一種從水稻種子生產(chǎn)重組人堿性成纖維細胞生長因子的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水稻遺傳密碼子優(yōu)化的OsrbFGF基因，相關載體及其制備OsrbFGF轉基因水稻種子的方法和OsrbFGF的分離純化方法。通過水稻胚乳細胞特異性表達OsrbFGF的表達載體來制備OsrbFGF轉基因水稻種子，并從中分離純化OsrbFGF，所獲得OsrbFGF的純度達95%，并具有體外促進NIH/3T3細胞增殖和體內促進傷口愈合的活性。
【專利說明】一種從水稻種子生產(chǎn)重組人堿性成纖維細胞生長因子的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及通過基因工程技術在植物中制備人細胞生長因子的方法。
【背景技術】
[0002]成纖維細胞生長因子(FGF)是一類與肝素有高親和力且生物活性相似的蛋白家族。至今已分離鑒別出23個不同的成纖維細胞生長因子。成纖維細胞生長因子的原型，即喊性成纖維細胞生長因子(bFGF,basic fibroblast growth factor, bFGF or FGF-2)是20世紀70年代首次在垂體和大腦發(fā)現(xiàn)的。它是一個單鏈的、分子量為171^&、等電點為9.6的蛋白質。它可以促進NIH/3T3細胞的增殖和抑制干細胞的分化，由于它可促進人氣道平滑肌細胞的增殖、遷移并在體外改變其收縮表型從而引起氣道重塑的衰減，因此可能在哮喘治療中發(fā)揮重要的作用。隨后，堿性成纖維細胞生長因子還被證實可促進小鼠乳腺上皮細胞的生長。此外，它被廣泛應用于燒傷治療和傷口愈合的臨床應用，因為堿性成纖維細胞生長因子可顯著加快傷口愈合速度。用堿性成纖維細胞生長因子治療創(chuàng)口發(fā)紅、傷口紅腫及燙傷愈合比單純用手術治療更有效并且皮膚表面的硬度較小。因此，堿性成纖維細胞生長因子常被用于心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病中的組織修復和傷口愈合。
[0003]堿性成纖維細胞生長因子最初分 離自大腦和垂體，其來源十分有限，體內外對堿性成纖維細胞生長因子應用的大量需求難以得到滿足。在過去的幾十年間，科學家已作出了廣泛的努力，分別用大腸桿菌、畢赤酵母、大豆種子和蠶來表達重組人堿性成纖維細胞生長因子。然而，由于收益率較低、工藝復雜和不溶性等問題，結果都難以滿足市場的需求，特別是難以滿足細胞治療和轉化醫(yī)學對人堿性成纖維細胞生長因子日漸增加的應用需求。
[0004]最近，已報道用水稻胚乳表達各種重組藥物蛋白，包括人乳鐵蛋白、人溶菌酶、rhIGF-Ι融合蛋白，人粒細胞-巨噬細胞群刺激因子和人血清白蛋白。這些結果表明，水稻胚乳表達系統(tǒng)具有成本效益、安全、易于擴大生產(chǎn)規(guī)模且相對于動物和其他植物細胞表達系統(tǒng)的生產(chǎn)工藝更加簡便等優(yōu)點。因此，水稻胚乳被認為是有利的大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白表達的平臺。其優(yōu)勢對學術研究和工業(yè)應用都具有相當?shù)奈Α?br> [0005]如今，尚未有有關利用水稻胚乳系統(tǒng)表達堿性成纖維細胞生長因子的報道。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種水稻遺傳密碼子優(yōu)化的表達人堿性成纖維細胞生長因子基因(OsrbFGF基因)，其具有如SEQ ID N0.1所示的序列。
[0007]進一步地，還提供了含有所述OsrbFGF基因的載體，優(yōu)選水稻胚乳細胞特異性表達載體，更優(yōu)選具有如圖3所示的結構的載體。
[0008]本發(fā)明另一個目的是提供含有所述OsrbFGF基因的載體在制備OsrbFGF轉基因水稻種子中的應用。[0009]本發(fā)明的又一個目的是提供一種制備OsrbFGF轉基因水稻種子的方法，包括以下步驟:
