在蘑菇生產(chǎn)中控制真菌病的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的抗真菌組合物以及它們在控制蘑菇中真菌病的方法中的用途。
【專利說明】在蘑菇生產(chǎn)中控制真菌病的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了在蘑菇生產(chǎn)中控制真菌病的新的抗微生物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，商業(yè)培養(yǎng)的蘑菇物種超過20種，并且培養(yǎng)蘑菇的國家超過60個，其中中國、 美國、波蘭、荷蘭和法國為最高產(chǎn)生產(chǎn)國。
[0003] 在過去10至15年，蘑菇工業(yè)經(jīng)歷了諸多變迀。小型的低效農(nóng)場已關(guān)閉，或者并入 更大的、生產(chǎn)率更高的、機械化增強且集中式管理的農(nóng)場。在該框架內(nèi)，控制真菌病的暴發(fā) 是必需的。無法在早期控制真菌病的暴發(fā)可能會導致費用耗費，因為未經(jīng)處理的發(fā)病區(qū)域 產(chǎn)生孢子和繁殖體，它們會將疾病蔓延到農(nóng)場其他區(qū)域，導致產(chǎn)量和生產(chǎn)率嚴重下降。
[0004] 蘑菇工業(yè)在21世紀面臨著巨大挑戰(zhàn)。首先，控制疾病暴發(fā)的可用殺真菌劑較少， 因為許多殺真菌劑不再被批準使用。其次，越來越多的消費者要求減少殺真菌劑的使用。 再次，由于長期頻繁使用殺真菌劑，蘑葫病原體（例如輪枝菌（Verticillium)和木霉菌 (Trichoderma))已經(jīng)對許多殺真菌劑產(chǎn)生抗性（參見Grogan，2008 ;Romaine等，2005 ;Gea 等，1997 ;Romaine 等，2008)。
[0005] 幾十年來，多烯大環(huán)內(nèi)酯抗霉菌劑那他霉素已經(jīng)被用于預防真菌在諸如奶酪和香 腸的食物產(chǎn)品上的生長。該天然防腐劑由納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis)發(fā)酵 而產(chǎn)生，作為食品防腐劑已廣泛應用于全世界，且在食品行業(yè)具有安全使用的悠久歷史。它 對所有已知的食品腐敗性真菌非常有效。盡管在例如奶酪工業(yè)中那他霉素已經(jīng)被應用多 年，但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)抗性真菌物種的出現(xiàn)。
[0006] 因此可推斷，對在蘑菇生產(chǎn)中控制真菌病的新的更有效的抗微生物組合物（例如 抗真菌組合物）有嚴重需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過提供包含那他霉素和百菌清（chlorothalonil)的新的協(xié)同抗微生物 (例如抗真菌）組合來解決所述問題。
[0008] 百菌清（2, 4, 5, 6-四氯間苯二腈，2, 4, 5, 6-tetrachloroisophthalonitrile)是 多氯化的芳香族、廣譜、非內(nèi)吸性（non-systemic)殺真菌劑。它最先于1966年在美國注冊 使用。包含百菌清的商業(yè)產(chǎn)品的例子包括商標名為Bravo?、Echo?、ExothermTermil? 和Dacon i l·?的產(chǎn)品。所述商用產(chǎn)品可以并入本發(fā)明中。
[0009] 應當理解，那他霉素的衍生物也可應用于本發(fā)明中，所述那他霉素的衍生物包括 但不限于那他霉素的鹽或溶劑化物或者那他霉素的經(jīng)修飾形式。包含那他霉素的商業(yè)產(chǎn)品 的例子為商標名為Zivion?(如Zivion? M)的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品由DSM Food Specialties(荷 蘭）生產(chǎn)。所述商業(yè)產(chǎn)品可以并入本發(fā)明中。
