本發(fā)明涉及肺臟干細(xì)胞分離和移植技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于分離獲得肺臟干細(xì)胞的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

隨著空氣污染的增加及病毒感染等其他一些因素，肺部的一些疾病如肺纖維化，慢性阻塞性肺病等越來越多的影響了人類的健康，甚至生存。對(duì)于這些疾病的治療，目前最有效的治療方法是肺臟移植。但是由于可用的供體有限，異體之間的免疫排斥等現(xiàn)實(shí)原因，能夠接受肺臟移植治療的病人數(shù)量非常稀少。除去肺臟移植，目前還沒有有效的治療手段。

肺臟干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，其在細(xì)胞移植治療中具有器官的靶向性，再生能力強(qiáng)，無成瘤性，可用于自體干細(xì)胞移植治療，免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)小，具有很強(qiáng)的可操作性。并且，目前已有研究發(fā)現(xiàn)，將遠(yuǎn)端氣管中的肺臟干細(xì)胞分離出來，然后在體外大量擴(kuò)增后移植到免疫缺陷的肺部損傷的小鼠中，移植的肺臟干細(xì)胞能夠整合到小鼠肺臟中并在損傷部位形成肺泡樣的結(jié)構(gòu)。因而，干細(xì)胞移植在治療肺部損傷疾病方面具有非常廣闊的前景。但是，長(zhǎng)期以來由于技術(shù)的限制，很難從成體的組織和器官中分離獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞。

因而，目前的肺臟干細(xì)胞分離獲得方法仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效從成體的組織和器官中分離獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞的手段。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種肺臟干細(xì)胞分離試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含：組織消化液；經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞；以及肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液，

其中，所述組織消化液包含：

99體積％的pbs；

0.1-2u/mldna酶；

0.1-0.2mg/mli型膠原酶；

0.1-0.2mg/mliv型膠原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶xiv；

0.1-3mg/ml鏈絲菌蛋白酶e；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：

90體積％的rpmi1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

1-3mmol/ll-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/lβ-巰基乙醇；

100-1000u/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/mlegf生長(zhǎng)因子。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的試劑盒能夠有效用于肺臟干細(xì)胞分離，具體地，利用其組織消化液能夠有效對(duì)包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本進(jìn)行消化處理，獲得單細(xì)胞；利用肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液與單細(xì)胞混合，并置于經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞上進(jìn)行孵育培養(yǎng)，能夠有效獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞，且獲得的肺臟干細(xì)胞活性好、純度高、無細(xì)菌和支原體污染。此外，本發(fā)明的試劑盒成本低，使用方便，易于大量生產(chǎn)利用，并且尤其適用于從微量生物樣本中分離獲得肺臟干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過下列任意一種方法制備獲得所述經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞：

(1)將胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行輻照量為30-80gy的輻照處理1-5小時(shí)；

(2)將所述胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行1-30ug/ml絲裂霉素c處理1-5小時(shí)。由此，經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞失去細(xì)胞生長(zhǎng)活性，有利于對(duì)肺臟干細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述胚胎成纖維細(xì)胞來源于小鼠，優(yōu)選e13.5小鼠，

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述輻照處理是利用細(xì)胞輻照儀進(jìn)行的。由此，輻照效果好，經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞失去細(xì)胞生長(zhǎng)活性，但仍能用于對(duì)肺臟干細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述組織消化液包含：

99體積％的pbs；

1u/mldna酶；

0.15mg/mli型膠原酶；

0.15mg/mliv型膠原酶；

0.07mg/ml分散酶；

0.3mg/ml蛋白酶xiv；

2mg/ml鏈絲菌蛋白酶e；以及

0.35mg/ml胰酶，

所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：

90體積％的rpmi1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

2mmol/ll-谷氨酰胺；

0.1mmol/lβ-巰基乙醇；

500u/ml白血病抑制因子；以及

3.5ng/mlegf生長(zhǎng)因子。

由此，利用該組織消化液對(duì)包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本進(jìn)行消化處理時(shí)效果好，能夠有效獲得單細(xì)胞，且對(duì)其細(xì)胞活性無損傷；而該肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液能夠有效用于肺臟干細(xì)胞的孵育培養(yǎng)，從而能夠有效獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞，且獲得的肺臟干細(xì)胞純度高、無細(xì)菌和支原體污染。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還提供了一種分離獲得肺臟干細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：