[0010](I)制備具有如SEQ ID N0.1所示序列的OsrbFGF基因；
[0011](2)構建水稻胚乳細胞特異性表達的OsrbFGF表達載體和選擇性標記基因載體；
[0012](3)將步驟2所獲得載體共轉化到水稻品種的愈傷再生組織中；
[0013](4)培養(yǎng)所述愈傷再生組織，經(jīng)篩選和誘導獲得OsrbFGF轉基因水稻植株；
[0014](5)培養(yǎng)OsrbFGF轉基因水稻植株，獲得OsrbFGF轉因水稻種子。
[0015]進一步地，上述方法中所的OsrbFGF表達載體具有如圖3所示的結構。
[0016]進一步地，上述方法中所述的選擇性標記基因載體具有如圖4所示的結構。
[0017]本發(fā)明的再一個目的是提供一種從OsrbFGF轉基因水稻種子中分離純化OsrbFGF的方法，包括以下步驟:
[0018](I)以OsrbFGF轉基因水稻種子為原料制備OsrbFGF提取液；
[0019](2)用正壓力過濾器對OsrbFGF提取液進行過濾，獲得OsrbFGF濾液；
[0020](3)以Heparin 6Fast Flow柱分離純化OsrbFGF濾液,采用兩步洗雜法去除結合在Heparin 6Fast Flow柱上OsrbFGF濾液中的雜蛋白；
[0021](4)用OsrbFGF洗脫液對結合在Heparin 6Fast Flow柱上的OsrbFGF進行洗脫，獲得高純度的OsrbFGF。
[0022]具體地，上述方法包括以下步驟:
[0023](I)以OsrbFGF轉基因水稻種子為原料，以包括50mM PB (pH 7.5)、lmM EDTAUmML-還原型谷胱甘肽、250mMNaCl的提取緩沖液制備OsrbFGF提取液；
[0024](2)分別用3 μ m和0.22 μ m的正壓力過濾器對OsrbFGF提取液進行過濾，獲得OsrbFGF 濾液；
[0025](3)用 Heparin 6Fast Flow柱分離純化OsrbFGF濾液，并用包括250mMNaCl 和 ImML-還原型谷胱甘肽的50mM PB (pH 7.5)進行平衡；采用兩步洗雜法去除OsrbFGF濾液中的雜蛋白；其中洗雜緩沖液I包括:50mM PB (pH 7.5)、600mM NaClUmM L-還原型谷胱甘肽，洗雜緩沖液II包括:50mM PB (pH7.5)、900mM NaCl、ImM L-還原型谷胱甘肽；
[0026](4)用OsrbFGF洗脫液對對結合在Heparin 6Fast Flow柱上的的OsrbFGF進行洗脫，獲得高純度的OsrbFGF，所述OsrbFGF洗脫緩沖液包括:IOmMTris-HCl (pH 7.5),1.7mMNaCl、ImML-還原型谷胱甘肽。
[0027]本發(fā)明構建了利于水稻胚乳表達的人bFGF基因并成功地在水稻中表達，制備和分離純化出OsrbFGF蛋白，獲得的OsrbFGF蛋白具有人堿性成纖維細胞生長因子的活性，為利用植物基因工程技術制備人細胞生長因子蛋白奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是質粒p0sPMP2的結構示意圖。
[0029]圖2是質粒p0sPMP276的結構示意圖。
[0030]圖3是質粒p0sPMP277的結構示意圖。
[0031]圖4是質粒p0sPMP05的結構示意圖。
[0032]圖5是PCR擴增鑒別陽性轉化植株的結果圖；[0033]其中，從左到右第1-8泳道為陽性轉化植株，Ne為陰性對照即非轉基因TP309水稻基因組DNA為模板，Pc為陽性對照即p0sPMP276質粒為模板。
[0034]圖6是Western雜交鑒定轉基因水稻表達OsrbFGF的結果圖；
[0035]其中，從左到右第1-8泳道為陽性轉化植株，Ne為非轉基因TP309水稻種子提取液，Pc為bFGF標準品。
[0036]圖7顯示了 OsrbFGF的表達水平。
[0037]圖8顯示了從轉基因水稻種子中分離純化OsrbFGF的結果；