[0010] 如本文所用，術(shù)語"協(xié)同"表示當聯(lián)合使用時抗真菌化合物的聯(lián)合效果比單獨使用 時的累加效果更大。
[0011] 一般來講，可以在例如使用處理交互作用層（treatment interaction stratum) 的方差分析模型中測試兩種活性成分的協(xié)同活性（參見Slinker，1998)。使用下式可計算 相對功效：（未經(jīng)處理的對照的進化狀態(tài)值-組合物的進化狀態(tài)值）八未經(jīng)處理的對照的 進化狀態(tài)值））X 100。然后使用下式可計算交互作用系數(shù)：化合物A+化合物B組合的相 對功效）八化合物A的相對功效+化合物B的相對功效））X 100。大于100的交互作用系 數(shù)表示化合物之間的協(xié)同。
[0012] 或者，可按照如下方式計算協(xié)同：通過計算與使用對照組合物處理的產(chǎn)品上霉菌 生長相比使用活性成分處理的產(chǎn)品上觀察到的霉菌生長的減少可確定各活性成分的抗真 菌活性（以％計）。根據(jù)Colby方程（Colby，1967)可計算包含兩種活性成分的組合抗真菌 組合物的預期抗真菌活性出，以％計）：
[0013] E = X+Y - [ (X ·Υ) /100]，其中X和Y分別為各活性成分X和Y的觀察到的抗真菌 活性（以％計）。如果所觀察到的組合的抗真菌活性（〇，以％計）超過所預期的組合的抗 真菌活性出，以％計），且因此協(xié)同因子0/Ε>1.0,則活性成分的聯(lián)合應用導致協(xié)同抗真菌 效果。
[0014] -方面，本發(fā)明涉及通過將那他霉素和百菌清應用到生長或待生長蘑菇的基質(zhì) (substrate)中來在蘑葫生產(chǎn)期間控制真菌病的方法。以抑制真菌病的有效量來應用那他 霉素和百菌清。此外，在使用那他霉素和百菌清處理基質(zhì)之前、同時或之后，可將其他抗真 菌化合物和/或抗微生物化合物應用到基質(zhì)中。
[0015] 可將那他霉素和百菌清相繼應用到基質(zhì)中?？梢砸匀魏雾樞颍ㄊ紫饶撬顾厝缓?百菌清，或者首先百菌清然后那他霉素）應用化合物?；蛘?，可將那他霉素和百菌清同時應 用到基質(zhì)中。在同時應用的情況下，化合物可存在于同時應用的不同組合物中或者化合物 可存在于單一組合物中。在另一個實施方案中，可以通過單獨或交替的應用方式將抗真菌 化合物施用到基質(zhì)中。
[0016] 通過應用化合物，可預防真菌在基質(zhì)上或者基質(zhì)中生長。換言之，化合物保護蘑菇 免于真菌生長和/或真菌感染和/或真菌腐敗。也可將化合物應用到已經(jīng)感染真菌的基質(zhì) 和/或蘑菇上。通過施用化合物，因基質(zhì)和/或蘑菇上或在基質(zhì)和/或蘑菇中的真菌而導 致的疾病進展可被減緩、停止，或者甚至可治愈基質(zhì)和/或蘑菇的疾病。根據(jù)應用的類型， 所應用的那他霉素的量可在5ppm至10, OOOppm間變化，優(yōu)選為IOppm至5, OOOppm，以及最 優(yōu)選為20至1，OOOppm。取決于應用的類型，所應用的百菌清的量可在5ppm至5, OOOppm之 間變化，優(yōu)選為IOppm至3, OOOppm，以及最優(yōu)選為30至1，OOOppm。
[0017] 當以組合物的形式應用那他霉素時，該組合物通常包含約0. 005g/l至約100g/l， 優(yōu)選為約〇. 〇lg/l至約50g/l那他霉素。優(yōu)選地，量為0. 01g/l至3g/l。
[0018] 當以組合物的形式應用百菌清時，該組合物通常包含約0. 0001g/l至約2000g/l、 和優(yōu)選約0. 0005g/l至約1500g/l的百菌清。更優(yōu)選地，量為0. 001g/l至1000g/l。
