本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種布魯氏菌104m疫苗株敲除omp25基因的重組菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

布魯氏菌病是由布魯氏菌(brucella)感染引起的一種慢性傳染性疾病，也是世界范圍內(nèi)危害公共衛(wèi)生安全的重大人畜共患傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，且可傳染給人和其他家畜，其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起母畜流產(chǎn)、公畜不育和各種組織的局部病灶，患病的牛、羊、豬、犬等也是人類(lèi)布魯氏菌病的主要傳染源。人感染布魯氏菌病可以引起發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、疲乏無(wú)力，部分患者轉(zhuǎn)為難以治愈的慢性病人。布魯氏菌病在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，自2000年以后，我國(guó)人畜布魯氏菌病發(fā)病率逐年上升，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大危害，同時(shí)給我國(guó)公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了巨大威脅，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。布魯氏菌病的疫苗免疫是控制布病的有效方法，但是目前我國(guó)使用的人布魯氏菌疫苗104m的安全性還存在很多問(wèn)題。

全球預(yù)防動(dòng)物布魯氏菌感染的疫苗主要有s19、rev1和rb51。人用布魯氏菌疫苗為ba-19(br.abortus縮寫(xiě))和104m(mockba的縮寫(xiě))菌苗。1923年美國(guó)人buck從牛體中分出一株牛種19號(hào)弱毒菌種，制成獸用19活菌苗。1946年蘇聯(lián)研究人員從19號(hào)菌種的變異菌落中選出一種純系光滑型菌體，稱(chēng)之為ba-19菌苗，1951年正式用于人群接種。104m菌苗是上世紀(jì)五十年代，在蘇聯(lián)中部地區(qū)病牛的胎盤(pán)中分離出一株牛種菌，該菌種編號(hào)為104m(mockba的縮寫(xiě))。小量豚鼠實(shí)驗(yàn)證明該菌種對(duì)動(dòng)物的免疫原性?xún)?yōu)于ba-19，毒力較ba-19強(qiáng)，在之后的十余年中蘇聯(lián)學(xué)者利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和家畜對(duì)104m進(jìn)行了大量的研究，并少量用于人體的研究，證明它在一定條件下使用，對(duì)人和動(dòng)物有效。我國(guó)引用該菌種后，于1959年-1965年進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，證明對(duì)人群預(yù)防布魯氏菌病感染有效，優(yōu)于ba-19菌種。1965年我國(guó)正式批準(zhǔn)生產(chǎn)人用皮上劃痕104m布魯氏菌活疫苗。但是，使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)104m菌苗和ba-19一樣，能使被接種的機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)局部皮試敏感性增高及出現(xiàn)某些臨床癥狀，存在著一些嚴(yán)重的問(wèn)題而逐漸不被使用。其主要問(wèn)題為：一、接種采用皮膚劃痕的方法，不僅疼痛而且讓人難以接受；二、因其是弱毒疫苗株，接種后副反應(yīng)也較大，可致接種人員感染；三、免疫后與自然感染無(wú)法區(qū)分，嚴(yán)重地影響著對(duì)布病的診斷與檢疫工作。

布魯氏菌的毒力因子與布魯氏菌病的發(fā)病及免疫機(jī)制、治療及預(yù)防等均關(guān)系密切。由于現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，對(duì)布魯氏菌毒力因子的認(rèn)識(shí)也逐漸深化。目前公認(rèn)的布魯氏菌毒力相關(guān)因子有：脂多糖合成基因、bvrr/bvrs雙組分調(diào)控蛋白基因、 iv型分泌系統(tǒng)、h2o2酶基因、超氧歧化酶基因、外膜蛋白、熱休克蛋白等。

外膜蛋白不僅是布魯氏菌的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，而且也是布魯氏菌重要的抗原和毒力因子。對(duì)外膜蛋白及其基因的深入研究是十分重要，可以為布魯氏菌病的診斷、分型和新型疫苗的研制提供理論上的支持。omp25是ompa家族成員之一，屬于布魯氏菌第3組外膜蛋白o(hù)mp25/omp31家族中的一員，是布魯氏菌的重要外膜蛋白，在維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用。

基因缺失疫苗作為新型的基因工程疫苗之一，對(duì)預(yù)防和控制布病具有廣闊的研究前景。目前布魯氏菌弱毒疫苗株是實(shí)踐應(yīng)用中控制布魯氏菌最有效的疫苗，但多數(shù)疫苗表現(xiàn)出一定的毒性，當(dāng)在懷孕前使用會(huì)引起流產(chǎn)，并且免疫所產(chǎn)生的抗體難以與自然感染區(qū)別。因此，急需研制一種能夠用于人的安全、有效免疫的布魯氏菌疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。