[0038]其中，a顯示了 OsrbFGF的回收率；b顯示了純化過程中SDS-PAGE的檢測結果；c顯示了純化過程中Western雜交的鑒定結果。其中，圖b和c中，從左到右的泳道M為分子標記，UF-5為5kDa超濾濃縮除鹽，Elu為親和洗脫，W2為第二次洗雜，Wl為第一次洗雜，Extra為bFGF粗提液。
[0039]圖9顯示了 OsrbFGF在體外和體內的活性分析結果；
[0040]其中，a顯示了 OsrbFGF對NIH/3T3細胞增殖的影響；b顯示了 OsrbFGF處理傷口后第2、4、6、8、10、12、14的愈合率；(^Pe分別顯示了 OsrbFGF處理傷口后第3、7、14天CD68和PCNA的陽性數(shù)量；d和f分別顯示了 CD68和PCNA的免疫射線自動照相結果。
【具體實施方式】
[0041]以下通過結合附圖詳細說明本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的舉例說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內容。
`[0042]實施例中所用到的各種試劑和儀器，除特別說明以外，均為普通市售。
[0043]【實施例1】水稻特異性表達重組人堿性成纖維細胞生長因子載體的構建及轉基因水稻植株的制備
[0044]人bFGF基因(Genbank登記號:NM002006)由Heron Blue生物技術公司合成并根據(jù)水稻偏好的遺傳密碼子，將bFGF基因中61.54%的遺傳密碼子進行優(yōu)化并使人bFGF基因中21.65%的核苷酸發(fā)生改變，優(yōu)化后的人bFGF基因序列如SEQ ID N0.1所示，密碼子優(yōu)化前后的氨基酸序列沒有變化。本實施例選用水稻特異性啟動子Gtl3a及其信號肽來介導重組人bFGF基因在水稻胚乳細胞中的表達，用如圖1所示的質粒p0sPMP2來構建水稻胚乳特異性表達盒。將所述合成的經(jīng)密碼子優(yōu)化的人bFGF基因用SchI和XhoI酶切后克隆到p0sPMP2中構建成質粒p0sPMP276，如圖2所示。然后構建用于根癌農(nóng)桿菌介導轉化的質粒，用HindIII和EcoRI酶切p0sPMP276，將長度為1983bp的含Gtl3a啟動子及其信號肽序列還有經(jīng)密碼子優(yōu)化的bFGF基因以及Nos終止子的整個表達盒，如SEQ ID N0.2所示，插入到雙元表達載體JH2600，所獲得的雙元質粒命名為p0sPMP277，具體如圖3所示。將雙元質粒p0sPMP277轉化到根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 (美國Invitrogen公司),經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導共轉化將所述p0sPMP277質粒和如圖4所示的p0sPMP05質粒共轉化到水稻品種TP309的愈傷再生組織中，具體方法參照(Daley, M.;Knauf, V.C.; Summerfelt, K.R.;Turner, J.C.Co-transformation with one agrobacterium tumefaciens strain containing twobinary plasmids as a method for producing marker-fee transgenic plants.PlantCellRep.1998.17，489-496.)，經(jīng)培養(yǎng)、篩選和誘導后形成完整的植株，總獲得58株獨立的轉化植株；然后，通過PCR擴增來鑒別陽性轉化植株，用起始于Gtl3a信號肽的正向引物(5' -GAGGGTGTGGAGGCTCTTGT-3')和起始于Nos 終止子的反向引物序列(5' -GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3')來進行PCR擴增，結果如圖5所示。
[0045]【實施例2】OsrbFGF的分析和鑒定