[0019] 在一個實施方案中，包含那他霉素和/或百菌清的組合物還可包含至少一種另外 的化合物，所述化合物選自：粘著劑（sticking agent)、載體、著色劑、保護性膠體、粘合劑 (adhesive)、除草劑、肥料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、另外的抗微生物化合物、 清潔劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴淋油、流動助劑、礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、乳化劑、潤濕劑、 穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖劑、UV-吸收劑和抗氧化劑。另外的抗微生物抗真菌化合物可以為抗 真菌化合物或者對抗昆蟲、線蟲、螨蟲和/或細菌的化合物。當然，組合物也可包含上述另 外的化合物的任意兩種或更多種。
[0020] 組合物的pH可以為1至10,優(yōu)選為2至9,更優(yōu)選為3至8以及最優(yōu)選為4至7。
[0021] 組合物可以為固體，例如粉末、顆粒或片劑。固體組合物可用于制備液體組合物。
[0022] 組合物也可為液體。組合物可以為含水的或非含水的即用型組合物，但也可為含 水的或非含水的濃縮組合物/懸浮液或者原液組合物、懸浮液和/或溶液，其在使用之前必 須使用諸如水或緩沖體系的合適稀釋劑來加以稀釋。
[0023] 也可以以試劑盒的形式來應用那他霉素和百菌清。那他霉素和百菌清可存在于兩 個單獨的包裝（例如容器）中。試劑盒的組分可以為在包裝中的干燥形式或液體形式。如 果必要，試劑盒可包含溶解或稀釋化合物的說明。此外，試劑盒可包括在蘑菇生產(chǎn)過程中應 用化合物的說明。
[0024] 如上所述，應用那他霉素和百菌清以控制蘑菇中的真菌病。真菌病可以為蘑菇中 由真菌導致的任何疾病。在一個實施方案中，真菌病由指孢霉（Dactylium)物種（稱為蛛 網(wǎng)?。╟obweb)或霉變?。╩ildew)的疾病）、Diehlomyces物種（稱為小牛腦病（calves brains)或假塊菌?。╢alse truffle)的疾?。㈢犳呔‵usarium)物種（稱為猝倒病的疾 ?。?、團絲核菌（Papulaspora)物種（稱為褐色石膏霉病（brown plaster mould)的疾?。?、 帚霉（Scopulariopsis)物種（稱為白色石膏霉?。╳hite plaster mould)的疾?。⑤喼?菌物種（稱為干泡?。╠ry bubble)或褐斑病的疾?。?、疣孢霉（Mycogone)物種（稱為濕泡 病或白霉病的疾?。┗蛘吣久咕锓N（稱為綠霉?。╣reen mould)的疾病）導致的。在一 個優(yōu)選的實施方案中，真菌病由輪枝菌物種、疣孢霉物種或者木霉菌物種導致。甚至更優(yōu)選 地，真菌病由真菌輪枝霉（Verticillium fungicola)、菌蓋琉孢霉（Mycogone perniciosa) 或者哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum)導致，其中真菌輪枝霉和哈茨木霉菌為最優(yōu)選 的。
[0025] 因此，一方面，本發(fā)明涉及通過將那他霉素和百菌清應用到生長或待生長蘑菇的 基質(zhì)中來抑制蘑菇中因哈茨木霉菌導致的綠霉疾病的方法。另一方面，本發(fā)明涉及通過將 那他霉素和百菌清應用到生長或待生長蘑菇的基質(zhì)中來抑制蘑菇中因真菌輪枝霉導致的 干泡疾病的方法。
[0026] -般來講，蘑菇生產(chǎn)可分為六個步驟：第1階段堆肥（composting)、第2階段堆 月巴、栽種（spawning)、覆蓋（casing)、出針（pinning)和收割（cropping)。這六個步驟需要 大約15周時間來完成。
[0027] 在第一步（即第1階段堆肥）中，準備堆肥。堆肥提供蘑菇生長所需的營養(yǎng)物質(zhì) (例如氮和碳水化合物），因此堆肥是生長或待生長蘑菇的基質(zhì)?？捎米鞫逊实某Ｒ娝缮⒉?料（bulk material)包括：木肩或鋸末、覆蓋的干草（mulched hay)、鋪草的家禽奠肥、啤酒 槽（Brewer's grain)、廢料或再生紙、咖啡衆(zhòng)或澄、堅果和種子殼、大豆粉、棉籽殼或粗粉以 及可可豆殼。