本發(fā)明提供的重組菌，為降低和/或抑制布魯氏菌104m中omp25蛋白活性得到的菌。

上述重組菌中，所述降低和/或抑制布魯氏菌104m中omp25蛋白活性為抑制或沉默布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因的表達(dá)。

上述重組菌中，所述抑制或沉默布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因的表達(dá)為敲除布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因。

上述重組菌中，所述敲除布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因?yàn)閷⒉剪斒暇?04m中omp25蛋白編碼基因替換為抗性基因。

上述重組菌中，所述布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因替換為抗性基因均采用基因組定點(diǎn)編輯或同源重組的方式進(jìn)行；

所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacb基因介導(dǎo)篩選的同源重組或自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組。

上述重組菌中，所述布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因替換為抗性基因?yàn)閷⒑锌剐曰虻耐粗亟M片段導(dǎo)入布魯氏菌104m中；

所述含有抗性基因的同源重組片段包括omp25蛋白編碼基因上游同源臂、抗性基因和omp25蛋白編碼基因下游同源臂。

上述重組菌中，所述含有抗性基因的同源重組片段通過(guò)重組載體導(dǎo)入布魯氏菌104m中；

所述重組載體為將含有抗性基因的同源重組片段插入表達(dá)載體得到的載體。

上述重組菌中，所述抗性基因?yàn)閗an；

所述含有所述抗性基因的同源重組片段的核苷酸序列為序列1。

上述的重組菌在制備如下1)-6)中任一種產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍：

1)、布魯氏菌減毒疫苗；

2)、布魯氏菌疫苗；

3)、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增值產(chǎn)品；

4)、促進(jìn)cd3+、cd4+和/或cd8+細(xì)胞增加產(chǎn)品；

5)、提高cd4+細(xì)胞與cd8+細(xì)胞的數(shù)量比產(chǎn)品；

6)、降低細(xì)胞因子il-2、il-4和/或inf-γ的含量產(chǎn)品。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種如下1)-6)中任一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述的重組菌；

1)、布魯氏菌減毒疫苗；

2)、布魯氏菌疫苗；

3)、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增值產(chǎn)品；

4)、促進(jìn)cd3+、cd4+和/或cd8+細(xì)胞增加產(chǎn)品；

5)、提高cd4+細(xì)胞與cd8+細(xì)胞的數(shù)量比產(chǎn)品；

6)、降低細(xì)胞因子il-2、il-4和/或inf-γ的含量產(chǎn)品。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明經(jīng)過(guò)敲除布魯氏菌104m的毒力基因omp25得到重組菌，通過(guò)對(duì)其毒力和免疫原性的研究，篩選出毒力減弱且保持免疫原性的布魯氏菌減毒疫苗候選株△omp25。

附圖說(shuō)明

圖1為kan基因的pcr產(chǎn)物。

圖2為omp25基因上、下游同源臂的pcr擴(kuò)增。

圖3為融合pcr擴(kuò)增打靶片段omp25::kan電泳圖。

圖4為敲除載體菌液pcr的鑒定結(jié)果。

圖5為突變株的篩選結(jié)果。

圖6為△omp25缺失株連續(xù)穩(wěn)定傳代pcr鑒定結(jié)果。

圖7為布魯氏菌特異性引物的pcr鑒定。

圖8為不同免疫劑量感染小鼠結(jié)果。

圖9為菌株免疫后小鼠體溫、體重變化。

圖10為小鼠感染后脾重及脾指數(shù)變化情況。

圖11為小鼠感染后平均克脾含菌數(shù)。

圖12為菌株特異性毒性生存率分析結(jié)果。

圖13為基因缺失對(duì)菌株誘導(dǎo)機(jī)體抗體水平消長(zhǎng)水平的影響。

圖14為小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果。

圖15為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果。

圖16為抗原特異性脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

圖17為小鼠脾淋巴細(xì)胞上清細(xì)胞因子含量檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

布魯氏菌疫苗株104m由蘭州生物制品有限公司提供；大腸桿菌dh5α(escherichiacolidh5α)、phsg298質(zhì)粒載體、pmd-19tsimplevector均購(gòu)自takara公司；胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)bd公司。清潔級(jí)balb/c小鼠(雌性)購(gòu)自北京軍科院動(dòng)物中心。

