本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及催化甲醛合成羥基乙醛的酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自然界中甲基營養(yǎng)菌能夠利用碳一資源合成生長所必需的代謝物。甲基營養(yǎng)菌主要有三種途徑同化甲醛，分別是核酮糖單磷酸途徑(rump)、絲氨酸循環(huán)途徑和甲醛完全氧化之后的calvin-benson-bassham(cbb)循環(huán)途徑。在核酮糖單磷酸途徑(rump)中，三分子甲醛縮合成一分子丙酮酸，然后脫羧形成乙酰輔酶a和co2，此過程碳利用率為67％。絲氨酸循環(huán)途徑需要外部供應(yīng)atp以驅(qū)動熱力學(xué)不利反應(yīng)。同樣，甲醛完全氧化成co2然后利用calvin-benson-bassham(cbb)循環(huán)固定co2也需要額外的atp。atp的供應(yīng)必須消耗額外的碳來驅(qū)動氧化磷酸化。存在于clostridiumljungdahlii的還原乙酰輔酶a途徑，能夠同化甲醛氧化的二氧化碳產(chǎn)生乙酰輔酶a，此過程沒有碳的損失。但是由于此路徑對氧極其敏感，很難在其他物種中應(yīng)用。人工合成路徑-甲醇縮合循環(huán)(mcc)，由核酮糖單磷酸途徑(rump)和非氧化性糖酵解(nog)組成，此結(jié)合途徑既沒有碳的損失也不需要atp的供應(yīng)。甲醛聚糖途徑是將三分子甲醛縮合為1,3-二羥基丙酮，1,3-二羥基丙酮磷酸化為dhap(磷酸二羥基丙酮)。此過程中dhap轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a同樣有碳的損失。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種bfd突變體蛋白。本發(fā)明提供了bfd突變體蛋白，為如下1)-4)中任一所示：1)所示的bfd突變體w86r-n87t的氨基酸序列為將bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突變?yōu)榫彼?，且將?7位的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸，其他氨基酸殘基保持不變，得到的序列；2)所示的bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e為將bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突變?yōu)榫彼?，且將?7位的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸，且將第109位的亮氨酸突變?yōu)楦拾彼?，且將?10位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?，其他氨基酸殘基保持不變，得到的序列?)所示的bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-a460m為將bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突變?yōu)榫彼幔覍⒌?7位的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸，且將第109位的亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔覍⒌?10位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?，且將?60位的丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，其他氨基酸殘基保持不變，得到的序列?)所示的bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m為將bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突變?yōu)榫彼?，且將?7位的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸，且將第109位的亮氨酸突變?yōu)楦拾彼?，且將?10位的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?，且將?60位的丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，且將?81位的組氨酸突變?yōu)槔i氨酸，且將第282位的谷氨酰胺突變?yōu)楸奖彼幔渌被釟埢３植蛔?，得到的序列。上述bfd氨基酸序列為序列表中序列1。編碼上述的蛋白的dna分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。含有上述dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在催化甲醛縮合成羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備催化甲醛縮合成羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在催化甲醛生成乙酰輔酶a或乙酰磷酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備催化甲醛生成乙酰輔酶a或乙酰磷酸產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述蛋白和f/xpk蛋白在催化甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白和f/xpk蛋白在制備催化甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶在催化甲醛產(chǎn)生乙酰輔酶a中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶在制備催化甲醛產(chǎn)生乙酰輔酶a產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明另一個目的是提供一種制備羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：以甲醛為底物，用上述蛋白催化甲醛縮合成羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮。本發(fā)明第三個目的是提供一種利用甲醛生產(chǎn)乙酰輔酶a的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：在上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下催化甲醛生產(chǎn)乙酰輔酶a。本發(fā)明第四個目的是提供一種催化甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述蛋白和f/xpk蛋白。本發(fā)明第五個目的是提供一種催化甲醛產(chǎn)生乙酰輔酶a的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，自然界不存在酶催化甲醛縮合為羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮及1,3-二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸，本發(fā)明通過定點(diǎn)突變bfd發(fā)現(xiàn)該酶的突變體，突變體能催化甲醛縮合為羥基乙醛，這是首次發(fā)現(xiàn)的，實(shí)現(xiàn)了甲醛高效聚合，同時利用f/xpk實(shí)現(xiàn)了羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮(dha)生成乙酰磷酸，結(jié)合磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pta)，三步酶就能夠?qū)崿F(xiàn)甲醛到乙酰輔酶a，從而創(chuàng)建一條新的甲醛同化途徑-甲醛三步合成乙酰輔酶a，此途徑路線短，且沒有碳損失及atp輸入。附圖說明圖1為pet-28a-bfd、pet-28a-f/xpk質(zhì)粒圖譜。圖2為f/xpk蛋白催化羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮得到乙酰磷酸。圖3為bfd突變體及f/xpk雙酶催化甲醛得到乙酰磷酸。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、bfd突變體的制備bfd酶的編碼基因種屬來源為pseudomonasputida，bfd酶的氨基酸如序列1，bfd酶編碼基因的核苷酸序列如序列2所示。分別對bfd酶進(jìn)行單點(diǎn)突變或者多點(diǎn)突變，得到表1所示的bfd突變體。bfd突變體w86r-n87t為將bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突變?yōu)榫彼?arg)，且將第87位的天冬酰胺(asn)突變?yōu)樘K氨酸(thr)，其他氨基酸殘基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t的編碼基因?yàn)閷fd酶編碼基因核苷酸序列(序列2)的第256-258位的tgg突變?yōu)閏gt，且將第259-261位的aac突變?yōu)閍cc，其他堿基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e為將bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突變?yōu)榫彼?arg)，且將第87位的天冬酰胺(asn)突變?yōu)樘K氨酸(thr)，且將第109位的亮氨酸(leu)突變?yōu)楦拾彼?gly)，且將第110位的亮氨酸(leu)突變?yōu)楣劝彼?glu)，其他氨基酸殘基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e的編碼基因?yàn)閷fd酶編碼基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突變?yōu)閏gt，且將第259-261的aac突變?yōu)閍cc，且將第325-327的ctg突變?yōu)間gg，且將第328-330的ctg突變?yōu)間ag，其他堿基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-a460m為將bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突變?yōu)榫彼?arg)，且將第87位的天冬酰胺(asn)突變?yōu)樘K氨酸(thr)，且將第109位的亮氨酸(leu)突變?yōu)楦拾彼?gly)，且將第110位的亮氨酸(leu)突變?yōu)楣劝彼?glu)，且將第460位的丙氨酸(ala)突變?yōu)榧琢虬彼?met)，其他堿基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-a460m的編碼基因?yàn)閷fd酶編碼基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突變?yōu)閏gt，且將第259-261的aac突變?yōu)閍cc，且將第325-327的ctg突變?yōu)間gg，且將第328-330的ctg突變?yōu)間ag，且將第1378-1380位的gct突變?yōu)閍tg，其他堿基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m為將bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突變?yōu)榫彼?arg)，且將第87位的天冬酰胺(asn)突變?yōu)樘K氨酸(thr)，且將第109位的亮氨酸(leu)突變?yōu)楦拾彼?gly)，且將第110位的亮氨酸(leu)突變?yōu)楣劝彼?glu)，且將第460位的丙氨酸(ala)突變?yōu)榧琢虬彼?met)，且將第281位的組氨酸(his)突變?yōu)槔i氨酸(val)，且將第282位的谷氨酰胺(gln)突變?yōu)楸奖彼?phe)，其他氨基酸殘基保持不變，得到的序列。