[0028] 蘑菇堆肥通常采用兩種類型的材料，最常用且最便宜的為小麥鋪草的馬糞肥。合 成堆肥通常由干草和壓碎的玉米芯制成，但該術(shù)語通常是指其中主要成分并非馬糞肥的任 何蘑菇堆肥。兩種類型的堆肥均需要加入氮補充物和調(diào)理劑石膏。
[0029] 通過混合和潤濕材料開始堆肥，在此之后開始有氧發(fā)酵，最終制成堆肥。第1階段 堆肥通常耗時7至14天。
[0030] 第二步是第2階段堆肥。該步驟通常耗時7-18天。在該步驟中，堆肥被加工 (finished)，這表示將在第1階段堆肥中形成的氨去除，并消毒堆肥以殺死可存在于堆肥 中的任何昆蟲、線蟲、真菌或其他害蟲。消毒通常通過高溫或低溫巴氏滅菌來進行。
[0031] 如何進行第2階段堆肥取決于所使用的蘑菇的生產(chǎn)工藝類型。使用床（bed)或架 (shelf)系統(tǒng)，將堆肥直接放置在床中，其中床在用于蘑菇生產(chǎn)工藝的所有步驟的房間中。
[0032] 對于分區(qū)式生長系統(tǒng)（zoned system of growing)，將堆肥堆積到木盤內(nèi)，將盤堆 積六至八個高，并且將它們移入環(huán)境控制的第2階段堆肥房。然后，將盤移入專用房間，設(shè) 計各房間以提供用于蘑菇生產(chǎn)工藝各步驟的最佳環(huán)境。
[0033] 作為最近引入的系統(tǒng)，散裝系統(tǒng)（bulk system)是其中將堆肥放置在具有有孔墊 板的水泥塊倉中且堆肥頂部無蓋的系統(tǒng)；這是專門設(shè)計用于第2階段堆肥的房間。
[0034] 無論放置在床、盤或是散裝系統(tǒng)中，均應將堆肥在厚度和密度或壓縮方面均勻填 充。
[0035] 第三步是栽種。在該步驟中，使用蘑葫菌種體（spawn)接種蘑葫基質(zhì)（即堆肥）。 蘑菇菌種體可購自營養(yǎng)繁殖菌絲體的商業(yè)菌種體制造商。將菌種體應用到基質(zhì)上，將獲得 的基質(zhì)徹底地混合?？墒謩踊蛲ㄟ^合適的混合設(shè)備進行混合。如果期望，可將補充物加入 基質(zhì)中。這些補充物包含營養(yǎng)物質(zhì)，并且可增加蘑菇產(chǎn)量。然后，選擇菌絲體通過基質(zhì)生長 的最佳條件。這些條件取決于例如基質(zhì)尺寸、基質(zhì)成分、蘑菇栽培品種（cultivar)的類型。 當菌絲體已繁殖到整個基質(zhì)層時，則完成栽種，然后可開始蘑菇生產(chǎn)的下一個步驟。栽種步 驟通常耗時14-21天。
[0036] 在許多國家，批量制備完全定植（colonized)的基質(zhì)（即堆肥）已成為普遍操作。 這在大的隧道（tunnel)中進行。完全定植是指在基質(zhì)被出售之前已經(jīng)過栽種。這就是所 謂的第3階段堆肥。專門的第3階段制造商出售基質(zhì)，這消除了農(nóng)場具備自身的基質(zhì)生產(chǎn) 設(shè)施的需求。
[0037] 第四步為覆蓋。在該步驟中，將覆蓋層應用到基質(zhì)的表面上。在覆蓋層中，最終形 成蘑菇。優(yōu)選地，將覆蓋材料進行巴氏消毒，以去除昆蟲和病原體。如果期望，可在覆蓋中 加入補充物。這些補充物包含營養(yǎng)物質(zhì)，并且可增加蘑菇產(chǎn)量。優(yōu)選地，分布覆蓋層使得基 質(zhì)表面上的厚度均勻。這種均勻性允許菌種體以相同的速率移動到并通過覆蓋層，最終同 時產(chǎn)生蘑菇。覆蓋應當能夠保持水分，因為水分對于堅實蘑菇的生長是必要的。因而建議 頻繁澆水。覆蓋層不一定需要營養(yǎng)物質(zhì)。覆蓋步驟通常耗時13-20天。
[0038] 第五步為出針。在該步驟中，發(fā)生由菌絲體而來的可識別的蘑菇的最早形成。針 頭繼續(xù)膨脹長大為成熟的蘑菇。通過調(diào)整溫度、濕度和二氧化碳含量，可以控制針頭的數(shù)量 和最終蘑菇大小?？墒斋@的蘑菇出現(xiàn)在覆蓋之后第18至21天。
[0039] 第六步即最后一步稱為收割。它是指在收割循環(huán)（7至10天）期間重復3至5天 的收獲期。在收獲期之后幾天沒有可收獲的蘑菇。收割循環(huán)以有規(guī)律的方式自身重復，并 且只要蘑菇繼續(xù)成熟即可繼續(xù)收獲。大部分種植蘑菇的農(nóng)民收獲35至42天，但一些農(nóng)民 收獲60天作物，并且收獲可持續(xù)長達150天。同樣，溫度、濕度和二氧化碳含量對最佳生產(chǎn) 率而目是關(guān)鍵的。