利用組織消化液將包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本進(jìn)行消化處理，以便獲得單細(xì)胞；以及

將所述單細(xì)胞與肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液混合，并置于經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞上進(jìn)行孵育培養(yǎng)，以便獲得肺臟干細(xì)胞，

其中，所述組織消化液包含：

99體積％的pbs；

0.1-2u/mldna酶；

0.1-0.2mg/mli型膠原酶；

0.1-0.2mg/mliv型膠原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶xiv；

0.1-3mg/ml鏈絲菌蛋白酶e；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：

90體積％的rpmi1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

1-3mmol/ll-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/lβ-巰基乙醇；

100-1000u/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/mlegf生長(zhǎng)因子。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞，且獲得的肺臟干細(xì)胞活性好、純度高、無細(xì)菌和支原體污染，尤其適用于從微量生物樣本中分離獲得肺臟干細(xì)胞，并且，該方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)施成本低，易于推廣。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述組織消化液包含：

99體積％的pbs；

1u/mldna酶；

0.15mg/mli型膠原酶；

0.15mg/mliv型膠原酶；

0.07mg/ml分散酶；

0.3mg/ml蛋白酶xiv；

2mg/ml鏈絲菌蛋白酶e；以及

0.35mg/ml胰酶。由此，對(duì)包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本進(jìn)行消化處理的效果好，能夠有效獲得單細(xì)胞，且對(duì)其細(xì)胞活性無損傷。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：

90體積％的rpmi1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

2mmol/ll-谷氨酰胺；

0.1mmol/lβ-巰基乙醇；

500u/ml白血病抑制因子；以及

3.5ng/mlegf生長(zhǎng)因子。

由此，該肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液能夠有效用于肺臟干細(xì)胞的孵育培養(yǎng)，從而能夠有效獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞，且獲得的肺臟干細(xì)胞活性好、純度高、無細(xì)菌和支原體污染。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過下列任意一種方法制備獲得所述經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞：

(1)將胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行輻照量為30-80gy的輻照處理1-5小時(shí)；

(2)將所述胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行1-30ug/ml絲裂霉素c處理1-5小時(shí)。

由此，經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞失去細(xì)胞生長(zhǎng)活性，有利于對(duì)肺臟干細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述胚胎成纖維細(xì)胞來源于小鼠，優(yōu)選e13.5小鼠。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述輻照處理是利用細(xì)胞輻照儀進(jìn)行的。由此，所述經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞失去細(xì)胞生長(zhǎng)活性，有利于對(duì)肺臟干細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，于36-38攝氏度，優(yōu)選37攝氏度的條件下進(jìn)行所述消化處理1-5小時(shí)。由此，消化處理效果好，能夠有效獲得單細(xì)胞，且對(duì)其細(xì)胞活性無損傷。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在進(jìn)行所述消化處理時(shí)，針對(duì)少于0.1mg的包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本，每個(gè)生物樣本加入1ml組織消化液；針對(duì)不少于0.1mg的包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本，每立方厘米的生物樣本加入2.5ml組織消化液。由此，消化處理的效果好，獲得的單細(xì)胞細(xì)胞活性無損傷。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述單細(xì)胞與所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液的混合比例為300000細(xì)胞/2ml分離培養(yǎng)液，其中單細(xì)胞數(shù)量不足300000時(shí)按照300000計(jì)算。由此，利用肺臟干細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)增，孵育培養(yǎng)的效果好，獲得的肺臟干細(xì)胞細(xì)胞活性好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，于36-38攝氏度，4％-6.5％co2的條件下進(jìn)行所述孵育培養(yǎng)2-5天。由此，孵育培養(yǎng)的效果好，獲得的肺臟干細(xì)胞細(xì)胞活性好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：對(duì)所述肺臟干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定和污染檢測(cè)。由此，能夠進(jìn)一步確定獲得的肺臟干細(xì)胞的純度和質(zhì)量。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述污染檢測(cè)包括細(xì)菌污染檢測(cè)和支原體污染檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用免疫熒光染色法檢測(cè)所述肺臟干細(xì)胞的krt5和p63標(biāo)志物的表達(dá)，以便實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞鑒定。由此，能夠進(jìn)一步確定獲得的肺臟干細(xì)胞的純度。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的分離獲得肺臟干細(xì)胞的方法可以包括以下步驟：