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m的編碼基因?yàn)閷fd酶編碼基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突變?yōu)閏gt，且將第259-261的aac突變?yōu)閍cc，且將第325-327的ctg突變?yōu)間gg，且將第328-330的ctg突變?yōu)間ag，且將第1378-1380位的gct突變?yōu)閍tg，且將第841-843位的cac突變?yōu)間tt，且將第844-846位的cag突變?yōu)閠tt，其他堿基保持不變，得到的序列。二、表達(dá)載體的構(gòu)建1、表達(dá)bfd突變體的載體的構(gòu)建各個表達(dá)bfd突變體的載體為將上述各個bfd突變體的編碼基因插入pet-28a載體的ndei和xhoi酶切位點(diǎn)之間得到的載體。表達(dá)bfd酶的載體為將上述bfd酶的編碼基因(序列2)插入pet-28a載體的ndei和xhoi酶切位點(diǎn)之間得到的載體，命名為pet-28a-bfd(如圖1左圖)2、表達(dá)f/xpk的載體的構(gòu)建f/xpk基因種屬來源為bifidobacteriumadolescentis，f/xpk蛋白的氨基酸如序列3所示，f/xpk蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列4。表達(dá)f/xpk的載體為將上述f/xpk蛋白的編碼基因插入pet-28a載體的ndei和xhoi酶切位點(diǎn)之間得到的載體，命名為pet-28a-f/xpk(如圖1右圖)。三、bfd野生型、bfd突變體和f/xpk的表達(dá)為了體外檢測bfd突變體、f/xpk酶活性，在大腸桿菌中對該酶進(jìn)行外源表達(dá)及純化。(1)將上述二制備的大腸桿菌表達(dá)型重組質(zhì)粒pet-28a-bfd、各個表達(dá)bfd突變體的載體、pet-28a-f/xpk分別轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中，獲得表達(dá)bfd酶的重組菌、各個表達(dá)bfd突變體的重組菌和表達(dá)f/xpk的重組菌。采用卡那霉素抗性平板進(jìn)行陽性克隆篩選(kan+，100mg/ml)，37℃過夜培養(yǎng)；(2)挑單克隆至5mllb液體培養(yǎng)基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220r/min培養(yǎng)至od600為0.6-0.8。將5mllb培養(yǎng)基中菌液轉(zhuǎn)接至800ml2yt培養(yǎng)基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220rpm培養(yǎng)至od600為0.6-0.8時，降溫至16℃，加iptg至終濃度0.5mm，誘導(dǎo)表達(dá)16h；(3)將上述培養(yǎng)菌液收集到收菌瓶中，5500rpm離心15min；(4)棄上清，用35ml蛋白緩沖液(50mm磷酸鹽緩沖液，ph7.4)將所得菌體沉淀懸起，倒入50ml離心管中，-80℃冰箱保存，得到表達(dá)bfd酶的菌體、各個表達(dá)bfd突變體的菌體和表達(dá)f/xpk的菌體。四、bfd野生型，bfd突變體和f/xpk的純化(1)破菌：采用高壓低溫破碎儀，在壓力1200bar，4℃條件下分別對表達(dá)bfd酶的菌體、各個表達(dá)bfd突變體的菌體和表達(dá)f/xpk的菌體進(jìn)行破菌2次。4℃、10000r/min離心45min；(2)純化：上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜抽濾，進(jìn)行鎳親和層析純化，具體步驟如下：a：柱平衡：掛上清前，先用ddh2o洗2個柱體積，再用蛋白緩沖液平衡ni親和層析柱1個柱體積；b：上樣：將上清按0.5ml/min流速緩慢經(jīng)過ni親和層析柱，重復(fù)一次；c：洗脫雜蛋白：用蛋白緩沖液沖洗1個柱體積，然后分別用50ml含50mm，100mm咪唑的蛋白緩沖液去洗脫結(jié)合較強(qiáng)的雜蛋白；d：洗脫目的蛋白：用20ml含200mm咪唑的蛋白緩沖液(50mm磷酸鉀，ph＝7.4，5mmmgso4)將目的蛋白洗脫下來，取前幾滴流川樣品，制樣，12％sds-page檢測。(3)換液：將收集到的目的蛋白用50mlamicon超濾管(30kda，millipore公司)離心濃縮(4℃、3400r/min)，濃縮至1ml。加15ml不含咪唑的蛋白緩沖液，濃縮至1ml，重復(fù)1次，得到bfd、f/xpk蛋白。(4)用nondrop2000微量分光光度計檢測濃縮后蛋白濃度并稀釋至10mg/ml，即得到bfd蛋白、各個bfd突變體蛋白和f/xpk蛋白。實(shí)施例2、bfd突變體蛋白的功能檢測一、bfd突變體蛋白催化甲醛縮合為羥基乙醛和1,3-二羥基丙酮檢測方法：將實(shí)施例1的三制備的表達(dá)bfd酶的重組菌、各個表達(dá)bfd突變體的重組菌和表達(dá)f/xpk的重組菌于200ml2yt37℃培養(yǎng)至od600＝0.6，0.5mmiptg16℃誘導(dǎo)18h，3500rpm離心15min，蛋白緩沖液洗去培養(yǎng)基，收集菌體，再分別用20ml加入0.5mmtpp的蛋白緩沖液重懸。取500ul重懸菌液再加入500ul由蛋白緩沖液配制含0.5mmtpp的終濃度為5g/l的甲醛溶液，37℃，750rpm反應(yīng)2h,離心取上清，進(jìn)行液相檢測。液相檢測選用aminexhpx-87h,300x7.8mm柱子,5mm硫酸作為流動相，每次進(jìn)樣20ul,柱溫箱35℃，200nm紫外條件下檢測羥基乙醛和1,3-二羥基丙酮，外標(biāo)法確定含量。