[0040] 新收獲的蘑菇必須保持冷藏狀態(tài)。為了延長蘑菇的貨架期，在收獲之后蘑菇"呼 吸"是重要的，因而儲存在無蠟的紙袋中比塑料袋優(yōu)選。
[0041] 在最后的蘑菇收獲之后，應當將生長室關(guān)閉，并且使用蒸汽對房間進行巴氏消毒。 設(shè)計該最終巴氏消毒以破壞可存在于生長室中的作物或木制品中的任何害蟲，因而將侵害 下一批作物的可能性降至最低。
[0042] 可在外面成堆或成層地生產(chǎn)蘑菇。這樣則不需要消毒步驟。由于室外生產(chǎn)的非預 期性和季節(jié)性的，少于5%的市售蘑菇通過這種方式進行生產(chǎn)。
[0043] 優(yōu)選地，室內(nèi)生產(chǎn)蘑菇。通過調(diào)節(jié)栽種循環(huán)、嚴密控制生長條件和基質(zhì)成分，室內(nèi) 生長使得蘑菇一致地生長。這通常通過用于大規(guī)模商業(yè)蘑菇生產(chǎn)的無窗、特制建筑來完成。 或者，也可在洞穴（caves)內(nèi)生產(chǎn)蘑葫。
[0044] 在一個本發(fā)明的實施方案中，蘑菇可食用。商業(yè)生產(chǎn)的可食用蘑菇包括但不限 于以下蘑葫物種，例如傘菌（Agaricus)物種（例如雙孢葫（Agaricus bisporus)、棕色蘑 葫（Agaricus brunnescens))、毛木耳（Auricularia polytricha)、黑木耳（Auricularia auricula-judae)、金針葫（Flammulina velutipes)、黃金葫（Hypsizygus tessulatus)、 香葫（Lentinus edodes)、姬葫（Pleurotus cornucopiae)、杏鮑葫（Pleurotus eryngii)、 平葫（Pleurotus ostreatus)、少抱根霉（Rhizopus oligosporus)、繡球菌（Sparassis crispa)、銀耳（Tremella fuciformis)、夏塊菌（Tuber aestivum)、白松露菌（Tuber magnatum)、黑孢塊菌（Tuber melanosporum)、地葫物種（Terfezia sp·)、玉米黑粉菌 (Ustilago maydis)、雞腿葫（Coprinus comatus)、羊肚菌（Morchella esculenta)以及草 燕（Volvariella volvacea)〇
[0045] 在蘑菇生產(chǎn)工藝的上述任一步驟中可應用那他霉素和百菌清。它們可以作為純組 分或在載體的存在下應用。如果期望，可以在生產(chǎn)工藝的不同步驟應用各組分，例如可以在 覆蓋步驟之后應用那他霉素，而可以在覆蓋步驟之前應用百菌清。任意組合均可。
[0046] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，在栽種之后將那他霉素和百菌清應用到 基質(zhì)中。
[0047] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一實施方案中，在覆蓋之后將那他霉素和百菌清應用到 基質(zhì)中?？芍苯釉谑┘痈采w層之后進行應用。在根據(jù)本發(fā)明的方法的又一實施方案中，在 蘑菇生產(chǎn)中不止一次應用那他霉素和百菌清。例如，在已經(jīng)施加覆蓋層之后可直接應用那 他霉素和百菌清，并且此后每天應用一次持續(xù)4至5天。優(yōu)選地，與增加覆蓋層的含水量的 重復的澆水步驟一起應用那他霉素和百菌清。在出針期間也可應用那他霉素和百菌清。而 且，在每次收獲蘑菇之后可應用那他霉素和百菌清。