[0046]本實施例用Western雜交來檢測所獲得的轉基因水稻表達的bFGF (本發(fā)明稱OsrbFGF)是否聚集在水稻胚乳細胞中。分別取經(jīng)PCR鑒定為陽性的轉基因水稻植株的Tl種子lOOmg，用Iml的提取緩沖液(50mM PB, pH 7.5，ImM EDTA, ImM L-還原型谷胱甘肽，250mMNaCl)在4° C下研磨60分鐘，然后在10620xg的條件下離心10分鐘，獲得蛋白粗提液。用15% SDS-PAGE分離40 μ I蛋白粗提液和350ng源于Ecoli的重組bFGF，并將凝膠轉移到硝酸纖維素膜上。使用堿性成纖維細胞生長因子的兔多抗(Abeam，英國)和堿性磷酸酶山羊抗兔IgG (ZSGB-BIO，中國)，以氯化硝基四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP，B10SHARP，中國)為底物進行目標蛋白的檢測。結果顯示，有35株轉基因水稻表達的OsrbFGF積累在水稻胚乳中，結果圖6所示。用Image-proPlus軟件對最終的Western雜交結果進行分析，結果顯示OsrbFGF的表達水平為每公斤粗米生產(chǎn)99.11-185.66mg0srbFGF，如圖 7 所示。
[0047]另外，本實施例還進一步采用Southern雜交鑒定轉基因水稻植株，分別取約200mg轉基因水稻的嫩葉，用液氮研磨并用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)(中國天根生物科技有限公司)提取基因組DNA。分別用EcoR1、HindIII或用EcoRI和HindIII (新英格蘭生物公司)在37° C過夜酶切所述基因組DNA，然后0.8%瓊脂糖凝膠進行分離；將凝膠轉移到 MILLIP0RE NY+膜后，按照羅氏 DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I 的指示進行雜交，用以下引物(5’ -GCATCCATAAATCGCCCCATAG-3’ 和5’-GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3’)擴增源自bFGF編碼區(qū)的長度為824bp的探針。結果顯示:當用EcoRI或HindIII消化酶酶切時均檢測到單個片段，該結果與遺傳分析的結果一致；EcoRI和HindIII雙酶切獲得的單個條帶與整個表達盒相比較，結果顯示所述農(nóng)桿菌雙向載體存在于整個表達盒中。
[0048]【實施例3】OsrbFGF的分離和純化
`[0049]在室溫下，用提取緩沖液(50mM PB, pH 7.5, ImM EDTA, ImM L-還原型谷胱甘肽，250mMNaCl)研磨并提取轉基因水稻的種子I小時，獲得的提取液分別通過3 μ m和0.22 μ m的正壓力過濾器進行過慮澄清，然后將濾液加到Heparin 6Fast Flow柱(GE Healthcare,www.gelifesciences.com),并用含有 250mM NaCl 和 ImM L-還原型谷胱甘妝的 50mM PB 進行平衡；采用兩步洗雜法去除雜蛋白并增加OsrbFGF的回收率，其中洗雜緩沖液I為(50mMPB (pH 7.5)，600mM NaCl, ImML-還原型谷胱甘肽)，洗雜緩沖液 II 為(50mM PB (pH 7.5)，900mM NaCl, ImML-還原型谷胱甘妝)；洗雜后，結合于Heparin 6Fast Flow柱上的OsrbFGF用洗脫緩沖液(IOmM Tris-HCKpH 7.5)，1.7mM NaCl, ImML-還原型谷胱甘肽)進行洗脫，獲得高純度的OsrbFGF蛋白，其中OsrbFGF的回收率如圖8a所示，各洗脫步驟的SDS-PAGE檢測結果及Western雜交分析結果分別如圖8b和8c所示。在凍干之前，先將OsrbFGF洗脫液進行濃縮并用Pellicon XL (Millipore公司)5kD的超濾過濾器進行部分脫鹽，然后用Viva Flow 50 (Sartorius) IOOkD的超濾過濾器去除內毒素,所獲得的OsrbFGF最終純度達95%以上且內毒素含量低于IEU/μ g。最后，OsrbFGF在OsrHSA的保護下進行凍干(1:50，w/w)。[0050]【實施例4】OsrbFGF對NIH/3T3細胞增殖的影響