下述實(shí)施例1中主要試劑的配制：

(1)amp儲(chǔ)存液(100mg/ml)：取1g氨芐西林溶于5ml去離子水中，定容至10ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝成每管1ml，保存于－20℃冰箱。

(2)kan儲(chǔ)存液(100mg/ml)：取1g硫酸卡那霉素溶于5ml去離子水中，定容至10ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝成每管1ml，保存于－20℃冰箱。

(3)lb液體培養(yǎng)基：稱(chēng)取胰蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化鈉2g，加蒸餾水200ml混勻，121℃滅菌20min。

(4)lb固體培養(yǎng)基：lb液體培養(yǎng)基加入1.5％瓊脂粉，121℃滅菌20min。

(5)tsb液體培養(yǎng)基：稱(chēng)取tsb粉末6g，加蒸餾水混勻定容至200ml，115℃滅菌15min。

(6)tsa固體培養(yǎng)基：tsb液體培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂，115℃滅菌15min。

(7)75％甘油：量取75ml丙三醇，加入25ml蒸餾水，充分混勻，121℃滅菌20min。

cck8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)promega公司；鼠源的ifn-γ、il-2、il-4細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，小鼠淋巴細(xì)胞分離液均購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液rpmi1640、胎牛血清購(gòu)自gibco公司；雙抗購(gòu)自hyclone公司；牛血清白蛋白購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；hrp標(biāo)記山羊抗小鼠igg購(gòu)自美國(guó)earthox公司；可溶型單組分tmb底物溶液購(gòu)自天根生化科技有限公司；抗小鼠cd3epercpcyanine5.5、抗小鼠cd4fitc、抗小鼠cd8ape抗體購(gòu)自美國(guó)ebioscience公司；紅細(xì)胞裂解液、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)bd公司；常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院條件處，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

下述實(shí)施例2主要試劑的配制：

(1)包被液：稱(chēng)量na2co31.59g，nahco32.93g，加入900ml蒸餾水，調(diào)節(jié)ph值至9.6，加蒸餾水定容至1000ml，4℃保存。

(2)洗滌液：1l的pbs液中加入1mltween～20混勻4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)封閉液：稱(chēng)取5gbsa，加入500ml蒸餾水，制備濃度為1％的bsa溶液。

(4)終止液：量取355.6ml蒸餾水，緩慢滴加44.4ml濃硫酸，并不斷攪拌，配成2mol/l硫酸溶液。

(5)細(xì)胞培養(yǎng)液：400mlrpmi1640、25ml胎牛血清、10ml雙抗，加入rpmi1640定量至500ml，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存。

下述實(shí)施例檢測(cè)所需方法

1、活菌計(jì)數(shù)

將布魯氏菌104m菌株，轉(zhuǎn)接到無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)基中，180rpm/min，37℃空氣搖床震蕩培養(yǎng)至細(xì)菌開(kāi)始渾濁，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其od600值，分別收集0.3-0.8對(duì)數(shù)期間的菌液，并將菌液稀釋成10¹-10⁶梯度的菌懸液取0.1ml涂在無(wú)抗性tsa固體培養(yǎng)基上，計(jì)算出每毫升總活菌數(shù)。(每毫升總活菌數(shù)＝稀釋度菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10)

2、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用graphpadprism5和spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析。p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著，p>0.05為差異不顯著。

實(shí)施例1、敲除布魯氏菌疫苗株104m的omp25基因

在本研究中以克隆載體pmd19-tvector(以下簡(jiǎn)稱(chēng)t載體)作為載體來(lái)構(gòu)建布魯氏菌的插入失活突變株。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了帶有卡那抗性基因的pmd19-t質(zhì)粒，采用抗性基因替換的方法來(lái)構(gòu)建布魯氏菌的缺失突變株，這種方法避免了載體的影響，而且只需要一次抗性篩選即可得到突變株。采用融合pcr的方法，將待缺失基因上下游的同源臂與卡那霉素抗性基因融合起來(lái)，構(gòu)建打靶片段，其中抗性基因位于基因上下游同源臂之間。然后將打靶片段連接到t載體，構(gòu)建突變載體，進(jìn)而獲得布魯氏菌的缺失突變株。

1、引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)布魯氏菌疫苗株104m全基因組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)擴(kuò)增omp25基因的上、下游同源臂序列。用primer5.0軟件遵循gc含量約占50％原則，長(zhǎng)度均約為40個(gè)堿基。同時(shí)引用鑒別布魯氏菌種屬特異性引物，分析并設(shè)計(jì)特異性引物(見(jiàn)表1)。引物由北京賽百盛生物科技公司合成。

