本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)cPGCs的完全培養(yǎng)基以及其使用方法。

背景技術(shù)：

原始生殖細(xì)胞細(xì)胞(Primordial Germ Cells,PGCs)是配子的前體并且是繁殖的中心。生殖細(xì)胞譜系的精確自我更新是生育和繁殖成功的基礎(chǔ)。在禽類物種中，PGCs在胚胎發(fā)生期間比在哺乳動物中更早形成,在雌性中它最終發(fā)育為卵細(xì)胞,在雄性中最終發(fā)育為精子。在胚胎中的遷移途徑—通過血液循環(huán)后移植入性腺,使它能成為冷凍保種的目標(biāo)細(xì)胞,同時(shí)成為轉(zhuǎn)基因禽類制備中的良好載體。由于PGCs能夠發(fā)育成為有功能的配子,它作為載體攜帶外源基因,制造性腺嵌合體乃至制備轉(zhuǎn)基因動物,具有較高的研究價(jià)值。

目前在雞原始生殖細(xì)胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)的培養(yǎng)中大量采用有血清、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系培養(yǎng)，而這種培養(yǎng)體系存在一定的缺陷，如何獲得一種更方便、無不明確物質(zhì)成分的體外培養(yǎng)方法顯然成為cPGCs培養(yǎng)的關(guān)鍵。血清是一種成分極其復(fù)雜的外源物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用中無法確定是血清中何種組分影響了細(xì)胞行為。飼養(yǎng)層細(xì)胞是指一些特定細(xì)胞經(jīng)有絲分裂阻斷劑處理后得到的細(xì)胞單層。目前所采用的飼養(yǎng)層主要有STO細(xì)胞株、雞胚胎原代成纖維細(xì)胞(PCEF)、性腺基質(zhì)細(xì)胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纖維細(xì)胞(PMEF)等，均能不同程度促進(jìn)細(xì)胞增殖和分泌白血病抑制因子(LIF)以及產(chǎn)生其他分泌物以抑制其分化。由于這些分泌物質(zhì)成分尚不清楚，在研究細(xì)胞分化的分子機(jī)制方面產(chǎn)生一定的干擾；在基因修飾的研究中，需要通過藥物篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的cPGCs，通常采用含有抗性基因的飼養(yǎng)層來進(jìn)行培養(yǎng)篩選，而這種有飼養(yǎng)層體系的培養(yǎng)將實(shí)驗(yàn)復(fù)雜化，增加了實(shí)驗(yàn)的操作難度，且藥物篩選后對飼養(yǎng)層造成的破壞也會影響細(xì)胞生長；另一方面，這些細(xì)胞需要絲裂霉素處理阻斷其有絲分裂后用作飼養(yǎng)層細(xì)胞，即使是極其微量的絲裂霉素殘留也會對cPGCs細(xì)胞的生長造成影響；非禽類的異源細(xì)胞用作飼養(yǎng)層飼養(yǎng)時(shí)，也會對cPGCs細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響；動物源性的血清和飼養(yǎng)層細(xì)胞的污染物會污染細(xì)胞自身的應(yīng)用。此外，飼養(yǎng)層的使用以及血清的添加也一定程度的延長了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，增加了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的投入。

因此，建立cPGCs無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系可以為以后在胚胎發(fā)育基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)基因禽類生產(chǎn)、藥物篩選、家禽育種等方面提供巨大貢獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種培養(yǎng)cPGCs的完全培養(yǎng)基以及其使用方法，其具有成分明確、方便操作、減少污染、降低成本、避免細(xì)胞受損等優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣闊。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種培養(yǎng)cPGCs的完全培養(yǎng)基，包括KO-DMEM、B-27supplement、NAA、nucleosides、GlutaMAX II、β-巰基乙醇、卵清蛋白、OVT、肝素鈉、Activin A、TGF-β1、BMP4、FGF-2、IGF-1。

進(jìn)一步，以KO-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加20-30ng/ml的BMP4、20-30ng/ml的TGF-β1、20-30ng/ml的Activin A、5-20ng/ml的OVT、1-5ng/ml的FGF-2。

進(jìn)一步，以KO-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括其1-2％的50X B-27supplement、1％的100X NAA、1％的100X nucleosides、2.0mM GlutaMAX II、0.1mMβ-巰基乙醇、1-2％卵清蛋白、0.5％-2％肝素鈉，均為體積比。

進(jìn)一步，還含有以KO-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，體積比0.5％-2％的三抗，所述三抗由青霉素、鏈霉素、兩性霉素B組成。

一種培養(yǎng)cPGCs的完全培養(yǎng)基的使用方法，包括以下步驟：

(1)采集的14HH雞胚血液置入含有cPGCs完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)10-15d即可純化細(xì)胞；

(2)將純化后cPGCs細(xì)胞重新置入cPGCs完全培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增；

(3)對體外培養(yǎng)擴(kuò)增的cPGCs進(jìn)行計(jì)數(shù)、間接免疫熒光檢測，包括SSEA-1和DAZL表面標(biāo)記。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明打破了有血清、有飼養(yǎng)層的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基的成分明確，便于研究細(xì)胞分化的分子機(jī)制。