[0051]在含有DMEM培養(yǎng)基并補以1.5% FBS和I %青霉素和鏈霉素(P/S)的96孔平板中培養(yǎng)NIH/3T3細胞，NIH/3T3細胞的初始濃度為1χ105_5χ105個/ml，于37°C、5% CO2下孵育24小時。然后除去培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞，在37°C下用0.25%的胰蛋白酶處理3分鐘。將處理后的細胞重懸于DMEM培養(yǎng)基中，補以1.5% FBS和I % P/S，然后在800rpm下離心3分鐘。除去上清液，將細胞重懸于含有1.5% FBS和I % P/S的DMEM培養(yǎng)基中。以4000個/ml的濃度將NIH/3T3細胞接種于96孔平板中，于37°C、5% CO2下孵育24小時。然后用補以0.75% FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞并于37°C、5% CO2下再孵育24小時。最后，細胞在含有不同OsrbFGF濃度(200 μ I/孔)的DMEM培養(yǎng)基孵育48小時，加入20 μ I的MTT (溴化噻唑藍四氮唑)溶液并于37°C下再孵育4小時，將微量滴定板置于VersaMax (MolecularDevices,美國)中于490nm處進行讀數(shù)。所有數(shù)據(jù)均用GraphPadPrism 5軟件進行分析且所有實驗均重復三次。結果顯示，在OsrbFGF濃度為6pg-5ng/ml的范圍內，顯示出濃度依賴性的NIH/3T3細胞增殖作用，達到1.15X106IU/mg，如圖9a所示；表明在體外OsrbFGF具有促進NIH/3T3細胞增殖的活性。說明本發(fā)明的OsrbFGF具有與商業(yè)rbFGF相同的生物活性。
[0052]【實施例5】OsrbFGF對傷口愈合的影響
[0053]取體重為200~250克的雌性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，隨機分成4組并制備成切除傷口夾板模型，具體方法參考(Galiano，R.D.;Michaels, V.;Dobryansky, Μ.;Levine, J.P.;Gurtner, G.C.Quantitative and reproducible murinemodel of excisional wound healing, ffound Repair Regen.200412, 485-492.)? 以三個 OsrbFGF 劑量組:2000ng/ml 組(n=15)、500ng/ml, (n=15)、125ng/ml 組(n=15)和一個生理鹽水陰性對照組(n=15)對應處理上述隨機分組的4組模型以測試傷口的愈合率。分別在第O天，第2天，第4天 ，第6天，第8天，第10天，12天及14天的觀察傷□的閉合情況并按(Wu, Y.; Chen, L.; Scott, P.G.; Tredget, E.E.Mesenchymal stem cells enhancewound healing through differentiation and angiogenesis.Stem Cells 2007,25,2648-2659.)所述的方法進行傷口愈合率[(原創(chuàng)面-實際創(chuàng)面)/原創(chuàng)面X 100]、病理和免疫組化觀察。結果表示，傷口愈合率對OsrbFGF有劑量依賴性，其中在治療的前8天，低劑量比高劑量如500ng和2000ng作用更為顯著，如圖9b所示。通常，當受傷的皮膚康復時能促進上皮形成和⑶68表達以及細胞核抗原(PCNA)的增殖。因此本實施例還檢測了治療第3天、第7天和第14天時PCNA和⑶68的表達，結果顯示，與陰性對照組相比，于治療的第3天和第7天，OsrbFGF劑量組的PCNA和⑶68表達顯著增加，而在治療第14天時，OsrbFGF劑量組的PCNA和⑶68表達水平卻低于陰性對照組，如圖9c-9f所示。在治療的早期階段，OsrbFGF可以通過刺激細胞的增殖和促進⑶68和PCNA的增殖從而加速傷口愈合，然后，通過降低細胞、CD68和PCNA的表達以防止在治療的后期階段產(chǎn)生疤痕和傷口閉合時的細胞增殖。