[0048] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，通過噴霧應用那他霉素和百菌清。適于 應用這些液體形式化合物的其他方法也是本發(fā)明的一部分。這些包括但不限于：浸漬、澆 水、濕透、蒸發(fā)、霧化、熏蒸。已知使用自動系統(tǒng)的噴霧應用減少勞動力耗費并且節(jié)約成本。 本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法和設(shè)備可用于該目的。
[0049] 那他霉素和/或百菌清應當以控制蘑菇中真菌病的有效量使用。在一個實施方 案中，以 0· 01 - 20fl. 0Z. /IOOOsq. ft.(液量盎斯 /1000 平方英尺）、優(yōu)選為 0· 05 - IOfl. oz./IOOOsq. ft.、尤其為0. l_5fl. oz./IOOOsq. ft的量將那他霉素應用到基質(zhì)的上表 面。在一個實施方案中，可以以上述量將包含I - 15wt%那他霉素、優(yōu)選為3_14wt%那他 霉素、更優(yōu)選為5 - 13wt%那他霉素以及尤其為7 - 12wt%那他霉素的組合物應用到基質(zhì) 的上表面。在另一個實施方案中，以0. I - 500g/100m2,優(yōu)選為I - 450g/100m2,更優(yōu)選為 5 - 400g/100m2以及尤其為10 - 300g/100m2的量將那他霉素應用到基質(zhì)的上表面。本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知，根據(jù)應用的組合物中那他霉素的濃度，應用體積可改變。通常，與濃縮的那 他霉素組合物相比，每表面積單位以更大體積應用稀釋的那他霉素組合物。計算需要應用 到某些表面區(qū)域的那他霉素有效量在技術(shù)人員力所能及的范圍內(nèi)。本發(fā)明中使用的那他霉 素商業(yè)化作為包含l〇wt%那他霉素的組合物。建議將3. 1-6. 3fl. oz. /IOOOsq. ft.的該那 他霉素組合物應用到基質(zhì)的上表面。
[0050] 在一個實施方案中，以 0. 01- 30fl. oz. /IOOOsq. ft.，優(yōu)選為 0. 05 - 20fl. oz. /IOOOsq. ft.，以及尤其為0. 1-lOfl. oz. /IOOOsq. ft的量將百菌清應用到基質(zhì)的 上表面。在另一實施方案中，以10 - 500g/100m2,優(yōu)選為25 - 450g/100m2,更優(yōu)選為 50 - 400g/100m2以及尤其為100 - 300g/100m2的量將百菌清應用到基質(zhì)的上表面。本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知，根據(jù)應用的組合物中的百菌清濃度，應用的體積可改變。通常，與濃縮的百 菌清組合物相比，每表面積單位以更大體積應用經(jīng)稀釋的百菌清組合物。計算需要應用到 某些表面區(qū)域的百菌清有效量是在技術(shù)人員力所能及的范圍內(nèi)。百菌清例如商業(yè)化作為包 含720g/l百菌清的組合物。建議將最多382ml/100m 2的該組合物應用到基質(zhì)的上表面。
[0051] 在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)蘑菇的方法，該方法包括以下步驟：a)提供待生長 蘑菇的基質(zhì)；b)使用蘑菇菌種體接種基質(zhì)；c)添加覆蓋層到基質(zhì)；d)將那他霉素和百菌清 應用到基質(zhì)；e)應用刺激蘑菇生長的條件；以及f)收獲蘑菇。在蘑菇生產(chǎn)中控制真菌病的 方法的任意上述特征也可應用到該方法中。在一個實施方案中，也可在e步驟期間將那他 霉素和百菌清應用到基質(zhì)中。也可在步驟f之后（即在第一次收獲之后和新的蘑菇趨向成 熟之前）將那他霉素和百菌清應用到基質(zhì)中。
[0052] 本發(fā)明的另一方面涉及用那他霉素和百菌清處理的產(chǎn)品。因此，本發(fā)明涉及包含 那他霉素和百菌清的產(chǎn)品。經(jīng)處理的產(chǎn)品可在它們的表面上和/或在產(chǎn)品內(nèi)包含那他霉素 和百菌清。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述產(chǎn)品是農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，其包括但不限于蘑菇生長或待 生長的基質(zhì)、覆蓋層、蘑菇菌種體、補充物、蘑菇。
