞的生長狀況及形態(tài)變化；

(7)將培養(yǎng)7d的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化4分鐘后再次400鉬篩網(wǎng)純化，350g離心5分鐘，棄上清，所得細(xì)胞沉淀用dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基重懸后接種于處理后的培養(yǎng)板中；

(8)細(xì)胞免疫熒光鑒定：將大鼠腦垂體細(xì)胞的懸液滴在涂有多聚賴氨酸的24孔板的玻片上，體外培養(yǎng)4～5d，取出玻片，用pbs沖洗3次，每次3min。用zamboni液體固定；4％多聚甲醛固定20～30min，pbs洗3次，每次10min，0.2％滲透液triton-100室溫(15-25℃)下孵育10min，pbs洗3次，每次10min，5％bsa室溫封閉1h，吸去封閉液。加入nephrin抗體(用1％bsa稀釋)于冰箱4℃過夜孵育，pbs洗3次。滴加羊抗鼠pe熒光二抗igg(用1％bsa稀釋)，在室溫下置于濕盒內(nèi)孵育45min，pbs洗3次，自然晾干后在顯微鏡下觀察。

本發(fā)明所得到的大鼠腦垂體細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞成活率達95％以上，細(xì)胞純度達96％以上。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此實施實例。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)作出任何修改，等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。