(2)本發(fā)明避免了異源細(xì)胞作為飼養(yǎng)層后產(chǎn)生的不利影響。

(3)本發(fā)明避免了制備飼養(yǎng)層時(shí)一些藥物殘留，降低了對細(xì)胞的不良影響。

(4)本發(fā)明不需要培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞，降低了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的污染風(fēng)險(xiǎn)。

(5)本發(fā)明簡化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)省了時(shí)間。

(6)本發(fā)明一定程度上的降低了實(shí)驗(yàn)開支。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，在附圖中：

圖1是cPGCs在無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)圖；

圖2是放大100倍的cPGCs在無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)圖；

圖3是放大200倍的cPGCs在無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)圖

圖4是無血清、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下的cPGCs的生長曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

如圖1至圖4所示，本發(fā)明所述一種培養(yǎng)cPGCs的完全培養(yǎng)基以及其使用方法。

一、cPGCs完全培養(yǎng)基的配制

cPGCs完全培養(yǎng)液的配方包括86.9％Ko-DMEM、1％B-27supplement、1％100X NEAA、1％nucleosides、1％肝素鈉、1％OVT、1％TGF-β1、1％GlutaMAX II、1％BMP4、0.1％β-巰基乙醇、1％Activin A、1％IGF-1、1％FGF-2、1％三抗、1％卵清蛋白，均為體積比。

各種因子的添加無嚴(yán)格的順序，在常溫操作即可，配制的過程無需加熱，但培養(yǎng)基整個(gè)配制過程需在無菌條件下進(jìn)行。

KO-DMEM：Knock out-DMEM一種胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，NAA：非必需氨基酸；Nucleosides：核酸；GlutaMAX II：β-谷氨酰胺。

B-27supplement是無血清培養(yǎng)基添加因子，通常用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長和保持其短期或長期活性，利于細(xì)胞的增值和自我更新；OVT是卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，主要作用為提供細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，同時(shí)OVT能與Fe³⁺形成穩(wěn)定的配合物，清除Fe³⁺，抑制自由基產(chǎn)生的細(xì)胞毒性；肝素鈉，與生長因子協(xié)同作用，同時(shí)抗凝血；Activin A即激活素A，是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β家族的一種分泌蛋白，可控制胚胎軸發(fā)育為有功能的前腸源性組織，調(diào)解多種細(xì)胞的生長和分化；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是具有多功能生物活性的細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、衰老、粘附等；類胰島素生長因子(insulin-like growth factor I，IGF-1)是肝細(xì)胞合成和分泌的一種重要生長刺激因子，在細(xì)胞增殖、分裂及凋亡過程中發(fā)揮重要影響；成纖維細(xì)胞生長因子-2((fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2)是一個(gè)有效的促細(xì)胞分裂劑，可增加細(xì)胞的體外增殖能力，獲得更多的細(xì)胞數(shù)量，這種作用在低細(xì)胞密度時(shí)更明顯，F(xiàn)GF-2也可維持cPGCs的體外多分化潛能；骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4，BMP4)是一種多功能的細(xì)胞因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族，由早期胚胎外胚層釋放，對生殖細(xì)胞的發(fā)育和功能發(fā)揮起著重要作用。

其中，非必需氨基酸(NAA)、B-27supplement、β-巰基乙醇、肝素鈉、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OVT)、卵清蛋白均購自Sigma公司；核苷(Nucleosides)購自Millipore公司；

二、cPGCS的無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)

(1)胚血注射至含cPGCs無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的48孔板中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(2)培養(yǎng)至第十天，取培養(yǎng)板中的細(xì)胞至500μL的離心管中，3000rpm離心5min，棄上清，以去除血細(xì)胞，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至48孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

三、cPGCs的鑒定

1.cPGCs形態(tài)觀察

如圖1至3所示，倒置熒光顯微鏡下觀察無飼養(yǎng)層cPGCs，放大100倍、200倍觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.cPGCs的免疫熒光染色鑒定

(1)取第2代的cPGCs，3000rpm離心5min，棄上清，含5％FBS的PBS重懸細(xì)胞，3000rpm離心5min，棄上清；

(2)分別加入一抗(鼠抗SSEA-1，1:2000和兔抗DAZL，1：100)，4℃避光過夜，3000rpm離心5min，棄上清，含5％FBS的PBS重懸細(xì)胞，3000rpm離心5min，棄上清；

(3)分別加入FITC標(biāo)記的二抗(羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，1：500)，37℃避光孵育30min，3000rpm離心5min，棄上清，含5％FBS的PBS重懸細(xì)胞，3000rpm離心5min，棄上清；

(4)加入1μg/mL DAPI避光復(fù)染5min，3000rpm離心5min，棄上清；加入抗熒光淬滅劑，倒置熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

四、cPGCs的生長曲線的繪制

(1)取第2代的cPGCs細(xì)胞，(密度為1.0×10⁶個(gè)/mL)于24孔板中，置于37.5℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(2)每2d抽取3個(gè)孔計(jì)數(shù)，每孔計(jì)3次數(shù)取平均值，持續(xù)11d；繪制生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，如圖4所示。

最后應(yīng)說明的是：以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換，但是凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。