【權利要求】
1.一種水稻遺傳密碼子優(yōu)化的表達人堿性成纖維細胞生長因子的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種含有權利要求1所述表達人堿性成纖維細胞生長因子基因的重組表達載體。
3.權利要求2所述的載體，其特征在于，所述載體是水稻胚乳細胞特異性表達載體。
4.權利要求3所述載體，其特征在于，所述載體具有如圖3所示的結構。
5.權利要求2-4中任一項所述的載體在制備轉基因水稻種子中的應用，其中所述轉基因水稻種子表達人堿性成纖維細胞生長因子。
6.一種制備表達人堿性成纖維細胞生長因子的轉基因水稻種子的方法，包括以下步驟: (1)構建具有如SEQID N0.1所示序列的表達人堿性成纖維細胞生長因子的OsrbFGF基因; (2)構建水稻胚乳細胞特異性表達的OsrbFGF表達載體和選擇性標記基因載體； (3)將步驟(2)獲得載體共轉化到水稻品種的愈傷再生組織中； (4)培養(yǎng)所述愈傷再生組織，經(jīng)篩選和誘導獲得表達人堿性成纖維細胞生長因子的OsrbFGF轉基因水稻植株； (5)培育OsrbFGF轉基因水稻植株，獲得表達人堿性成纖維細胞生長因子的OsrbFGF轉基因水稻種子。
7.權利要求6所述的方法，其`特征在于，所述OsrbFGF表達載體具有如圖3所示的結構。
8.權利要求6所述的方法，其特征在于，所述選擇性標記基因載體具有如圖4所示的結構。
9.一種從OsrbFGF轉基因水稻種子中分離純化人堿性成纖維細胞生長因子的方法，包括以下步驟: (1)以OsrbFGF轉基因水稻種子為原料制備OsrbFGF提取液； (2)用正壓力過濾器對OsrbFGF提取液進行過濾，獲得OsrbFGF濾液； (3)以Heparin6 Fast Flow柱分離純化OsrbFGF濾液；采用兩步洗雜法去除結合在Heparin 6 Fast Flow柱上OsrbFGF濾液中的雜蛋白； (4)用OsrbFGF洗脫液對結合在Heparin6Fast Flow柱上的OsrbFGF進行洗脫,獲得高純度的OsrbFGF。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)以OsrbFGF轉基因水稻種子為原料，以包括50mMPBCpH 7.5)、lmM EDTAUmM L-還原型谷胱甘肽、250mMNaCl的提取緩沖液制備OsrbFGF提取液； (2)分別用3μ m和0.22 μ m的正壓力過濾器對OsrbFGF提取液進行過濾，獲得OsrbFGF濾液； (3)用Heparin6 Fast Flow柱分離純化OsrbFGF濾液，并用包括250mMNaCl和ImML-還原型谷胱甘肽的50mM PB (pH 7.5)進行平衡；采用兩步洗雜法去除結合在Ifeparin 6Fast Flow柱上的OsrbFGF濾液中雜蛋白，其中洗雜緩沖液I包括:50mM PBCpH 7.5)、600mMNaClUmM L-還原型谷胱甘肽，洗雜緩沖液II包括:50mM PB (pH 7.5)、900mM NaClUmML-還原型谷胱甘肽；(4)用OsrbFGF洗脫液對結合在Heparin 6 Fast Flow上的OsrbFGF進行洗脫，獲得高純度的人堿性成纖維細胞生長因子蛋白，所述O srbFGF洗脫緩沖液包括:I OmMTris-HCKpH 7.5)、1.7mM NaCl、ImM`L-還原型谷胱甘肽。
【文檔編號】A01H5/00GK103865932SQ201210534797
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權日:2012年12月11日
【發(fā)明者】楊代常, 歐吉權, 安娜 申請人:武漢禾元生物科技有限公司