本發(fā)明涉及微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種高產(chǎn)己酸的乳酸乳球菌乳酸亞種及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

揮發(fā)性游離脂肪酸可以產(chǎn)生乳品的特征性風(fēng)味，例如酪香、乳香、奶油感。脂肪酸中的丁酸、己酸和辛酸是乳香風(fēng)味的重要貢獻者。研究發(fā)現(xiàn)，向90％脫脂乳中添加酶解稀奶油產(chǎn)物后，己酸提高了1.7％，增強了產(chǎn)品的乳香味及口感，所以向發(fā)酵乳制品中加入產(chǎn)己酸的發(fā)酵劑，是增強產(chǎn)品的乳香味的一種方法。目前釀酒行業(yè)對產(chǎn)己酸的菌株研究較多，但一般集中于克氏梭菌、梭狀芽孢桿菌，這些菌株不適合發(fā)酵食品中的應(yīng)用。因此需要開發(fā)適合于發(fā)酵食品體系的高產(chǎn)己酸的乳酸菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請?zhí)峁┝艘环N高產(chǎn)己酸的乳酸乳球菌乳酸亞種及其應(yīng)用。為開發(fā)出適合發(fā)酵乳制品應(yīng)用的乳酸菌，本發(fā)明從四川阿壩自治州的牦牛發(fā)酵乳中分離篩選出一株高產(chǎn)己酸的菌株，作為發(fā)酵劑提高發(fā)酵乳制品的乳香味。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本申請?zhí)峁┝艘环N乳酸乳球菌乳酸亞種(lactococcuslactissubsp.lactis)ccfm1002，所述菌株已于2017年4月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.14024，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

本申請還提供了含有乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑。

所述發(fā)酵劑為直投式發(fā)酵劑，具體制備方法如下：

將乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024活化培養(yǎng)至活菌濃度達到10⁸cfu/ml以上，然后通過離心、緩沖液清洗、添加凍干保護劑，調(diào)整活菌濃度至10⁹cfu/ml以上，進行真空冷凍干燥，凍干后即得直投式發(fā)酵劑。

本申請還提供了所述的發(fā)酵劑在制備發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用。所述乳制品包括酸奶、酸奶油。

制備酸奶的具體方法為：

向原料乳中加入8％～12％的蔗糖并攪拌溶解，在18～22mpa下進行均質(zhì)，再按照乳體積計3％～5％向乳中接入所述乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑；在37℃下進行發(fā)酵至滴定酸度為70～80°t，即得所述的酸奶。

制備酸奶油的具體方法為：

脂肪標準化，即調(diào)整稀奶油的脂肪含量為18％～20％，74℃～82℃下巴氏殺菌30～35min或85℃下高溫短時殺菌25～60s，在14～21mpa，40℃～85℃條件下均質(zhì)，冷卻到21℃～30℃，投入2％權(quán)利要求2或3所述乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑，20℃～30℃下發(fā)酵16h～20h，可滴定酸度以乳酸計在0.7～0.9，ph在4.50～4.55時為發(fā)酵終點，凝乳后放在3℃～5℃下過夜放置，并保持24h～48h，即得所述的酸奶油。

發(fā)酵過程中，溫度優(yōu)選通常20℃～22℃。

本發(fā)明涉及到的直投式發(fā)酵劑，具體實施方法是，取400μl的乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024接種于20mlmrs液體培養(yǎng)基中，37℃下活化2至3代，待乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024達到10⁸cfu/ml以上活菌數(shù)時，4000rpm下離心20min，去除上清液后，在無菌環(huán)境下依次加入緩沖液和冷凍保護劑，待細胞濃度為10⁹cfu/ml時，真空冷凍干燥處理，所得即為直投式發(fā)酵劑。

本發(fā)明所述的乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024生長及發(fā)酵特性具有下述性質(zhì)：

(1)菌株進入穩(wěn)定期快，有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成；

(2)菌株產(chǎn)酸特性良好；

(3)菌株產(chǎn)己酸能力高，18h時可產(chǎn)9.64μg/kg；

(4)菌株脂肪代謝能力較高，18h的酸價為5.33。

在酸奶油發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明篩選到的cgmccno.14024產(chǎn)己酸的能力強，高于市售酸奶油中乳酸乳球菌乳酸亞種e207和mc10，因此，高產(chǎn)己酸的乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024可應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中乳香味的增強。

本發(fā)明方法安全健康，應(yīng)用的乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024是可用于食品的安全菌株。本發(fā)明的方法沒有添加其他化學(xué)物質(zhì)，安全健康。本發(fā)明乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024能有效提高發(fā)酵制品中己酸物質(zhì)的含量，且對產(chǎn)品感官品質(zhì)特性具有一定的改善作用。

附圖說明

圖1為乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在18h內(nèi)的生長情況；

圖2為乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在18h內(nèi)的ph變化情況；

圖3為添加乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的酸奶油的感官評定結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行具體描述。

