本發(fā)明涉及一種類角膜內皮細胞的獲取方法，屬于細胞生物技術領域。

背景技術：

角膜內皮細胞是一個有規(guī)律六邊形排列的單層細胞，是角膜基質與房水前房隔開的生理屏障，并在保持角膜透明度方面發(fā)揮關鍵作用。角膜內皮細胞減少或損傷的原因有：①隨著年齡的增加逐漸減少；②感染、炎癥、外傷(如機械傷、化學傷、產(chǎn)傷、激光射線等)、眼部手術(如白內障手術，抗青光眼手術，及其他眼內操作如前房異物取出等)、遺傳性疾病、代謝性疾病等都可引起內皮細胞的減少和損傷。因為成體角膜內皮細胞沒有增殖能力，受損后主要依賴損傷區(qū)周邊細胞的擴展和移行進行修復，當角膜內皮細胞的密度變得極低，內皮細胞障礙物和泵的功能將不足以維持適當?shù)幕|水合作用，導致角膜失代償或大皰性角膜病變或角膜水腫，患者視力受損并最終視力喪失。

臨床上，角膜移植是治療人類角膜內皮細胞疾病唯一有效的療法。但是角膜供體來源匱乏是全世界面臨的難題，極大地限制了角膜移植手術的開展，使眾多角膜病患者不能得到及時醫(yī)治，只能在痛苦中等待角膜材料，帶來極大的社會負擔。近年來，隨著角膜移植技術的進步，Descemet膜技術(DMEK)的開發(fā)，即只有角膜內皮和Descemet膜來實現(xiàn)良好的視力恢復技術。然而，這種療法顯著限制于角膜內皮細胞捐贈來源的短缺。因此，基于干細胞的技術被認為是替代治療人角膜內皮細胞缺失引起的疾病的一種很有前途的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供了體外分化人類多能干細胞獲取類角膜內皮細胞的方法。

本發(fā)明還提供了體外分化獲取的類角膜內皮細胞的鑒定指標。

為實現(xiàn)上述技術目的，達到上述技術效果，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：

類角膜內皮細胞的獲取方法，步驟如下：

(1)擬胚體的獲?。簩⑷祟惻咛ジ杉毎囵B(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細胞上，用膠原酶Ⅳ和DispaseII鋪滿培養(yǎng)器皿進行消化后，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，以獲取擬胚體；

(2)預分化培養(yǎng)：將步驟(1)獲取的擬胚體采用補充了頭蛋白和TGF-β1受體抑制劑的分化培養(yǎng)基A中培養(yǎng)4～5天或分化培養(yǎng)基B中培養(yǎng)12～16天，即獲得預分化培養(yǎng)中間細胞；

(3)分化培養(yǎng)：將步驟(2)預分化培養(yǎng)后中間細胞轉移至包被了硫酸軟骨素和層粘連蛋白的培養(yǎng)器皿中，采用分化培養(yǎng)基C培養(yǎng)7～8天或采用分化培養(yǎng)基D培養(yǎng)25～40天，即獲得類角膜內皮細胞。

步驟(1)中所述的膠原酶Ⅳ和中性蛋白酶DispaseII的配比是1：1～5，其中配置前，膠原酶Ⅳ的濃度為400-1000U/mL，中性蛋白酶DispaseII的濃度為1～6U/mL；

無血清培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加了10％～20％的血清替代物，10～20ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM的GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL的青-鏈雙抗，0.1mM的β-巰基乙醇；

所述的步驟(2)中補充頭蛋白后的濃度是300～1000ng/mL；補充TGF-β1受體抑制劑后的濃度是2.5～15μM。

步驟(2)中所述分化培養(yǎng)基A：基礎培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基，添加了1×N2添加劑，10～20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL青-鏈雙抗，2～10ng/mL重組人胰島素；

分化培養(yǎng)基B：基礎培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基，按質量比添加5％～20％血清替代物，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL青-鏈雙抗，0.1mMβ-巰基乙醇。

所述的步驟(3)培養(yǎng)器皿包被的硫酸軟骨素濃度為10～50mg/mL；層粘連蛋白濃度為1～10μg/mL；

步驟(3)中所述分化培養(yǎng)基C：基礎培養(yǎng)基由DMEM/F12和M199以1～1.5:1的比例配制而成，并添加了5％～20％胎牛血清，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL青-鏈霉素青鏈雙抗，2～10ng/mL重組人胰島素，20～50mg/mL左旋維生素C，10～20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子。

所述的步驟(3)中的分化培養(yǎng)基D是：以分化培養(yǎng)基C培養(yǎng)牛角膜內皮細胞，并收集培養(yǎng)過牛角膜內皮細胞的條件培養(yǎng)基，將條件培養(yǎng)基和新鮮的分化培養(yǎng)基C以1:1～1.5的比例配制而成，并添加了由200～1000nM重組人Dickkopf相關蛋白、2.5～20ng/mL血小板衍生生長因子和2.5～10ng/mL轉化生長因子β組成的趨化因子組合物。