表1為目的基因上、下游同源臂基因及鑒定引物序列

2、敲除載體的構(gòu)建

以帶有kan^r抗性的phsg298質(zhì)粒為模板，用引物k1、k2擴(kuò)增得到950bp卡那霉素抗性基因kan(圖1)；

以布魯氏菌104m菌液為模板，使用引物o1、o2擴(kuò)增得到820bpomp25基因上游同源臂omp25-u，用引物o4、o5擴(kuò)增834bpomp25基因下游同源臂omp25-d(圖2，m：dl2000dnamarker；1：omp25基因上游同源臂pcr產(chǎn)物；2：omp25基因下游同源臂pcr產(chǎn)物)；

將omp25-u、omp25-d和kan純3個(gè)片段化產(chǎn)物(50ng/μl)按1：1：1濃度等量混合作為融合擴(kuò)增模板進(jìn)行如下融合pcr反應(yīng)：融合pcr反應(yīng)體系為：模板3μl，dntp1μl，q5high-fidelitydnapolymerase0.3μl，5×q5reactionbuffer4μl，ddh2o加至終體積20μl。反應(yīng)條件：95℃3min，95℃1min，65℃1min，72℃1min，10個(gè)循環(huán)。得到的pcr反應(yīng)液命名為pcr-a。將pcr-a反應(yīng)液稀釋10倍作為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板3μl，dntp1μl，o1(20μmol/l)1μl，o5(20μmol/l)1μl，lataqdnapolymerase0.5μl，10×buffer2.5μl，ddh2o加至終體積25μl。反應(yīng)條件：95℃5min，95℃30s，55℃1min，72℃3min，35個(gè)循環(huán)后72℃10min延伸4℃保存。得到2604bppcr產(chǎn)物(圖3)。

將pcr產(chǎn)物進(jìn)行dna瓊脂糖凝膠電泳并切膠純化，所得到的打靶片段命名為：omp25::kan。

經(jīng)過(guò)測(cè)序，打靶片段omp25::kan的核苷酸序列為序列1，其中序列1第1-820位為omp25基因上游同源臂omp25-u、序列1第821-1770位為卡那霉素抗性基因kan、序列1第1771-2604位為omp25基因下游同源臂omp25-u。

將打靶片段omp25::kan直接與pmd19t載體連接，得到重組質(zhì)粒pmd19t-omp25::kan，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，用o1和o5進(jìn)行菌落pcr鑒定，鑒定大小為2604bp(如圖4)。

經(jīng)過(guò)測(cè)序，重組質(zhì)粒pmd19t-omp25::kan為將序列表中序列1所示的打靶片段與pmd19t載體進(jìn)行ta連接，得到的質(zhì)粒。

3、重組菌的獲得

將3μl重組質(zhì)粒pmd19t-omp25::kan(200ng/pl)和48μl104m菌株的感受態(tài)細(xì)胞，混勻后加入預(yù)冷的0.1ml電擊杯中，使用bio－radgenepulser電轉(zhuǎn)儀，按1.8kv、25μf、200ohms條件電穿孔轉(zhuǎn)化。電擊后立即加入1ml無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)液。37℃震動(dòng)培養(yǎng)6h涂布于kan抗性tsa固體平板，生長(zhǎng)的為陽(yáng)性克隆。

將陽(yáng)性克隆提取基因組dna，用目的基因omp25鑒定引物(引物為626)進(jìn)行pcr驗(yàn)證，以野生型104m菌株作為陰性對(duì)照；

結(jié)果如圖5所示，m：dl250dnamarker；1-5：篩選的重組菌落克隆；6：野生型104m菌落對(duì)照；得到1423bp的陽(yáng)性克隆為重組菌，其擴(kuò)增出的片段比野生株擴(kuò)增出片段(626bp)大，則說(shuō)明重組菌構(gòu)建正確，命名為△omp25(以下簡(jiǎn)稱(chēng)△omp25，又稱(chēng)為104m突變株)。

重組菌△omp25為將kan基因替換104m基因組中omp25基因得到的重組菌。4、重組菌的檢測(cè)

