本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及葉片原生質(zhì)體的制備，具體涉及一種千層塔(huperziaserrata(thunb.)trev.)葉片原生質(zhì)體的制備方法。
背景技術(shù)：
植物原生質(zhì)體培養(yǎng)是植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的組成部分，是隨著組織培養(yǎng)的不斷發(fā)展而發(fā)展起來的。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)是將除去細(xì)胞壁裸露的原生質(zhì)體于無菌條件下，在合適的培養(yǎng)基中和條件下培養(yǎng)的一種技術(shù)，是開展轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)。另外，原生質(zhì)體作為一個(gè)單細(xì)胞系統(tǒng)，是研究細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞壁再生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞器攝入、病毒侵染機(jī)理等基礎(chǔ)理論的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系。植物原生質(zhì)體的研究始于1960年，當(dāng)時(shí)cocking用酶法分離番茄根原生質(zhì)體獲得成功，隨后，1971年nagata等首次以煙草葉片為材料分離原生質(zhì)體，并培養(yǎng)獲得再生植株，截至目前，至少有46個(gè)科160余屬360多種植物(包括變種和亞種)的原生質(zhì)體的再生體系得以建立。
千層塔(huperziaserrata(thunb.)trev.)為石松目(lycopodiales)石杉科(lycopodiaceae)石杉屬(lycopodiuml.)多年生草本蕨類植物。千層塔始載于《植物名實(shí)圖考》，性味辛苦、平。具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效。1927年我國科技工作者報(bào)道了從該植物中分離的石杉?jí)A甲具有橫紋肌松弛作用，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)石杉?jí)A甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑?，F(xiàn)在，被石杉?jí)A甲及經(jīng)作為治療阿爾茨海默病(ad，alzheimerdisease)的藥物，同時(shí)在美國被用做益智的營養(yǎng)保健品。
但是，千層塔自然資源嚴(yán)重短缺。千層塔生長緩慢，野生狀態(tài)下千層塔的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發(fā)周期長，萌發(fā)后屬地下生配子體，需6-15年才能成熟。因此極大地限制了千層塔野生資源的再生。千層塔中的石杉?jí)A甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉?jí)A甲步驟繁瑣、價(jià)格昂貴且有副作用。目前，石杉?jí)A甲的提取主要依賴于野生資源，提取率僅為0.006％-0.1％，因而大量的市場需求、受限的自然資源和自身生長繁殖的限制。因此，不論是石杉?jí)A甲直接或者間接獲得都是以千層塔的原植物為原料，這種自然界有限的資源將處于滅絕的邊緣。千層塔在人工培育和繁殖方面最大的問題是：內(nèi)生菌污染嚴(yán)重、生長緩慢和石杉?jí)A甲的含量低，而通過原生質(zhì)體的培養(yǎng)是解決這三類問題的重要途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種千層塔葉片原生質(zhì)體的制備方法，可用于千層塔原生質(zhì)體的制備和細(xì)胞融合。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：
一種千層塔葉片原生質(zhì)體的制備方法，包括：將千層塔葉片經(jīng)含有抗壞血酸和甘露醇的ms固體培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)后的千層塔葉片再經(jīng)預(yù)酶解及低壓再酶解即得千層塔原生質(zhì)體。
具體的，ms固體培養(yǎng)基中抗壞血酸的含量是200～500mg/l。
具體的，ms固體培養(yǎng)基中甘露醇的含量是0.5～1.0mol/l。
更具體的，所述的低壓再酶解是將葉片在壓力為30～60kp的酶解液中進(jìn)行酶解，酶解液的加入量為每克葉片添加10ml酶解液，酶解的時(shí)間是1-3小時(shí)。
最好的，所述的預(yù)酶解是將葉片在酶解液中酶解，酶解時(shí)間為2小時(shí)，酶解液的加入量為每克葉片添加10ml酶解液。
詳細(xì)的，所述的預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為2天，預(yù)培養(yǎng)的溫度為2℃，預(yù)培養(yǎng)的條件為黑暗條件。
還有，在千層塔葉片進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之前，還需對千層塔葉片進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理包括：
將千層塔葉片依次經(jīng)水、體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為5％的naocl溶液及體積分?jǐn)?shù)為7％的過氧化氫溶液浸泡后即可。
另外，所述的千層塔葉片在體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇溶液中浸泡1min，千層塔葉片在體積分?jǐn)?shù)為5％的naocl溶液浸泡15min，千層塔葉片在體積分?jǐn)?shù)為7％的過氧化氫溶液浸泡10min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：