所述條件培養(yǎng)基的獲取步驟為：牛角膜內皮細胞的培養(yǎng)，將裝有牛角膜內皮細胞的凍存管從超低溫冰箱取出，迅速轉移至37℃水浴鍋內將管內快速溶解，將凍存管內細胞懸液移至15mL離心管內，加入5～10mL分化培養(yǎng)基C，1000轉/分鐘離心5分鐘后棄上清，再加入4～6mL分化培養(yǎng)基C重懸細胞沉淀，最后將細胞加入1～10μg/mL層粘連蛋白和10～50μg/mL硫酸軟骨素包被的培養(yǎng)瓶內，置于37℃，體積濃度為5％CO₂的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，過夜后換液；每兩日換液一次，收集每兩日培養(yǎng)過牛角膜內皮細胞的培養(yǎng)基，即得條件培養(yǎng)基。

將預分化培養(yǎng)所獲取的中間細胞的標志物HNK-1和P75免疫熒光染色呈陽性表達；獲取的類角膜內皮細胞的標志物鈉-鉀-ATP酶，S100A4蛋白，水通道蛋白-1，即AQP-1和緊密連接蛋白ZO-1免疫染色呈陽性表達。

所述的類角膜內皮細胞在人角膜內皮細胞缺失引起的疾病中的應用。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明提供的通過體外分化人類多能干細胞的方法獲得類角膜內皮細胞，可以作為替代捐贈的角膜內皮細胞的理想細胞來源。

(2)本發(fā)明方法采用商業(yè)化的人類胚胎干細胞，因為其具有自我復制和無限增殖的能力以及分化潛能，因此類角膜內皮細胞的獲得具有充足的來源。

(3)本發(fā)明解決了類角膜內皮細胞在體外分化率低的問題，提高了類角膜內皮細胞在體外分化效率，自擬胚體階段至獲取類角膜內皮細胞時間最快為11天。

(4)本發(fā)明提供的體外分化獲取的類角膜內皮細胞的鑒定方法，可以被用于進行類角膜內皮細胞的質量控制，為未來使用類角膜內皮細胞治療角膜內皮細胞缺失疾病鋪平了道路。

(5)本發(fā)明方法獲得類角膜內皮細胞，為Descemet膜技術(DMEK)的開發(fā)，奠定了基礎，具有非常重要的臨床意義和廣闊的應用前景。

(6)本發(fā)明方法技術方案簡便、易操作。

附圖說明

圖1細胞示意圖。a、擬胚體分化示意圖；b、實施例4-2類角膜內皮細胞示意圖；c、實施例4-3類角膜內皮細胞示意圖。

圖2免疫熒光染色結果示意圖。a、實施例5-1免疫熒光染色結果；b、鈉-鉀-ATP酶免疫熒光染色結果示意圖；c、S100A4蛋白免疫熒光染色結果示意圖；d、水通道蛋白-1免疫熒光染色結果示意圖；e、緊密連接蛋白ZO-1免疫熒光染色結果示意圖。

具體實施方式

下面將參考附圖并結合實施例，來詳細說明本發(fā)明。

本發(fā)明所用培養(yǎng)基及其添加物如無特殊說明，均來自Gibco公司和Sigma公司。

實施例1培養(yǎng)基的配置

1.無血清培養(yǎng)基的配制

基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加了15％的血清替代物，15ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM的GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL的青-鏈雙抗，0.1mM的β-巰基乙醇，配制成無血清培養(yǎng)基，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.分化培養(yǎng)基A的配制

基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加了1×N2添加劑，12ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL青-鏈雙抗，2ng/mL重組人胰島素，配制成分化培養(yǎng)基A，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

3.分化培養(yǎng)基B的配制

基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加了10％血清替代物，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL青-鏈雙抗，0.1mMβ-巰基乙醇，配制成分化培養(yǎng)基B，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

4.分化培養(yǎng)基C的配制

基礎培養(yǎng)基由DMEM/F12和M199以1.2:1配制而成，并添加了5％胎牛血清，1×非必需氨基酸，2mM GlutaMAX^TM培養(yǎng)基及添加劑，100單位/mL青-鏈雙抗，2ng/mL重組人胰島素，30mg/mL左旋維生素C，12ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，配制成分化培養(yǎng)基C，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

5.分化培養(yǎng)基D的獲取和配制

(1)條件培養(yǎng)基的獲取

牛角膜內皮細胞的培養(yǎng)，將裝有牛角膜內皮細胞的凍存管從超低溫冰箱取出，迅速轉移至37℃水浴鍋內將管內快速溶解，將凍存管內細胞懸液移至15m1離心管內，加入5mL分化培養(yǎng)基C，1000轉/分鐘離心5分鐘后棄上清，再加入4mL分化培養(yǎng)基C重懸細胞沉淀，最后將細胞加入l0ug/mL層粘連蛋白和l0ug/mL硫酸軟骨素包被的培養(yǎng)瓶內，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，過夜后換液，以后每兩日換液一次，收集每兩日培養(yǎng)過牛角膜內皮細胞的培養(yǎng)基為條件培養(yǎng)基。