1)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將重組菌△omp25在無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，記錄并保存每一代菌液，存放到－80℃。對(duì)104m菌株、△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代菌液進(jìn)行pcr驗(yàn)證(引物為626)，結(jié)果如圖6，m：dl2000dnamarker；1：野生型104m菌落對(duì)照；2-24：△omp25第1-23代傳代菌株，野生型陰性條帶片段大小為：626bp；傳代菌株條帶片段大小均為：1423bp。

與此同時(shí)，對(duì)布魯氏菌omp25基因突變株△omp25第1代、△omp25第10代及△omp25第20代菌株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，利用dnaman軟件將104m株與omp25基因序列比對(duì)，omp25基因與親本株同源性為100％；kan基因序列與△omp25第1代、第10代及第20代菌株測(cè)序結(jié)果比對(duì)，同源性為100％。

可以看出，抗性基因成功替換了目的基因，并且連續(xù)傳至第20代也穩(wěn)定存在。

2)菌株的pcr鑒定

將△omp25菌株連續(xù)傳代的培養(yǎng)物采用布魯氏菌鑒定引物進(jìn)行菌種鑒定(引物為699和279)。

結(jié)果如圖7所示，圖7a為引物699的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為699bp，圖7b為引物279 的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為279bp；m：dl2000dnamarker；1：野生型菌落對(duì)照；2-24：104m△omp25第1-23連續(xù)穩(wěn)定傳代菌株；可見(jiàn)，重組菌△omp25突變株與104m有同樣的特征條帶。說(shuō)明篩選到的突變菌株來(lái)自出發(fā)菌株，而非其他污染。

3)培養(yǎng)特性的鑒定

將布魯氏菌104m菌株、△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代保存菌種接種于無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min空氣搖床震蕩培養(yǎng)2d，收集菌體，制成2.5×10⁹cfu/ml的菌懸液分別取100μl涂在含有1:1000的品紅和硫堇的無(wú)抗性tsa固體培養(yǎng)基上。在37℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3d，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

結(jié)果如表2所示，品紅平板有細(xì)菌生長(zhǎng)，硫堇培養(yǎng)基沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。

表2菌株培養(yǎng)特性鑒定結(jié)果

“+”：有細(xì)菌生長(zhǎng)；“－”：沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)

4)菌株的變異檢查

用生理鹽水將新鮮培養(yǎng)物104m菌株、△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代保存的菌液接種于無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)基中，制成含菌2.5×10⁹-3.0×10⁹/ml的菌懸液，置90℃水浴30min，觀(guān)察凝集現(xiàn)象；同時(shí)取相同濃度的菌懸液與1:1000三勝黃素水溶液等量混合，于37℃放置24h，觀(guān)察凝集現(xiàn)象。

結(jié)果如表3所示，親本株104m與△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代均沒(méi)有產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

表3菌株培養(yǎng)特性檢查結(jié)果

“+”：凝集；“－”：不凝集

實(shí)施例2、omp25基因缺失株△omp25對(duì)細(xì)菌毒力及免疫原性的影響

一、免疫方案

1、免疫劑量的確定

為選取一個(gè)合適的感染劑量，將1×10⁵-1×10⁸cfu/ml的104m菌液通過(guò)腹腔接種方式感染小鼠，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)(4-8天)處死小鼠，分離脾臟，涂板計(jì)算平均脾臟重量及平均克脾含菌數(shù)(脾指數(shù)＝脾重(mg)/小鼠體重(g)；克脾菌數(shù)＝小鼠脾總含菌數(shù)/脾重)。

小鼠免疫104m菌株感染后4-8天觀(guān)察并處死小鼠，分離脾臟，涂板計(jì)數(shù)(見(jiàn)圖8)。陰性對(duì)照組的小鼠脾臟中一直沒(méi)有分離到細(xì)菌。10⁸組在感染后第4天脾臟菌量達(dá)高峰，然后開(kāi)始下降；10⁷組在感染后第6天脾臟菌量達(dá)高峰，然后開(kāi)始下降。10⁸組的小鼠雖沒(méi)有死亡，但出現(xiàn)明顯的精神萎靡，被毛逆立。布魯氏菌對(duì)動(dòng)物的毒力主要表現(xiàn)為其在體內(nèi)的生存能力，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是比較細(xì)菌在體內(nèi)的定植和復(fù)制能力，因此過(guò)高或過(guò)低的感染劑量均不能正確反映細(xì)菌對(duì)小鼠的毒力。因此，選取了10⁷cfu/ml的感染菌量。

