本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)基，特別是涉及一種成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：皮膚組織工程是近幾年的研究熱點。但是皮膚的相關(guān)細(xì)胞都屬于終末分化細(xì)胞，很難在體外進行大規(guī)模的培養(yǎng)擴增，同時種子細(xì)胞的來源問題也阻礙了皮膚組織工程的發(fā)展。由于自體的種子細(xì)胞來源有限，異體的種子細(xì)胞存在排斥反應(yīng)，干細(xì)胞又存在倫理問題，因此從尿液中收集尿液細(xì)胞，將尿液細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)，ips細(xì)胞再誘導(dǎo)成為角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞等，即可解決皮膚組織工程的種子來源問題，且從尿液中獲得細(xì)胞，方便快捷，不用通過創(chuàng)傷獲取，來源廣泛。但是，目前的采用的將ips細(xì)胞誘導(dǎo)成為成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基，如MEF培養(yǎng)基的分化概率較低，難以滿足實際需求，且含有血清，會帶來動物源性病原體風(fēng)險，影響臨床應(yīng)用的安全性。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種不含血清，安全性高，且提高誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化比例的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基。一種成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液和添加物，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為體積比為1:0.5～2的H-DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液；以在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的添加量計，所述添加物包括如下組分：在其中一個實施例中，所述添加物包括如下組分：在其中一個實施例中，所述添加物還包括抗生素。在其中一個實施例中，所述抗生素包括在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加量為0.05～0.2mg/mL的青霉素以及在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加量為0.05～0.2mg/mL的鏈霉素。在其中一個實施例中，所述添加物還包括自由基清除劑。在其中一個實施例中，所述自由基清除劑為在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加量為0.05～0.2mmol/L的β-巰基乙醇。本發(fā)明還提供所述的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：按所述體積比混合H-DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液，得所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液；將所述胰島素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、非必需氨基酸、谷氨酰胺衍生物、成纖維細(xì)胞生長因子、雌二醇、黃體酮、8-溴環(huán)磷腺苷，人卵泡刺激素添加至所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，即可。本發(fā)明還提供所述的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為成纖維細(xì)胞的方法，包括如下步驟：采用mTeSR1培養(yǎng)基對誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞進行培養(yǎng)，當(dāng)匯合度為75～85％時，消化為單細(xì)胞；取適量所述單細(xì)胞，以EB擬胚體形成培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，形成擬胚體；將所述擬胚體接種至所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得成纖維細(xì)胞。在其中一個實施例中，所述擬胚體的培養(yǎng)條件為：采用CO2濃度為5～7％，溫度為37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～50h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基，在H-DMEM和F12培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，添加特定的添加物，其中，堿性成纖維細(xì)胞因子是一種能促進中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞分裂的多肽，和胰島素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、非必需氨基酸、谷氨酰胺衍生物、成纖維細(xì)胞生長因子、雌二醇、黃體酮、8-溴環(huán)磷腺苷重新組成一種組合物主要是傳遞發(fā)育信號的作用，能促進擬胚體的中胚層細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞。由此本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)提高誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化的比例，并且能夠穩(wěn)定傳代，提高細(xì)胞的增殖速度，為皮膚組織工程提供成纖維細(xì)胞的種子細(xì)胞來源。同時整個過程沒有用到血清，有效的避免了動物源性病原體帶來的風(fēng)險，提高了臨床應(yīng)用的安全性。該培養(yǎng)基還可以通過添加特定的抗生素和自由基清除劑，有效抑制培養(yǎng)過程中細(xì)菌的產(chǎn)生并清除積累的氧自由基，以維持較優(yōu)的培養(yǎng)環(huán)境，提高細(xì)胞的成活率。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例的實驗組和對比組出現(xiàn)細(xì)胞形變所需天數(shù)的對比圖；圖2為顯微鏡下觀察實驗組和對比組的免疫熒光I型膠原的表達；圖3為實施例1中實驗組和對比組中的成纖維細(xì)胞增值速度比較；圖4為實施例2中實驗組和對比組中的成纖維細(xì)胞增值速度比較；圖5為實施例3中實驗組和對比組中的成纖維細(xì)胞增值速度比較。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基及其制備方法作進一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明實施例中采用的H-DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液、mTeSR1培養(yǎng)基、EB擬胚體形成培養(yǎng)基均為市售產(chǎn)品。