結(jié)果如表1所示，可以看出，與未突變的bfd相比，bfd突變體蛋白催化甲醛縮合為1,3-二羥基丙酮產(chǎn)量均提高；與未突變的bfd相比，雙突變的bfd突變體中w86r-n87t的羥基乙醛產(chǎn)量最高，4突變的bfd突變體中w86r-n87t-l109g-l110e的羥基乙醛產(chǎn)量最高，5突變的bfd突變體中w86r-n87t-l109g-l110e-a460m的羥基乙醛產(chǎn)量最高，7突變的bfd突變體中w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m的羥基乙醛產(chǎn)量最高，且高于其余突變位點(diǎn)。表1為bfd突變體活性檢測二、f/xpk蛋白催化羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮得到乙酰磷酸1、檢測試劑的配置：2mph7.5鹽酸羥胺(100ml)：稱取13.5g鹽酸羥胺固體溶解于190mlddh2o中，用固體氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至6.5，后用ddh2o定容至200ml。顯色液1：15％三氯乙酸(10ml)，稱取150mg三氯乙酸溶解于10mlddh2o中。顯色液2：4mhcl(10ml)，取3.333ml濃鹽酸溶解于ddh2o中定容至10ml。顯色液3：5％三氯化鐵(10ml)，稱取50mg三氯化鐵溶解于0.1mhcl中，定容至10ml。2、反應(yīng)1)f/xpk催化羥基乙醛或1,3二羥基丙酮：實(shí)驗(yàn)組：10mm1,3二羥基丙酮或羥基乙醛、50mmtri-cl緩沖液ph7.4、20mmkh2po4、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。無酶對照：10mm1,3二羥基丙酮或羥基乙醛、50mmtri-cl緩沖液ph7.4、20mmkh2po4、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。無底物對照：50mmtri-cl緩沖液ph7.4、20mmkh2po4、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。檢測方法：取上述反應(yīng)液75ul與75ul2mph7.5鹽酸羥胺溶液30℃反應(yīng)10min。后加入顯色液1，顯色液2，顯色液3各50ul。將顯色后的反應(yīng)液12000rpm離心2min，取上清130ul，在505nm下測量(乙酰磷酸)其吸光值。結(jié)果見圖2，可以看出，上述bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m得到的羥基乙醛或1,3-二羥基丙酮可在f/xpk蛋白催化下獲得乙酰磷酸。2)bfd突變體及f/xpk雙酶催化甲醛得到乙酰磷酸實(shí)驗(yàn)組：3g/l甲醛、50mmtri-cl緩沖液ph7.4、20mmkh2po4、1mg/mlbfd或其突變體、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。無酶對照：3g/l甲醛、50mmtri-cl緩沖液ph7.4、20mmkh2po4、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。無底物對照：50mmtri-cl緩沖液ph7.4、20mmkh2po4、1mg/mlbfd或其突變體、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。檢測方法：取上述反應(yīng)液75ul與75ul2mph7.5鹽酸羥胺溶液30℃反應(yīng)10min。后加入顯色液1，顯色液2，顯色液3各50ul。將顯色后的反應(yīng)液12000rpm離心2min，取上清130ul，在505nm下測量(乙酰磷酸)其吸光值。bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m結(jié)果如圖3所示，可以看出，上述bfd突變體蛋白與f/xpk蛋白將甲醛催化得到乙酰磷酸。三、乙酰磷酸在pta酶的催化下合成乙酰輔酶a1、pta催化乙酰磷酸生成乙酰輔酶a1mg/mlpta、20mmnh4cl、20mmkcl、1mmtpp、5mmmgcl2、3mm乙酰磷酸(上述二的2中bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m和f/xpk催化甲醛得到的乙酰磷酸)、10mm磷酸鉀、2mm輔酶a、50mmph7.5tris-clbuffer，37℃震蕩反應(yīng)0min，10min，得到反應(yīng)液。檢測方法：取反應(yīng)液100ul加入900ul50mmph7.5tris-clbuffer，于233nm測量其吸光值，結(jié)果見表2。表2為乙酰磷酸合成乙酰輔酶a檢測數(shù)據(jù)反應(yīng)時間od2330min0.64010min1.077計算方法：取反應(yīng)0min時的od233為e1，反應(yīng)10min時的od233為e2。乙酰輔酶a與輔酶a的摩爾消光系數(shù)之差為△ε。c乙酰輔酶a為乙酰輔酶a的濃度c乙酰輔酶a＝10*(e2-e1)/△ε乙酰輔酶a濃度為0.98mm。2、bfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m、f/xpk及pta三酶催化甲醛生成乙酰輔酶a0.2mg/mlbfd突變體w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m、0.2mg/mlf/xpk、0.2mg/mlpta、20mmnh4cl、20mmkcl、1mmtpp、5mmmgcl2、0.1g/l甲醛、10mm磷酸鉀、2mm輔酶a、50mmph7.5tris-clbuffer，37℃震蕩反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液。檢測方法：取反應(yīng)液100ul加入900ul50mmph7.5tris-clbuffer，于233nm測量其吸光值.結(jié)果見表3。表3為甲醛生成乙酰輔酶a檢測數(shù)據(jù)反應(yīng)時間od2330min0.033120min0.147計算方法：取反應(yīng)0min時的od233為ea，反應(yīng)120min時的od233為eb。