將布魯氏菌104m、△omp25菌株涂布于無(wú)抗性tsa固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)4d后，挑取單菌落接種于無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(od600：0.435)將菌液5000r/min離心2min后，棄上清，用pbs液洗滌重懸菌體3次，最終將菌體重懸于pbs中，分裝1ml在1.5ml離心管中，用pbs稀釋含菌為5×10⁷cfu/ml，即為布魯氏菌104m免疫用疫苗和△omp25菌株免疫用疫苗。

2、動(dòng)物的免疫及分組

(1)分組方案：6-8周齡balb/c雌性小鼠，各實(shí)驗(yàn)(包括安全性實(shí)驗(yàn)、體液免疫實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn))隨機(jī)分3組，每組5只。

(2)免疫方案：

104m組：布魯氏菌104m免疫用疫苗，免疫劑量1×10⁷cfu/只；

△omp25組：△omp25菌株免疫用疫苗，免疫劑量1×10⁷cfu/只；

空白對(duì)照組：pbs免疫200μl/只。

(3)免疫方式：小鼠腹腔注射。

二、毒性檢測(cè)

1、皮毛、體重、體溫檢測(cè)

將104m組、△omp25組和pbs組分別免疫小鼠，觀(guān)察小鼠皮毛體態(tài)、體溫并記錄2周平均體重、體溫。

結(jié)果如圖9所示，a為免疫后小鼠體重；b為免疫后小鼠體溫；顯示104m組、△omp25組和pbs組小鼠表現(xiàn)正常，無(wú)明顯異常?！鱫mp25組小鼠與104m組小鼠體重?zé)o顯著差 異，均顯著低于空白對(duì)照pbs組。而各組體溫之間無(wú)明顯變化。檢測(cè)各組小鼠平均體重(見(jiàn)圖9a)，各組小鼠平均體溫變化情況(見(jiàn)圖9b)。

2、脾指數(shù)和克脾菌數(shù)計(jì)算

從第1-10周分別取各組小鼠斷頸處死，在75％酒精中浸泡5min，無(wú)菌取脾稱(chēng)重，計(jì)算平均脾指數(shù)，脾指數(shù)＝脾重(mg)/小鼠體重(g)。

104m組及△omp25組小鼠平均脾重相比于空白對(duì)照組有顯著差異(p<0.01)。小鼠脾重和脾臟指數(shù)呈正相關(guān)，突變株與親本株組小鼠感染后1周內(nèi)小鼠脾重變化較大，均在第2周達(dá)到最高值，5周后呈下降趨勢(shì)，第7周后脾重趨勢(shì)逐漸穩(wěn)定，突變株△omp25感染的小鼠脾臟重量于親本株104m差異顯著(p<0.05)(見(jiàn)圖10a)。進(jìn)而結(jié)合脾指數(shù)結(jié)果看，第3周后，△omp25突變株脾指數(shù)與親本株相比差異顯著(p<0.05)(見(jiàn)圖10b)。

感染后分別于1-10周分別取小鼠，斷頸、消毒、取脾、研磨，用pbs液適當(dāng)稀釋脾臟研磨組織梯度涂無(wú)抗性tsa固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～6d，計(jì)算長(zhǎng)出單菌落。最后計(jì)算平均克脾菌數(shù)，克脾菌數(shù)＝小鼠脾總含菌數(shù)/脾重。

通過(guò)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，感染10周后，突變株△omp25與親本對(duì)照組表現(xiàn)差異顯著(p<0.01)(圖11)。pbs空白對(duì)照組無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。親本株104m與△omp25突變株在感染后前四周的菌落數(shù)無(wú)顯著差異，第五周后，親本株無(wú)下降趨勢(shì)而突變株感染的脾菌數(shù)菌呈下降趨勢(shì)，到第十周親本菌株104m和△omp25突變株的平均脾菌數(shù)差異顯著(p<0.05)，說(shuō)明突變株△omp25的毒力較親本104m顯著下降。

3、特異性毒性檢測(cè)

根據(jù)《皮上劃痕人用布氏菌活疫苗規(guī)程－中華人民共和國(guó)藥典2010年版三部》對(duì)新布魯氏菌疫苗株的鑒定中的特異性毒性試驗(yàn)規(guī)定。