[0053] 本發(fā)明的另一方面涉及那他霉素和百菌清在蘑菇生產(chǎn)中控制真菌病的用途。
[0054] 因此，當生長或待生長蘑菇的基質(zhì)（即堆肥）包含那他霉素和百菌清時，這些化合 物可以在第1階段和/或第2階段堆肥步驟期間已經(jīng)被摻入基質(zhì)內(nèi)。
[0055] 當蘑菇菌種體包括抗真菌化合物時，其可以在栽種步驟時并入基質(zhì)內(nèi)。
[0056] 當覆蓋層包含抗真菌化合物時，其可以在覆蓋步驟中并入基質(zhì)內(nèi)?？蓪⒒衔飺?入用于覆蓋的材料并在施加覆蓋層時應用到基質(zhì)中。通過這種方式將抗真菌化合物充分分 散到整個覆蓋層中?？蓪⒒衔锱渲茷楣腆w形式或在固體載體上?；蛘撸梢栽趯⒏采w層 施加到基質(zhì)之后，將化合物噴灑到覆蓋層上。
[0057] 當補充物包含抗真菌化合物時，可優(yōu)選在堆肥步驟、栽種步驟和/或覆蓋步驟中 將該補充物摻入基質(zhì)內(nèi)。最后，當將那他霉素和百菌清應用到蘑菇生長的基質(zhì)中時，成熟蘑 菇的表面上可包含所述化合物或者甚至所述化合物可摻入到蘑菇內(nèi)。 實施例
[0058] 實施例1
[0059] 那他霉素和百菌清聯(lián)合應用的協(xié)同抗真菌活性
[0060] 為了證實那他霉素和百菌清的組合對真菌輪枝霉的協(xié)同抗真菌活性，使用96-孔 微量滴定板進行體外測定法。測試以下組合物：
[0061] -對照（無活性成分），
[0062] -L 25 或 2. 5ppm 那他霉素 （DSM Food Specialties，荷蘭代爾夫特），
[0063] -〇· 5ppm 百菌清，
[0064] -I. 25ppm 那他霉素 +0· 5ppm 百菌清，
[0065] -2. 5ppm那他霉素 +0· 5ppm百菌清。
[0066] 在使用80 μ I PCB介質(zhì)填充微量滴定板的每個孔之后，將活性成分由在甲醇中制 備的單獨儲備溶液加入，由此得到100 μ 1/孔的中間體積。隨后，將在PCB介質(zhì)中制備的 100 μ 1的真菌輪枝霉懸浮物用于接種，各孔接種5. OxlO3孢子/ml。因此，各孔包含200 μ 1 的最終體積和小于1 %的甲醇，其不會影響真菌輪枝霉的生長（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0067] 在25°C下將微量滴定板孵育3至5天，通過計算與沒有活性成分觀察到的霉菌生 長相比在活性成分存在下觀察到的霉菌生長的減少來評估各活性成分的體外抗真菌活性 (%)。根據(jù)Colby方程（Colby，1967)計算活性成分組合的預期抗真菌活性（E，以％計）：
[0068] E = X+Y - [(X · Y)/100]
[0069] 其中X和Y分別為觀察到的各活性成分X和Y的抗真菌活性（以％計）。如果所 觀察到的組合的抗真菌活性（〇,以％計）超過所預期的組合的抗真菌活性（Ε，以％計），因 而所得的協(xié)同因子〇/Ε>1. 0,活性成分的聯(lián)合應用導致協(xié)同抗真菌效果。
[0070] 結(jié)果（參見表1)證實：與單獨的那他霉素或者百菌清相比，那他霉素+百菌清組 合對真菌輪枝霉具有更強的抗真菌活性。在第3天和第5天，組合那他霉素+百菌清所觀 察到的抗真菌活性比所預期的抗真菌活性高100%，因而得到遠大于1. 0的協(xié)同因子。
[0071] 該實施例的結(jié)果清楚地顯示：那他霉素和百菌清的聯(lián)合應用協(xié)同地抑制真菌輪枝 霉的生長。因此，使用那他霉素和百菌清的組合對于控制蘑菇中的干泡病是有利的。
[0072] 實施例2
[0073] 那他霉素和百菌清聯(lián)合應用的協(xié)同抗真菌活性
[0074] 如實例1中所述進行試驗，不同在于測試以下組合物：
[0075] -對照（無活性成分），