在無菌實(shí)驗(yàn)室中，用組織消化液在37攝氏度下消化活檢組織1-5小時(shí)，收集消化后的細(xì)胞，并添加肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液后培養(yǎng)在regend-feeder上2-5天；然后通過免疫熒光染色法對(duì)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)志物krt5和p63的表達(dá)檢測(cè)，以便進(jìn)行細(xì)胞鑒定，確定獲得的細(xì)胞為肺臟干細(xì)胞，以及分離得到的肺臟干細(xì)胞的純度；對(duì)分離得到的肺臟干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌污染和支原體污染的質(zhì)量檢測(cè)。

其中，需要說明的是，當(dāng)使用本發(fā)明的試劑盒或方法進(jìn)行肺臟干細(xì)胞分離時(shí)，所述的“包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本”的來源不受特別限制，一般動(dòng)物的包含肺臟干細(xì)胞的肺部組織均適用。并且，本發(fā)明尤其適用于從微量生物樣本中分離獲得肺臟干細(xì)胞。

需要注意的是，當(dāng)本發(fā)明應(yīng)用于臨床的肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)和移植時(shí)，因包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本來源于人，則采樣時(shí)需要避免對(duì)人體的傷害。針對(duì)肺嚴(yán)重裂傷無法進(jìn)行修補(bǔ)者，無遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的肺部惡性腫瘤患者，部分肺結(jié)核患者，支氣管擴(kuò)張癥患者，肺膿腫患者，間質(zhì)性肺病患者等，可以在臨床治療對(duì)肺部行切除術(shù)的同時(shí)，選取遠(yuǎn)離病灶的正常組織作為本發(fā)明的“包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本”用于肺部干細(xì)胞的分離。但該種方法對(duì)于病人的損傷較大，手術(shù)的危險(xiǎn)性高，難度大，風(fēng)險(xiǎn)高。不適用于正常的健康人群或大多數(shù)慢性肺部疾病患者。因而，針對(duì)有肺部干細(xì)胞存儲(chǔ)需求的病人或健康人，可以將其送至支氣管鏡檢查室進(jìn)行支氣管鏡檢查，同時(shí)在支氣管鏡的活檢孔插入一次性細(xì)胞刷，在支氣管鏡監(jiān)測(cè)的情況下將細(xì)胞刷送至遠(yuǎn)端支氣管，在清楚地觀察了細(xì)胞刷周圍的氣管腔情況后，選擇遠(yuǎn)離病灶的位置，將毛刷在氣管壁上輕輕刷一至五次，然后將支氣管鏡和細(xì)胞刷一起從體內(nèi)取出，將帶有少量活檢組織的細(xì)胞刷頭部用無菌剪剪下來，以便獲得“包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本”。上述的刷檢獲取少量活檢組織的方法風(fēng)險(xiǎn)較小，對(duì)人體的傷害也非常小，具有非常強(qiáng)的可操作性。同時(shí)，該方法的適用人群非常廣泛，對(duì)病人和正常人群都適用。

通過本發(fā)明的試劑盒或分離培養(yǎng)肺臟干細(xì)胞的方法，可以從非常少量的活檢組織中獲得可大量擴(kuò)增的細(xì)胞，為肺臟干細(xì)胞的移植治療提供可能。對(duì)于患者來說，無需再花大量的時(shí)間和財(cái)力物力去獲得一個(gè)異常稀少的配型成功的肺臟進(jìn)行器官移植便具有恢復(fù)健康，延長(zhǎng)壽命的機(jī)會(huì)。因此，相比于器官移植，更多的病人擁有治療的機(jī)會(huì)。對(duì)正常人來說，可以在身體健康時(shí)便可存儲(chǔ)下自己的健康干細(xì)胞以備不時(shí)之需，同時(shí)在無法預(yù)料的疾病發(fā)生時(shí)具有更加好的修復(fù)作用和療效，為自己未來的身體健康投下了一份非常有利的保險(xiǎn)。也即，本發(fā)明的試劑盒和方法可以有效用于對(duì)有肺部干細(xì)胞存儲(chǔ)需求的正常的健康人群或大多數(shù)慢性肺部疾病患者，以及有肺臟干細(xì)胞移植治療需求的嚴(yán)重肺部疾病患者進(jìn)行肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，分離獲得的肺臟干細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果——呈克隆狀生長(zhǎng)(10倍物鏡，10倍目鏡)；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，分離獲得的肺臟干細(xì)胞的p63和krt5標(biāo)記物免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果；以及