104m組：小鼠皮下注射0.5ml1.0×10⁹/ml布魯氏菌104m；

△omp25組：小鼠皮下注射0.5ml1.0×10⁹/ml△omp25菌株；

空白對(duì)照組：小鼠皮下注射0.5mlpbs。

每組用體重18～20g小鼠6只。

觀(guān)察7天死亡情況。

結(jié)果如圖12所示，pbs組小鼠全部存活，體重精神狀態(tài)情況良好。104m組小鼠第2天體重嚴(yán)重下降，被毛直立，精神狀態(tài)萎靡，眼睛緊閉。104m組小鼠在第1天有死亡情況，僅有1只小鼠存活?！鱫mp25組在第1天及第2天有小鼠死亡，第7天時(shí)有2只小鼠存活。通過(guò)對(duì)兩組存活率分析結(jié)果顯示，△omp25株毒力略小于104m株。

三、免疫原性檢測(cè)

1、體液免疫檢測(cè)

在免疫后第1周至第10周斷尾采集104m組、△omp25組和pbs組小鼠血，全血室溫放置2h后，4℃，8000r/min離心10min，收集上層血清，用間接elisa法檢測(cè)小鼠血清特異性igg水平，步驟如下：

(1)抗原處理：將布魯氏菌104菌株接種于無(wú)抗性tsb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2d，收集菌體，一部分適當(dāng)稀釋涂板計(jì)數(shù)，其余用pbs液重懸，于80℃加熱滅活處理2h。

(2)包被抗原：將處理的重懸菌8000r/min離心2min，棄上清，用包被液充分重懸并稀釋到1×10⁷cfu/ml，再包被于96孔elisa平板，100μl/孔，37℃放置2h后4℃包被過(guò)夜(包被的elisa板可于4℃保存1周)。

(3)洗板：棄去包被液，拍干，加入250μl洗滌液(pbst)靜置1min，棄去洗滌液，拍干，重復(fù)3次。

(4)封閉：加入封閉液，100μl/孔，37℃封閉1h。

(5)洗板：重復(fù)步驟(3)。

(6)加一抗：將待測(cè)血清按1:200到1:12800倍比稀釋?zhuān)?00μl/孔，37℃孵育1h。

(7)洗板：重復(fù)步驟(3)。

(8)加二抗：將hrp標(biāo)記山羊抗小鼠igg抗體用pbs按1:5000稀釋?zhuān)?00μl/孔，37℃孵育1h。

(9)洗板：重復(fù)步驟(3)。

(10)顯色：加入可溶型單組分tmb底物溶液，100μl/孔，37℃避光顯色15min。

(11)終止：加入終止液，100μl/孔，輕輕搖晃1min。

(12)讀數(shù)：先將酶標(biāo)儀預(yù)熱15min，在15min內(nèi)讀取elisa平板數(shù)值(波長(zhǎng)450)。

(13)分析：結(jié)果數(shù)據(jù)處理。

采用elisa方法檢測(cè)igg抗體效價(jià)，取測(cè)波長(zhǎng)450nm處效價(jià)為縱坐標(biāo)，取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制抗體消長(zhǎng)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖13)。親本株與突變株免疫小鼠2周后，小鼠血清中igg水平逐漸上升，到第10周也未見(jiàn)抗體水平明顯下降。從變化趨勢(shì)上看，免疫第5周時(shí)，親本104m和突變株△omp25免疫小鼠的抗體效價(jià)與突變株無(wú)明顯差異；而免疫第6周，突變株抗體效價(jià)水平顯著高于親本株(p<0.05)。

2、細(xì)胞免疫檢測(cè)

1)、小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備

(1)取104m組、△omp25組和pbs組免疫第4周小鼠眼球取血后，斷頸處死，用75％酒精浸泡5min，無(wú)菌取脾。

(2)無(wú)菌條件下在35mm培養(yǎng)皿中加入4ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液，蓋一層200目尼龍篩網(wǎng)，將脾臟放于篩網(wǎng)上，用注射器活塞小心研磨脾臟，直至充分溶解于液體。

(3)吸取脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管，并緩緩加入500μlrpmi1640培養(yǎng)液(含10％血清)，室溫1200r/min離心10min。

(4)從液面頂部輕輕吸取800μl液體，轉(zhuǎn)移至另一15ml離心管，加入10mlrpmi1640培養(yǎng)液，1000r/min離心5min，棄上清。

(5)加入4ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，室溫靜置15min，使紅細(xì)胞破碎裂解，1000r/min離心5min，棄上清。

(6)加入10mlrpmi1640培養(yǎng)液沖洗，1000r/min離心5min，棄上清，重復(fù)2次。

(7)最后將細(xì)胞重懸于2mlrpmi1640培養(yǎng)液中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器稀釋進(jìn)行計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁷cfu/ml，備用，為104m組脾淋巴細(xì)胞、△omp25組脾淋巴細(xì)胞和pbs組脾淋巴細(xì)胞。