乙酰輔酶a與輔酶a的摩爾消光系數(shù)之差為△ε。c乙酰輔酶a為乙酰輔酶a的濃度c乙酰輔酶a＝10*(eb-ea)/△ε可以看出，以甲醛為底物得到乙酰輔酶a濃度為0.257mm。野生型bfd催化0.1g/l甲醛，得不到羥基乙醛和1,3-二羥基丙酮，因此野生型bfd與其余兩個酶反應(yīng)檢測不到乙酰輔酶a。四、甲醛生物合成乙酰輔酶a途經(jīng)獲得從上述可以看出，甲醛生物合成乙酰輔酶a途經(jīng)可以為如下兩條中任一條：(1)(2)序列表<110>中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所<120>催化甲醛合成羥基乙醛的酶及其應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>528<212>prt<213>人工序列<220><223><400>1metalaservalhisglythrthrtyrgluleuleuargargglngly151015ileaspthrvalpheglyasnproglyserasngluleupropheleu202530lysasppheprogluasppheargtyrileleualaleuglngluala354045cysvalvalglyilealaaspglytyralaglnalaserarglyspro505560alapheileasnleuhisseralaalaglythrglyasnalametgly65707580alaleuserasnalatrpasnserhisserproleuilevalthrala859095glyglnglnthrargalametileglyvalglualaleuleuthrasn100105110valaspalaalaasnleuproargproleuvallystrpsertyrglu115120125proalaseralaalagluvalprohisalametserargalailehis130135140metalasermetalaproglnglyprovaltyrleuservalprotyr145150155160aspasptrpasplysaspalaaspproglnserhishisleupheasp165170175arghisvalserserservalargleuasnaspglnaspleuaspile180185190leuvallysalaleuasnseralaserasnproalailevalleugly195200205proaspvalaspalaalaasnalaasnalaaspcysvalmetleuala210215220gluargleulysalaprovaltrpvalalaproseralaproargcys225230235240propheprothrarghisprocyspheargglyleumetproalagly245250255ilealaalaileserglnleuleugluglyhisaspvalvalleuval260265270ileglyalaprovalpheargtyrhisglntyraspproglyglntyr275280285leulysproglythrargleuileservalthrcysaspproleuglu290295300alaalaargalaprometglyaspalailevalalaaspileglyala305310315320metalaseralaleualaasnleuvalglugluserserargglnleu325330335prothralaalaprogluproalalysvalaspglnaspalaglyarg340345350leuhisprogluthrvalpheaspthrleuasnaspmetalaproglu355360365asnalailetyrleuasngluserthrserthrthralaglnmettrp370375380glnargleuasnmetargasnproglysertyrtyrphecysalaala385390395400glyglyleuglyphealaleuproalaalaileglyvalglnleuala405410415gluprogluargglnvalilealavalileglyaspglyseralaasn420425430tyrserileseralaleutrpthralaalaglntyrasnileprothr435440445ilephevalilemetasnasnglythrtyrglyalaleuargtrpphe450455460alaglyvalleuglualagluasnvalproglyleuaspvalprogly465470475480ileasppheargalaleualalysglytyrglyvalglnalaleulys485490495alaaspasnleugluglnleulysglyserleuglnglualaleuser500505510alalysglyprovalleuilegluvalserthrvalserprovallys515520525<210>2<211>1584<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2atggcttctgttcacggtaccacctacgaactgctgcgtcgtcagggtatcgacaccgtt60ttcggtaacccgggttctaacgaactgccgttcctgaaagacttcccggaagacttccgt120tacatcctggctctgcaggaagcttgcgttgttggtatcgctgacggttacgctcaggct180tctcgtaaaccggctttcatcaacctgcactctgctgctggtaccggtaacgctatgggt240gctctgtctaacgcttggaactctcactctccgctgatcgttaccgctggtcagcagacc300cgtgctatgatcggtgttgaagctctgctgaccaacgttgacgctgctaacctgccgcgt360ccgctggttaaatggtcttacgaaccggcttctgctgctgaagttccgcacgctatgtct420cgtgctatccacatggcttctatggctccgcagggtccggtttacctgtctgttccgtac480gacgactgggacaaagacgctgacccgcagtctcaccacctgttcgaccgtcacgtttct540tcttctgttcgtctgaacgaccaggacctggacatcctggttaaagctctgaactctgct600tctaacccggctatcgttctgggtccggacgttgacgctgctaacgctaacgctgactgc660gttatgctggctgaacgtctgaaagctccggtttgggttgctccgtctgctccgcgttgc720ccgttcccgacccgtcacccgtgcttccgtggtctgatgccggctggtatcgctgctatc780tctcagctgctggaaggtcacgacgttgttctggttatcggtgctccggttttccgttac840caccagtacgacccgggtcagtacctgaaaccgggtacccgtctgatctctgttacctgc900gacccgctggaagctgctcgtgctccgatgggtgacgctatcgttgctgacatcggtgct960atggcttctgctctggctaacctggttgaagaatcttctcgtcagctgccgaccgctgct1020ccggaaccggctaaagttgaccaggacgctggtcgtctgcacccggaaaccgttttcgac1080accctgaacgacatggctccggaaaacgctatctacctgaacgaatctacctctaccacc1140gctcagatgtggcagcgtctgaacatgcgtaacccgggttcttactacttctgcgctgct1200ggtggtctgggtttcgctctgccggctgctatcggtgttcagctggctgaaccggaacgt1260caggttatcgctgttatcggtgacggttctgctaactactctatctctgctctgtggacc1320gctgctcagtacaacatcccgaccatcttcgttatcatgaacaacggtacctacggtgct1380ctgcgttggttcgctggtgttctggaagctgaaaacgttccgggtctggacgttccgggt1440atcgacttccgtgctctggctaaaggttacggtgttcaggctctgaaagctgacaacctg1500gaacagctgaaaggttctctgcaggaagctctgtctgctaaaggtccggttctgatcgaa1560gtttctaccgtttctccggttaaa1584<210>3<211>825<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3metthrserprovalileglythrprotrplyslysleuasnalapro151015valsergluglualailegluglyvalasplystyrtrpargalaala202530asntyrleuserileglyglniletyrleuargserasnproleumet354045lysgluprophethrarggluaspvallyshisargleuvalglyhis505560trpglythrthrproglyleuasnpheleuileglyhisileasnarg65707580leuilealaasphisglnglnasnthrvalileilemetglyprogly859095hisglyglyproalaglythralaglnsertyrleuaspglythrtyr100105110thrglutyrpheproasnilethrlysaspglualaglyleuglnlys115120125phepheargglnphesertyrproglyglyileproserhistyrala130135140progluthrproglyserilehisgluglyglygluleuglytyrala145150155160leuserhisalatyrglyalavalmetasnasnproserleupheval165170175proalailevalglyaspglyglualagluthrglyproleualathr180185190glytrpglnserasnlysleuileasnproargthraspglyileval195200205leuproileleuhisleuasnglytyrlysilealaasnprothrile210215220leuserargileseraspglugluleuhisgluphephehisglymet225230235240glytyrgluprotyrgluphevalalaglypheaspasngluasphis245250255leuserilehisargargphealagluleuphegluthrvalpheasp260265270gluilecysaspilelysalaalaalaglnthraspaspmetthrarg275280285prophetyrprometileilepheargthrprolysglytrpthrcys290295300prolyspheileaspglylyslysthrgluglysertrpargserhis305310315320glnvalproleualaseralaargaspthrglualahisphegluval325330335leulysasntrpleuglusertyrlysproglugluleupheaspglu340345350asnglyalavallysprogluvalthralaphemetprothrglyglu355360365leuargileglygluasnproasnalaasnglyglyargileargglu370375380gluleulysleuprolysleugluaspt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