實施例1：乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的菌種分離鑒定方法

(1)獲得合適的稀釋梯度并培養(yǎng)

從四川阿壩自治州傳統(tǒng)發(fā)酵酸牦牛乳樣品中稱取0.5ml，加入到裝有4.5ml無菌水中，然后依次取0.5ml菌液稀釋在4.5ml無菌水，使該樣品濃度梯度稀釋至10^-4，取4個稀釋度分別為10～10⁴的菌懸液各50μl分別涂布于mrs固體培養(yǎng)基上，在溫度37℃下培養(yǎng)46～50h。

(2)分離純化

用平板劃線法，挑選典型單菌落，重復(fù)這種培養(yǎng)挑選操作后得到優(yōu)良性狀的菌株。

(3)革蘭氏染色及過氧化氫酶實驗

挑取單菌落，做革蘭氏染色及過氧化氫酶實驗，在光學(xué)顯微鏡下觀察革蘭氏染色結(jié)果并記錄，將革蘭氏陽性、過氧化氫陰性菌平板純化四代，接種于mrs培養(yǎng)三代后，4000rpm離心5min，于30％甘油管內(nèi)貯藏，得到菌株ccfm1002

(4)pcr擴增16srdna

吸取1ml震蕩混勻后的液體培養(yǎng)基，離心后棄去上清液，并用1ml無菌水吹打清洗后，離心棄去上清液，用作菌落pcr的模板。

1)pcr體系50μl，其中mix為25μl，27f為1μl，1492r為1μl，ddh2o為23μl。

所用引物為27f:agagtttgatcctggcctca20和1492r:ggttaccttgttacgactt19。擴增片段長度1500bp。

2)pcr條件：

lid：105℃mby-16sv：20μl

dna雙鏈在94℃，10min的條件下變性，94℃，30s后冷卻50℃，30s，快速升溫至72℃時80s，并循環(huán)29次，最后72℃下保持7min

(5)瓊脂凝膠電泳(80ml)

在三角瓶中加入0.8g瓊脂糖和80ml1×tae，用微波加熱，直至澄清后，待稍涼后添加eb染料8μl；加入電泳板冷卻半小時，待其凝結(jié)成固體膠狀；用移液槍將3-5μl的樣品打入膠板的小孔內(nèi)，并在每行末端加一個marker；插上電極，調(diào)電壓120v，運行半小時；取出膠板，在uv下曝光10s，保存電泳條帶的圖像；將得到清晰電泳條帶的樣品測序。

(6)16srrna序列分析鑒定

根據(jù)北京六合華大基因科技股份有限公司給出的測序報告，結(jié)合blast分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)將所分離的乳酸菌16srrna序列與genbank/embl/ddbj)數(shù)據(jù)庫中已知菌株的對應(yīng)序列進行比較鑒定，經(jīng)分析鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024(lactococcuslactissubsp.lactisccfm1002),是革蘭氏陽性、兼性厭氧的噬溫菌，不產(chǎn)莢膜和芽孢，菌落較小，圓形凸起，有光澤，菌體卵圓形。

實施例2：乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的特性

1、乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在18h內(nèi)的生長曲線

將-80℃保存的本發(fā)明乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024接種于mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)18h，傳代培養(yǎng)2-3次，取菌液100μl接種于5mlmrs培養(yǎng)基中，置于37℃下培養(yǎng)18h，每隔2h取一次樣品，測其od600變化。實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，e207和mc10在8h時進入穩(wěn)定期，乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在4h時生長趨于緩慢，在6h時進入穩(wěn)定期，故乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024進入穩(wěn)定期快，有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。

2、乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在18h內(nèi)ph變化

將-80℃保存的本發(fā)明乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024接種于mrs液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)18h，傳代培養(yǎng)2～3次，取菌液100μl接種于5mlmrs培養(yǎng)基中，置于37℃下培養(yǎng)18h，每隔2h取一次樣品，測其ph變化。實驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，18h時e207的ph降為4.17，mc10和乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在18h時ph可降為4.05和4.03，cgmccno9964在18h時的ph降為4.26，故乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024產(chǎn)酸能力較好。

應(yīng)用實施例1：乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024發(fā)酵酸奶

(1)直投式發(fā)酵劑的制備：

取400μl的乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024接種于20mlmrs液體培養(yǎng)基中，37℃下活化2至3代，待乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024達到10⁸cfu/ml以上活菌數(shù)時，4000rpm下離心20min，去除上清液后，在無菌環(huán)境下依次加入緩沖液和冷凍保護劑，待細胞濃度為10⁹cfu/ml時，真空冷凍干燥處理，所得即為乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑。

(2)酸奶制備

向原料乳中加入10％的蔗糖并攪拌溶解，在20mpa下進行均質(zhì)，再按照乳體積計4％向乳中接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑；所述三種菌株的體積比為1:1:1，在37℃下進行發(fā)酵至滴定酸度為75°t，即得所述的酸奶。