2)、抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(cck8法)

分別將5×10⁶個(gè)/ml104m組脾淋巴細(xì)胞、△omp25組脾淋巴細(xì)胞和pbs組脾淋巴細(xì)胞稀釋液100μl加入到96孔培養(yǎng)板中，加入100μl5×10⁷cfu/ml的滅活抗原(滅活104m)，陰性對(duì)照為rpmi1640培養(yǎng)基，空白為不含細(xì)胞和抗原的rpmi1640培養(yǎng)基。37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。加入20μl的cck8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，測(cè)波長(zhǎng)450nm值。

is＝(od－od1640)/(odpbs－od1640)

結(jié)果如圖16所示，用滅活抗原去刺激104m組脾淋巴細(xì)胞、△omp25組脾淋巴細(xì)胞和pbs組脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)cck8法檢測(cè)后，計(jì)算si。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，突變株和親本對(duì)照組均能刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖，且△omp25突變株刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力高于與親本對(duì)照組。

上述結(jié)果表明，δomp25的免疫原性略高于親本株104m。

3)、omp25缺失對(duì)菌株誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

(1)將104m組脾淋巴細(xì)胞、△omp25組脾淋巴細(xì)胞和pbs組脾淋巴細(xì)胞分別用rpmi1640培養(yǎng)液稀釋至5×10⁶個(gè)/ml。

(2)取1ml脾細(xì)胞懸液，1200r/min離心10min，吸出900μl上清，剩余液用槍頭輕輕混勻。

(3)加入抗小鼠cd3epercpcyanine5.50.25μl、抗小鼠cd4fitc0.5μl、抗小鼠cd8ape0.5μl抗體，4℃避光孵育1h(其中陰性對(duì)照組分別加入3種熒光抗體，用于流式細(xì)胞儀的校對(duì))。

(4)加入1mlpbs洗滌，1200r/min離心10min，棄上清。

(5)加入1mlpbs洗滌，1200r/min離心10min，棄上清。用300μlpbs重懸。

(6)用流式細(xì)胞儀(型號(hào)：facscalibur，美國(guó)bd公司)進(jìn)行檢測(cè)。

104m組脾淋巴細(xì)胞、△omp25組脾淋巴細(xì)胞和pbs組脾淋巴細(xì)胞采用cd3、cd4、cd8熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記后的細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，測(cè)定cd3+、cd4+、cd8+的免疫細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算cd4+/cd8+的值。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，突變株和親本對(duì)照組免疫后小鼠淋巴細(xì)胞分化均發(fā)生變化，均能引起cd3+、cd4+、cd8+細(xì)胞增加(如圖15，a為pbs引起的cd4+細(xì)胞，b為pbs引起的cd8+細(xì)胞，c為104m引起的cd4+細(xì)胞，d為104m引起的cd8+細(xì)胞，e為△omp25引起的cd4+細(xì)胞，f為△omp25引起的cd8+細(xì)胞)。從cd4+/cd8+的結(jié)果看來(lái)(圖14)，△omp25突變株顯著高于104m親本株。

上述結(jié)果表明，δomp25的免疫原性高于親本株104m。

4)、細(xì)胞因子檢測(cè)

(1)將104m組脾淋巴細(xì)胞、△omp25組脾淋巴細(xì)胞和pbs組脾淋巴細(xì)胞用rpmi1640培養(yǎng)液(5％血清)稀釋至5×10⁶個(gè)/ml。

(2)取1.9ml細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入100μl相應(yīng)抗原刺激(為5×10⁷cfu/ml，使其每孔抗原終濃度達(dá)到與免疫劑量等同)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。

(3)將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h。

(4)根據(jù)小鼠細(xì)胞因子elisa檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

(5)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制相關(guān)圖表。

免疫小鼠后，取脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，體外檢測(cè)了部分重要的免疫相關(guān)細(xì)胞因子ifn-γ，il-2，il-4。通過(guò)elisa分析inf-γ，il-2和il-4含量。

結(jié)果如圖17所示，表明，親本株104m誘導(dǎo)的細(xì)胞因子il-2高于δomp25突變株(圖17a)；與親本株104m相比δomp25突變株誘導(dǎo)的il-4降低(圖17b)；親本株104m誘導(dǎo)的細(xì)胞因子inf-γ高于δomp25突變株(圖17c)。