(2)分化培養(yǎng)基D的配制

將條件培養(yǎng)基和新鮮的分化培養(yǎng)基C以1:1.2的比例配制，并添加了由200nM重組人Dickkopf相關蛋白2、5ng/mL血小板衍生生長因子和5ng/mL轉化生長因子β組成的趨化因子組合物，配制成分化培養(yǎng)基D，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2類角膜內皮細胞的獲取方法

1.商業(yè)化人胚胎干細胞的培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞，取其3-4代作為飼養(yǎng)層，采用添加白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)基中誘導增殖，并維持其未分化狀態(tài)。

2.擬胚體的獲取

將上述培養(yǎng)的商業(yè)化人胚胎干細胞用膠原酶Ⅳ和DispaseII以1：2配比配制并消化后，采用所配制的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞，直至其分化形成菊形團，即為擬胚體，如圖1a所示。

實施例3預分化培養(yǎng)

1.預分化培養(yǎng)之操作一

將實施例2獲取的擬胚體采用補充了500ng/mL頭蛋白和10μM TGF-β1受體抑制劑的具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基A中培養(yǎng)4天；

2.預分化培養(yǎng)之操作二

將實施例2中獲取的擬胚體采用補充了500ng/mL頭蛋白和10μM TGF-β1受體抑制劑的具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基B中培養(yǎng)2周；

實施例4類角膜內皮細胞的獲取

1.類角膜內皮細胞的獲取之操作一

將實施例3操作一中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基C，即獲得類角膜內皮細胞。

2.類角膜內皮細胞的獲取之操作二

(1)將實施例3操作一中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基D，即獲得類角膜內皮細胞。

(2)將實施例3操作一中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基D，即獲得類角膜內皮細胞。

(3)將實施例3操作一中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)40天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基D，即獲得類角膜內皮細胞，如圖1b所示。

3.類角膜內皮細胞的獲取之操作三

將具體實施例3操作二中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基C，即獲得類角膜內皮細胞。

4.類角膜內皮細胞的獲取之操作四

(1)將實施例3操作二中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基D，即獲得類角膜內皮細胞。

(2)將實施例3操作二中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)28天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基D，即獲得類角膜內皮細胞。

(3)將實施例3操作二中預分化培養(yǎng)后的中間細胞轉移至包被了25mg/mL硫酸軟骨素和1μg/mL層粘連蛋白的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)38天，采用具體實施例1中配制的分化培養(yǎng)基D，即獲得類角膜內皮細胞，如圖1c所示。

實施例5

1.將實施例3操作一和操作二中預分化培養(yǎng)后的中間細胞進行免疫染色，具體操作是：

(1)將擬胚體用含4％多聚甲醛的0.1M PBS緩沖溶液在室溫下固定30分鐘；

(2)用0.5％triton X-100(PBS配制)對細胞透化處理10分鐘；

(3)PBS洗三遍，每次5分鐘；

(4)2％BSA封閉30分鐘，PBS洗兩遍；

(5)加入一抗：HNK-1(1:100)，室溫孵育1小時；

(6)PBS洗三遍，每次5分鐘；

(7)加入標記有Cy2和Cy3的二抗，室溫孵育30-45分鐘；

(8)PBS洗四遍，每次5分鐘；

(9)加入0.5μg/mL DAPI(PBS配制)染色10分鐘；

(10)用PBS洗三遍，去除多余的DAPI；

(11)加入20μl封片劑封片。

免疫熒光染色結果顯示：預分化培養(yǎng)所獲取的中間細胞的標志物HNK-1免疫染色呈陽性表達，如圖2a所示。

2.將具體實施例4操作二第(1)步中獲得類角膜內皮細胞進行免疫染色，具體操作是：

(1)實驗前一天，將細胞分別接種至鋪有22×22mm蓋玻片的六孔板中。

(2)第二天，待細胞匯合度達到70％左右開始進行染色步驟。

(3)將類角膜內皮細胞用含4％多聚甲醛的0.1M PBS緩沖溶液在室溫下固定30分鐘；

(4)用0.5％triton X-100(PBS配制)對細胞透化處理10分鐘；

(5)PBS洗三遍，每次5分鐘；

(6)2％BSA封閉30分鐘，PBS洗兩遍；

(7)分別加入一抗：鈉-鉀-ATP酶(1:100)、S100A4蛋白(1:100)、AQP-1(1:100)和ZO-1(1:100)，室溫孵育1小時；

(8)PBS洗三遍，每次5分鐘；

(9)加入標記有Cy2和Cy3的二抗，室溫孵育30-45分鐘；

(10)PBS洗四遍，每次5分鐘；

(11)加入0.5μg/mL DAPI(PBS配制)染色10分鐘；

(12)用PBS洗三遍，去除多余的DAPI；

(13)加入20μl封片劑封片。

免疫熒光染色結果顯示：獲取的類角膜內皮細胞的標志物鈉-鉀-ATP酶，S100A4蛋白，水通道蛋白-1(AQP-1)和緊密連接蛋白ZO-1免疫染色呈陽性表達，如圖2b、2c、2d和2e所示。

以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員而言，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，這些都應當視為屬于本發(fā)明由所提交的權利要求書確定的專利保護范圍。