[0076] -L 25 或 2. 5ppm 那他霉素
[0077] -〇· 5、I. 0 或 I. 5ppm 百菌清
[0078] -I. 25ppm那他霉素 +0· 5ppm百菌清
[0079] -I. 25ppm那他霉素 +1. Oppm百菌清
[0080] -I. 25ppm那他霉素 +1. 5ppm百菌清
[0081] -2. 5ppm那他霉素 +1. Oppm百菌清
[0082] 而且，將哈茨木霉菌用于接種。25°C下孵育5、10和17天之后，根據(jù)在實例1中描 述的方法來測定單獨和組合的活性成分的抗真菌活性（以％計）。
[0083] 表2中的結(jié)果揭示：與單獨的那他霉素或百菌清相比，那他霉素+百菌清的有效成 分組合更加有效地抑制哈茨木霉的生長。所觀察到的那他霉素+百菌清組合的抗真菌活性 比所預期的抗真菌活性高100%，因而得到遠大于1. 0的協(xié)同因子。
[0084] 因此，那他霉素和百菌清的聯(lián)合應用對哈茨木霉具有強的協(xié)同抗真菌活性。因此， 使用那他霉素和百菌清的組合控制蘑菇中的綠霉病是有利的。
[0085] 表1 :在25°C下孵育后那他霉素聯(lián)合百菌清對真菌輪枝霉的體外抗真菌活性（％ )

【權(quán)利要求】
1. 一種通過將那他霉素和百菌清應用到生長或待生長磨茹的基質(zhì)中來在磨茹生產(chǎn)中 控制真菌病的方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在單一組合物中應用那他霉素和百菌清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中真菌病由輪枝菌（Verticillium)物種、扼抱 霉（Mycogone)物種或者木霉菌（Trichoderma)物種導致。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中在栽種之后將那他霉素和百菌清應 用到所述基質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中在覆蓋之后將那他霉素和百菌清應 用到所述基質(zhì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中在磨茹生產(chǎn)中多于一次地應用那他 霉素和百菌清。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中通過噴霧應用那他霉素和百菌清。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中W 0. 1 - 500g/100m 2的量將那他霉 素應用到所述基質(zhì)的上表面。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中W 10 - 500g/100m2的量將百菌清應 用到所述基質(zhì)的上表面。
10. -種生產(chǎn)磨茹的方法，所述方法包括W下步驟： a. 提供待生長磨茹的基質(zhì)； b. 使用磨茹菌種體接種所述基質(zhì)； C.將覆蓋層添加到所述基質(zhì)； d. 將那他霉素和百菌清應用到所述基質(zhì)； e. 應用刺激磨茹生長的條件；W及 f. 收獲磨茹。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中也在步驟e中將那他霉素和百菌清應用到所述 基質(zhì)。
12. -種生長或待生長磨茹的基質(zhì)，所述基質(zhì)包含那他霉素和百菌清。
13. -種包含那他霉素和百菌清的覆蓋層。
14. 一種包含那他霉素和百菌清的磨茹菌種體。
15. -種包含那他霉素和百菌清的磨茹。
【文檔編號】A01N37/34GK104470365SQ201380037801
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月17日
【發(fā)明者】雅克布斯·斯塔克 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司