圖3-圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，人肺臟干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后的免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果(圖3用0.8倍物鏡，10倍目鏡觀測(cè)；圖4和圖5用40倍物鏡，10倍目鏡觀測(cè))。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

從包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本分離獲得肺臟干細(xì)胞，具體如下：

1、樣本：樣本來源于一患有肺纖維化的病人，已需要簽署知情同意書。

樣本采集過程：將該病人安排進(jìn)入內(nèi)窺鏡檢查室進(jìn)行遠(yuǎn)端氣管檢查，通過內(nèi)窺鏡對(duì)其遠(yuǎn)端支氣管(大致位置可為3-8級(jí))進(jìn)行清楚的觀察后，在支氣管鏡的活檢孔插入一次性細(xì)胞刷，選擇正常部位，盡量遠(yuǎn)離病灶，將保護(hù)毛刷伸出支氣管鏡末端，再推出內(nèi)套管，頂?shù)裘⒛┒说谋Ｗo(hù)塞，內(nèi)套管伸出外套管末端后再推出毛刷，在氣管壁上輕輕刷一至五次后將細(xì)胞刷抽回保護(hù)管中，再將支氣管鏡和細(xì)胞刷一起從體內(nèi)取出，用無菌剪刀將毛刷前面部分剪掉，伸出毛刷，再將帶有少量活檢組織的細(xì)胞刷頭部3-6cm用無菌剪刀剪下來，放置到標(biāo)本收集管中，以便獲得包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本。

2、試劑：

組織消化液，包含：

99體積％的pbs；

0.1-2u/mldna酶；

0.1-0.2mg/mli型膠原酶；

0.1-0.2mg/mliv型膠原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶xiv；

0.1-3mg/ml鏈絲菌蛋白酶e；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液，包含：

90體積％的rpmi1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

1-3mmol/ll-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/lβ-巰基乙醇；

100-1000u/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/mlegf生長(zhǎng)因子。

經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞：通過利用細(xì)胞輻照儀將e13.5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞mef進(jìn)行輻照量為30-80gy的輻照處理1-5小時(shí)獲得的。

3、方法：

按照以下步驟，從上述獲得的包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本(即帶有少量活檢組織的細(xì)胞刷頭部)分離獲得肺臟干細(xì)胞：

在24小時(shí)內(nèi)，將標(biāo)本收集管于低溫環(huán)境中運(yùn)輸至無菌實(shí)驗(yàn)室。在無菌實(shí)驗(yàn)室中，從標(biāo)本收集管中小心取出帶有少量刷檢組織的毛刷頭(即包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本，其少于0.1mg)，并加入組織消化液1ml，在37攝氏度的環(huán)境中放置1-5小時(shí)進(jìn)行消化處理，再加入終止液(其中，1l終止液包含：900mlrpmi1640培養(yǎng)基；以及100ml胎牛血清)終止消化后，在1200rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘后，去掉上清以去除消化液，再用含有雙抗(50u/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞洗兩遍后，在1200rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，去掉上清，用肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液(300000細(xì)胞/2ml分離培養(yǎng)液，其中單細(xì)胞數(shù)量不足300000時(shí)按照300000計(jì)算混合)重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞鋪到經(jīng)過輻照處理的人胚胎成纖維細(xì)胞上，于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(36-38攝氏度，4％-6.5％co2)進(jìn)行孵育培養(yǎng)，待2-5天后，倒置顯微鏡下便可以觀察到由肺臟干細(xì)胞組成的克隆(見圖1)。

接著，通過免疫熒光染色法對(duì)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)志物krt5和p63的表達(dá)檢測(cè)，以便進(jìn)行細(xì)胞鑒定，確定獲得的細(xì)胞為肺臟干細(xì)胞，以及分離得到的肺臟干細(xì)胞的純度。免疫熒光染色結(jié)果顯示大量的克隆表達(dá)相應(yīng)的肺臟干細(xì)胞標(biāo)記物krt5(見圖2a)和p63(見圖2b)。圖2c為dapi染色，指示細(xì)胞核。