本發(fā)明的千層塔葉片原生質(zhì)體制備的方法，通過將千層塔葉片經(jīng)過含有vc和甘露醇的培養(yǎng)基上預(yù)處理之后，再經(jīng)過酶解液體預(yù)培養(yǎng)，最后經(jīng)過在低壓環(huán)境的酶液處理，最終獲得千層塔原生質(zhì)體，和常規(guī)的單純酶解方法相對比，顯原生質(zhì)體的得率和活力分別提高到3.5和2.3倍。該方法可用于千層塔原生質(zhì)體的制備和細(xì)胞融合。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明以獲得并提高千層塔的原生質(zhì)體的得率為目的，在傳統(tǒng)的原生質(zhì)體制備基礎(chǔ)之上通過化學(xué)試劑和低壓的合理結(jié)合，顯著提高千層塔葉片原生質(zhì)體的得率和活力。該方法為千層塔無菌培養(yǎng)體系的建立以及后期的體細(xì)胞雜交育種奠定基礎(chǔ)。
一種千層塔葉片原生質(zhì)體制備的方法，按以下步驟進(jìn)行：
步驟一，千層塔葉片的表面消毒
取千層塔幼嫩葉片(生長旺盛，無卷曲，顏色無黃色或黑褐色斑點(diǎn)，理論上所有的千層塔葉片都可以，選取幼嫩葉片生長旺盛)，用流水沖洗干凈，用體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇溶液浸泡1分鐘，倒掉乙醇，然后用體積分?jǐn)?shù)為5％的naocl溶液浸泡15分鐘后取出，倒掉naocl溶液，換用體積分?jǐn)?shù)為7％的過氧化氫溶液浸泡，放置10分鐘后取出，倒掉過氧化氫溶液，用無菌水沖洗干凈，備用。
步驟二，千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有200-500mg/l抗壞血酸和0.5-1.0mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
步驟三，千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
將預(yù)處理好的葉片轉(zhuǎn)移到酶解液體中(酶解液的比例為每克葉片碎片添加10ml)，在室溫下?lián)u床中預(yù)酶解2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。將經(jīng)過預(yù)酶解的千層塔葉片放置到低壓容器中酶解，酶解的時(shí)間為1-3小時(shí)，酶解時(shí)的大氣壓力為30-60kp。
步驟四，千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。
千層塔葉片原生質(zhì)體得率和活力的測定：
千層塔葉片原生質(zhì)體得率測定：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)獲取的原生質(zhì)體數(shù)量。以每克鮮重葉片酶解分離得到原生質(zhì)體的個(gè)數(shù)(個(gè)/g)來表示產(chǎn)量。
千層塔葉片原生質(zhì)體活力測定：用熒光素雙醋酸酯(fda)染色法來測定原生質(zhì)體的活力率。用有活力的原生質(zhì)體占全部觀察原生質(zhì)體的百分比(原生質(zhì)體活力率)來衡量獲取樣品中原生質(zhì)體的活力，即:
原生質(zhì)體活力率＝被染色的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100％
這里的各成分是按照每升液體計(jì)算的，ms是組織培養(yǎng)中比較常規(guī)的培養(yǎng)基，固體ms培養(yǎng)基，在上述成分中添加瓊脂粉；
酶解液體成分是：質(zhì)量百分濃度1.5％onozukar-10、質(zhì)量百分濃度2.5％macerozymer-10、0.4％葡聚糖硫酸鉀、5.0mmol/lcacl2、0.65mol/l甘露醇，ph＝5.8，用微孔濾膜(0.22μl)過濾除菌。
原生質(zhì)體洗劑液成分是：酶解液體成分中除去onozukar-10和macerozyme，其它成分和除菌方式不變。
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1(對照1)：
1、千層塔葉片的表面消毒
取千層塔幼嫩葉片，用流水沖洗干凈，用體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇溶液浸泡1分鐘，倒掉乙醇，然后用體積分?jǐn)?shù)為5％的naocl溶液浸泡15分鐘后取出，倒掉naocl溶液，換用體積分?jǐn)?shù)為7％的過氧化氫溶液浸泡，放置10分鐘后取出，倒掉過氧化氫溶液，用無菌水沖洗干凈，備用。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有0.5mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
將預(yù)處理好的葉片轉(zhuǎn)移到酶解解液體中(酶解液的比例為每克葉片碎片添加10ml)，在室溫下?lián)u床中預(yù)酶解2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是2×105個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是55％。
實(shí)施例2(對照2)：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有0.75mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
與實(shí)施例1相同。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是8×105個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是62％。
實(shí)施例3(對照3)：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有1.0mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