(2)gc-ms測酸奶發(fā)酵過程中己酸含量

氣相色譜條件為：rtx-wax毛細管柱；柱子規(guī)格：30m×0.25mm×0.25mm，進口溫度為250℃，分流比5，柱流速1ml/min，載氣為氦氣；程序升溫：初始溫度40℃，保持3min；10℃/min升溫至90℃；5℃/min升溫至200℃，保持5分鐘。

質(zhì)譜條件為：離子化方式ei，發(fā)射能量為70ev，發(fā)射電流為200μa，檢測器電壓為1.4kv，離子源溫度250℃，接口溫度230℃，四級桿溫度：150℃，質(zhì)荷比30-500?；衔餀z索結(jié)果與nist和varian2個標準譜庫進行匹配，相似度達到80％以上確認為目的化合物。以10μl的0.2mg/ml癸酸乙酯為內(nèi)標，計算己酸含量。

(3)發(fā)酵過程中ph值含量變化

發(fā)酵過程中ph值變化如表1所示，由表可知，9h時e207和mc10發(fā)酵酸奶的ph值分別為4.66和4.68，乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024為4.22，大于市售酸奶油中的乳酸乳球菌乳酸亞種，故乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的產(chǎn)酸能力較強。其中e207和mc10的使用方法為本應(yīng)用實施例步驟(2)的方法，將e207或mc10直接替換等量替換乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑。

表1不同發(fā)酵時間段ph值變化

注：不同字母表示同一列間的差異性(p﹤0.05)

(4)發(fā)酵過程中己酸的變化

發(fā)酵過程中己酸含量變化如表2所示。由表可知，乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在各個發(fā)酵時間段內(nèi)己酸產(chǎn)量都較高，18h時為22.13μg/kg，而e207和mc10分別為14.58μg/kg和9.83μg/kg，故乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024產(chǎn)己酸的能力強于市售的乳酸乳球菌乳酸亞種。

表2不同發(fā)酵時間段己酸產(chǎn)量

注：不同字母表示同一列間的差異性(p﹤0.05)

應(yīng)用實施例2：乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024發(fā)酵酸奶油

(1)酸奶油制備

脂肪標準化，即調(diào)整稀奶油的脂肪含量為20％，78℃下巴氏殺菌30min或85℃下高溫短時殺菌30s，在18mpa，60℃條件下均質(zhì)，冷卻到25℃，投入2％的應(yīng)用實施例1中制備的乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑，25℃下發(fā)酵18h，可滴定酸度以乳酸計在0.8，ph在4.50時為發(fā)酵終點，凝乳后放在4℃下過夜放置，并保持30h，即得所述的酸奶油。

(2)gc-ms測酸奶油發(fā)酵過程中己酸含量

氣相色譜條件為：rtx-wax毛細管柱；柱子規(guī)格：30m×0.25mm×0.25mm，進口溫度為250℃，分流比5，柱流速1ml/min，載氣為氦氣；程序升溫：初始溫度40℃，保持3min；10℃/min升溫至90℃；5℃/min升溫至200℃，保持5分鐘。

質(zhì)譜條件為：離子化方式ei，發(fā)射能量為70ev，發(fā)射電流為200μa，檢測器電壓為1.4kv，離子源溫度250℃，接口溫度230℃，四級桿溫度：150℃，質(zhì)荷比30-500。化合物檢索結(jié)果與nist和varian2個標準譜庫進行匹配，相似度達到80％以上確認為目的化合物。以10μl的0.2mg/ml癸酸乙酯為內(nèi)標，計算己酸含量。

(3)發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量

采樣頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行檢測，將乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024制備的酸奶油置于頂空固相微萃取小瓶中，測其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化。

(4)發(fā)酵過程中己酸含量變化

發(fā)酵過程中己酸含量變化如表3所示。由表3可知，乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024在各個發(fā)酵時間段內(nèi)己酸產(chǎn)量都較高，18h時為9.64μg/kg，而e207和mc10分別為0μg/kg和2.38μg/kg，故乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024產(chǎn)己酸的能力強于市售的乳酸乳球菌乳酸亞種，感官評定結(jié)果如圖3所示，乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024發(fā)酵的酸奶油具有較強的乳香味，受到評定員的喜歡。其中e207和mc10的使用方法為本應(yīng)用實施例步驟(1)的方法，將e207或mc10直接替換等量替換乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的發(fā)酵劑。

表3不同發(fā)酵時間己酸產(chǎn)量

注：不同字母表示同一列間的差異性(p﹤0.05)

(5)發(fā)酵過程中酸價的變化

發(fā)酵過程中酸價變化如表4所示，由表可知，18h時e207和mc10的酸價分別為4.36和4.10，乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024為5.33，大于市售酸奶油中的乳酸乳球菌乳酸亞種，故乳酸乳球菌乳酸亞種cgmccno.14024的脂肪代謝能力較強。

表4不同發(fā)酵時間酸價變化

注：不同字母表示同一列間的差異性(p﹤0.05)。