然后，對(duì)經(jīng)過細(xì)胞鑒定的分離得到的肺臟干細(xì)胞取上清進(jìn)行進(jìn)行細(xì)菌污染和支原體污染的質(zhì)量檢測(cè)。

其中，細(xì)菌污染的檢測(cè)方法如下：取500ul肺臟干細(xì)胞培養(yǎng)基的上清加入到干細(xì)胞分離培養(yǎng)液中在37攝氏度的溫度下培養(yǎng)14天，每天觀察培養(yǎng)基的情況，如果依然澄清，說明沒有細(xì)菌生成，如果培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，便說明有細(xì)菌污染。在我們的檢測(cè)中，每天觀察培養(yǎng)基的情況都為澄清狀態(tài)，說明沒有細(xì)菌污染。

支原體污染的檢測(cè)方法如下：取100ul的肺臟干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再利用美國lonza公司生產(chǎn)的lonzamycoalertmycoplasmadetectionkit(貨號(hào)為lt07-118)，按照說明書的操作進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果最后的值小于0.8，說明沒有支原體的污染。

實(shí)施例2

按照實(shí)施例1的方法，從包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本分離獲得肺臟干細(xì)胞，其中，區(qū)別僅在于：

組織消化液包含：

99體積％的pbs；

1u/mldna酶；

0.15mg/mli型膠原酶；

0.15mg/mliv型膠原酶；

0.07mg/ml分散酶；

0.3mg/ml蛋白酶xiv；

2mg/ml鏈絲菌蛋白酶e；以及

0.35mg/ml胰酶，

肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：

90體積％的rpmi1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

2mmol/ll-谷氨酰胺；

0.1mmol/lβ-巰基乙醇；

500u/ml白血病抑制因子；以及

3.5ng/mlegf生長(zhǎng)因子。

結(jié)果，成功獲得肺臟干細(xì)胞，且分離得到的肺臟干細(xì)胞的細(xì)胞活性好，純度高，無細(xì)菌和支原體污染。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1獲得的肺臟干細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)擴(kuò)增，再將表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的慢病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)中24小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖液洗掉病毒再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，72小時(shí)后，可以觀察到幾乎所有的細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光蛋白，說明已成功地將細(xì)胞標(biāo)記上了綠色熒光蛋白。然后將表達(dá)綠色熒光蛋白的肺臟干細(xì)胞重懸在30-70ul的磷酸鹽緩沖液中，再通過氣道輸入到肺臟損傷的免疫缺陷小鼠(在移植細(xì)胞前8天，通過氣道灌注將博萊霉素輸入nod-scid小鼠呼吸道中，引起小鼠肺部損傷，獲得肺臟損傷的免疫缺陷小鼠，其中，nod-scid小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)的肺臟中，半個(gè)月后，再將小鼠肺臟取出，用oct包埋后，再用冰凍切片機(jī)切片后進(jìn)行免疫熒光染色，再在熒光顯微鏡下拍攝熒光的表達(dá)情況。

結(jié)果見圖3-圖5。具體地，干細(xì)胞移植到小鼠肺內(nèi)后分化形成的人體肺臟(見圖3，圖中信號(hào)為gfp信號(hào))，移植后的干細(xì)胞表達(dá)支氣管分泌上皮標(biāo)記物cc10(見圖4，其中a圖為cc10，b圖為相同區(qū)域的gfp信號(hào))，移植后的干細(xì)胞表達(dá)支肺泡上皮標(biāo)記物ager(見圖5，其中a圖為ager信號(hào)，b圖為相同區(qū)域的gfp信號(hào))。

由圖3-圖5可知，肺臟干細(xì)胞移植后，能夠在免疫缺陷小鼠的肺臟中分化出人的支氣管 和肺泡等組織結(jié)構(gòu)，從而證明了其干細(xì)胞特性。由此表明，利用本發(fā)明的方法獲取的干細(xì)胞可用于臨床干細(xì)胞移植治療之用。其中，具體的臨床治療方案設(shè)計(jì)和倫理論證應(yīng)嚴(yán)格按照衛(wèi)計(jì)委相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。