與實(shí)施例1相同。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是3×105個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是39％。
實(shí)施例4：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有200mg/l抗壞血酸和0.75mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
與實(shí)施例1相同。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是5×105個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是65％。
實(shí)施例5：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有350mg/l抗壞血酸和0.75mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
與實(shí)施例1相同。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是8×105個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是82％。
實(shí)施例6：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
取表面消毒的千層塔葉片，在無菌操作臺(tái)上將葉片切割成1mm2的小片，再轉(zhuǎn)接到含有500mg/l抗壞血酸和0.75mol/l甘露醇的ms固體培養(yǎng)基上，然后將其放入4℃和黑暗的條件下培養(yǎng)2天。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
與實(shí)施例1相同。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是2×105個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是71％。
實(shí)施例7：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
與實(shí)施例6相同。。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
將預(yù)處理好的葉片轉(zhuǎn)移到酶解解液體中(酶解液的比例為每克葉片碎片添加10ml)，在室溫下?lián)u床中預(yù)酶解2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。將經(jīng)過預(yù)酶解的千層塔葉片放置到低壓容器中酶解，酶解的時(shí)間為1小時(shí)，酶解時(shí)的大氣壓力為30kp。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是5×106個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是66％。
實(shí)施例8：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
與實(shí)施例6相同。。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
將預(yù)處理好的葉片轉(zhuǎn)移到酶解解液體中(酶解液的比例為每克葉片碎片添加10ml)，在室溫下?lián)u床中預(yù)酶解2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。將經(jīng)過預(yù)酶解的千層塔葉片放置到低壓容器中酶解，酶解的時(shí)間為3小時(shí)，酶解時(shí)的大氣壓力為50kp。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是7×106個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是76％。
實(shí)施例9：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
與實(shí)施例6相同。。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
將預(yù)處理好的葉片轉(zhuǎn)移到酶解解液體中(酶解液的比例為每克葉片碎片添加10ml)，在室溫下?lián)u床中預(yù)酶解2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。將經(jīng)過預(yù)酶解的千層塔葉片放置到低壓容器中酶解，酶解的時(shí)間為2小時(shí)，酶解時(shí)的大氣壓力為50kp。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是8×106個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是80％。
實(shí)施例10：
1、千層塔葉片的表面消毒
與實(shí)施例1相同。
2、千層塔葉片的預(yù)處理
與實(shí)施例6相同。
3、千層塔葉片原生質(zhì)體的制備
將預(yù)處理好的葉片轉(zhuǎn)移到酶解解液體中(酶解液的比例為每克葉片碎片添加10ml)，在室溫下?lián)u床中預(yù)酶解2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。將經(jīng)過預(yù)酶解的千層塔葉片放置到低壓容器中酶解，酶解的時(shí)間為2小時(shí)，酶解時(shí)的大氣壓力為60kp。
4、千層塔葉片原生質(zhì)體的收集
將經(jīng)過酶解的原生質(zhì)體懸浮液用200目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再用原生質(zhì)體洗劑液懸浮，再在500轉(zhuǎn)/分鐘下離心，收集沉淀的底部的原生質(zhì)體，如此收集，懸浮，離心，重復(fù)三次，最后獲得較純的原生質(zhì)體。千層塔葉片原生質(zhì)體得率是7×106個(gè)/g、原生質(zhì)體活力是77％。