實施例1一、設(shè)計實驗組和對照組：1.實驗組培養(yǎng)基：實驗組培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液和添加物，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為體積比為1:1的H-DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液，總體積為500mL；以在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的添加量計，所述添加物包括如下組分：配制方法：按照上述比例在500mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入胰島素30mg，氫化可的松0.2mg，轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg，亞硒酸鈉5μg，β-巰基乙醇0.05mmoL，NEAA5mL，GlutaMAX5mL，青霉素50mg，鏈霉素50mg，bFGF7.5μg，E25nmoL，P40.5mmoL，8-溴-cAMP0.5mmoL，人卵泡刺激素FSH50nmoL，即可。2.對照組培養(yǎng)基對照組采用現(xiàn)有的MEF培養(yǎng)液500mL，并在其中加入10mLFBS。二、體外誘導(dǎo)ips向成纖維細(xì)胞分化(1)復(fù)蘇細(xì)胞：選擇P30的ips細(xì)胞進行復(fù)蘇，然后用mTeSR1培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，當(dāng)達到80％匯合度時，用Accutase消化液消化為單細(xì)胞，計數(shù)。(2)簡單擬胚體的形成：每個AggreWellTM800培養(yǎng)板孔中加入1×106個上述單細(xì)胞，然后加入EB增菌液形成培養(yǎng)基，按產(chǎn)品使用操作手冊，將AggreWellTM800培養(yǎng)板低速離心700r/min，5min，放入5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后形成簡單擬胚體。(3)誘導(dǎo)分化：將形成簡單擬胚體轉(zhuǎn)移至低吸附24孔板中，24孔板分為兩組，實驗組和對照組，每組12孔，實驗組用實驗組培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組用對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，記錄第幾天細(xì)胞出現(xiàn)變形(結(jié)果如圖1所示)。挑出變形細(xì)胞團，用免疫熒光方法鑒定成纖維細(xì)胞，確定形變的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞后再連續(xù)培養(yǎng)，每次傳代都進行細(xì)胞計數(shù)，比較細(xì)胞的增殖速度。三、成纖維細(xì)胞的鑒定用免疫熒光鑒定成纖維細(xì)胞I型膠原的抗原表達：1.誘導(dǎo)15天后，實驗組、對照組分別將培養(yǎng)基棄去，用PBS洗三遍，每次5min。2.每孔加入4％多聚甲醛1mL固定1h，用PBS洗三遍，每次5min。3.0.1％Triton破膜10min，用PBS洗三遍，每次5min。4.棄去PBS，實驗組、對照組分別加入兔抗人I型膠原(1：50)500μl，4℃濕盒孵育過夜。5.用PBS洗三遍，每次5min。實驗組、對照組分別加入二抗羊抗兔抗IgG(1:200)500μL，室溫避光孵育1h。6.用PBS洗三遍，每次5min。7.50％甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，同時對發(fā)出熒光的細(xì)胞進行計數(shù)，結(jié)果如圖3所示。實施例2本實施例一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)成成纖維細(xì)胞的方法，其方法同實施例1中的步驟二，區(qū)別在于：采用的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液和添加物，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為體積比為1:2的H-DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液，總體積為500mL；以在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的濃度計，所述添加物包括如下組分：成分名稱工作濃度NEAA0.5％v/vGlutaMAX2％v/v胰島素1μg/mL氫化可的松1μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白150μg/mL亞硒酸鈉5ng/mLβ-巰基乙醇0.2mmol/L青霉素0.2mg/mL鏈霉素0.05mg/mLbFGF10ng/mLE25nmol/LP40.5mmol/L8-溴-cAMP0.5mmol/LFSH150nmol/L培養(yǎng)所得成纖維細(xì)胞的鑒定方法同實施例1中的步驟三，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果與圖2類似，對發(fā)出熒光的細(xì)胞進行計數(shù)，結(jié)果如圖4所示。實施例3本實施例一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)成成纖維細(xì)胞的方法，其方法同實施例1中的步驟二，區(qū)別在于：采用的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液和添加物，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為體積比為1:0.5的H-DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液，總體積為500mL；以在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的濃度計，所述添加物包括如下組分：成分名稱工作濃度NEAA2％v/vGlutaMAX0.5％v/v胰島素10μg/mL氫化可的松0.1μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白50μg/mL亞硒酸鈉15ng/mLβ-巰基乙醇0.05mmol/L青霉素0.05mg/mL鏈霉素0.2mg/mLbFGF20ng/mLE215nmol/LP42mmol/L8-溴-cAMP2mmol/LFSH50nmol/L培養(yǎng)所得成纖維細(xì)胞的鑒定方法同實施例1中的步驟三，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果與圖2類似，對發(fā)出熒光的細(xì)胞進行計數(shù)，結(jié)果如圖5所示。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3