本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx及其制備方法。

背景技術(shù)：

胃癌是世界范圍內(nèi)腫瘤致死的第三大原因，其發(fā)病率與死亡率均居我國惡性腫瘤第二位。在我國，超過70％患者確診時(shí)已是進(jìn)展期或晚期，失去手術(shù)根治機(jī)會，藥物治療是進(jìn)展期胃癌的主要手段。在胃癌三大類化療藥物中，紫杉醇具有療效高、耐受性好等特性被廣泛用于胃癌治療。但隨著用藥時(shí)間的延長，紫杉醇耐藥嚴(yán)重阻礙了患者繼續(xù)獲益。研究紫杉醇耐藥機(jī)制并探索逆轉(zhuǎn)耐藥策略是解決問題的關(guān)鍵，因此急需良好的耐藥機(jī)制研究模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供研究人胃癌的紫杉醇耐藥機(jī)制的模型。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx。

本發(fā)明所提供的人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為cgmccno.13596。

所述人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptxcgmccno.13596在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述產(chǎn)品的功能可為a1)或a2)或a3)：

a1)作為耐藥模型；

a2)研究人胃癌的紫杉醇耐藥機(jī)制；

a3)研究人胃癌細(xì)胞的耐藥表型。

人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞的制備方法可包括如下步驟：以人胃癌細(xì)胞系hgc-27為親本細(xì)胞，采用紫杉醇誘導(dǎo)，獲得人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞。

上述制備方法中，所述“采用紫杉醇誘導(dǎo)”依次可包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系hgc-27，得到細(xì)胞懸浮液；

(2)完成步驟(1)后，進(jìn)行紫杉醇誘導(dǎo)，直至人胃癌細(xì)胞系hgc-27能在紫杉醇下正常生長；進(jìn)行紫杉醇誘導(dǎo)時(shí)，紫杉醇濃度逐減提高。

上述制備方法中，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基具體可為含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基。

上述制備方法中，所述培養(yǎng)的條件為：37℃。

上述制備方法中，所述“進(jìn)行紫杉醇誘導(dǎo)時(shí)，紫杉醇濃度逐步提高”具體可為進(jìn)行紫杉醇誘導(dǎo)時(shí)，紫杉醇濃度依次可為2.3nm、4.6nm、9.2nm、18.4nm、36.8nm、73.6nm和149.9nm。

所述人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptxcgmccno.13596在鑒定待測藥物對腫瘤抗性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述腫瘤可為胃癌。

所述人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptxcgmccno.13596在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述抗腫瘤藥物可為抗胃癌藥物。

所述人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptxcgmccno.13596在篩選抑制腫瘤增殖的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述腫瘤可為胃癌。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：

(1)人胃癌細(xì)胞系hgc-27是一個(gè)良好的體外模型。臨床用于治療胃癌的化療藥物在使用的過程中經(jīng)常出現(xiàn)耐藥性問題，病人對藥物產(chǎn)生耐藥是影響其化療獲益的重要原因。本發(fā)明提供的人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，便于對導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

(2)本發(fā)明提供的人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx具有臨床上胃癌病人的生物學(xué)性狀，是研究胃癌病人耐藥機(jī)制的理想模型，大大方便了對其生物學(xué)特性及耐藥表型的變化進(jìn)行研究。

(3)抗腫瘤藥物的最大缺點(diǎn)是易產(chǎn)生耐藥性而使化療失效，而且，通常情況下，某種耐藥細(xì)胞常常會對多種藥物有交叉耐藥現(xiàn)象，即一種藥物的耐藥也會導(dǎo)致機(jī)體對其它藥物的耐受。本發(fā)明建立的這套細(xì)胞模型，對紫杉醇產(chǎn)生耐藥，但對其它兩個(gè)胃癌常用化療藥物(順鉑和氟尿嘧啶)無耐藥性，是理想的單藥紫杉醇耐藥機(jī)制研究模型。

因此，本發(fā)明提供的人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptxcgmccno.13596具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

保藏說明

科學(xué)描述：人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞

參據(jù)的生物材料(株)：hgc-27/ptx

保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機(jī)構(gòu)簡稱：cgmcc

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2017年2月7日

保藏中心登記入冊編號：cgmccno.13596

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均購買于具有資質(zhì)的常規(guī)生物材料公司。以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

rpmi-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％edta胰蛋白酶(商品名稱為“0.25％trypsin-edta(1×)”)和100×青霉素/鏈霉素均為gibco公司的產(chǎn)品。磷酸鹽緩沖液(即pbs緩沖液)為hyclone公司的產(chǎn)品。人胃癌細(xì)胞系hgc-27為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心的產(chǎn)品。紫杉醇注射液為北京協(xié)和藥廠的產(chǎn)品；規(guī)格為30mg/5ml。順鉑注射液為hospiraaustraliaptyltd的產(chǎn)品；規(guī)格為50mg/50ml。氟尿嘧啶注射液為天津金耀藥廠的產(chǎn)品；規(guī)格為0.25g/10ml。

含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基由10體積份胎牛血清、1體積份100×青霉素/鏈霉素和89體積份rpmi-1640完全培養(yǎng)基混合而成。

cck-8工作液的制備方法為：由10體積份cck-8和90體積份rpmi-1640完全培養(yǎng)基混合而成。cck-8為日本同仁化學(xué)研究所的產(chǎn)品。

相對活性計(jì)算公式：

耐藥指數(shù)計(jì)算公式：

耐藥指數(shù)＝hgc-27/ptx的半抑制濃度/hgc-27/dz的半數(shù)抑制濃度。

實(shí)施例1、人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞的建立

一、人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞的建立

采用逐步遞增紫杉醇濃度、間歇作用體外誘導(dǎo)法構(gòu)建人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞。具體步驟依次如下：

1、制備hgc-27懸浮液

用0.25％edta胰蛋白酶消化人胃癌細(xì)胞系hgc-27，然后加入“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基”，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到細(xì)胞密度為72×10⁵個(gè)/ml的hgc-27懸浮液。

2、制備培養(yǎng)體系

取細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入rpmi-1640完全培養(yǎng)基、hgc-27懸浮液和紫杉醇注射液，得到培養(yǎng)體系。該培養(yǎng)體系中，人胃癌細(xì)胞系hgc-27的濃度為36×10⁵個(gè)/ml，紫杉醇的濃度為2.3nm。

3、培養(yǎng)

將步驟2得到的培養(yǎng)體系置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。

4、清洗

取步驟3收集的細(xì)胞，加入適量pbs緩沖液清洗3次(目的為洗去死細(xì)胞并盡量去除殘留藥物對細(xì)胞的影響)。

5、穩(wěn)定生長、傳代和復(fù)蘇

取完成步驟4的細(xì)胞，加入rpmi-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞恢復(fù)正常生長(培養(yǎng)期間用0.25％edta胰蛋白酶消化細(xì)胞并穩(wěn)定傳代3次)。

按照上述步驟，將“紫杉醇的濃度為2.3nm”依次替換為“紫杉醇的濃度為4.6nm”、“紫杉醇的濃度為9.2nm”、“紫杉醇的濃度為18.4nm”、“紫杉醇的濃度為36.8nm”“紫杉醇的濃度為73.6nm”和“紫杉醇的濃度為149.9nm”，其它步驟均相同，獲得人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx。

經(jīng)過檢測，在紫杉醇濃度為149.9nm時(shí)，人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx可穩(wěn)定生長、傳代和復(fù)蘇。

人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx已于2017年2月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.13596。人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx的全稱為人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptxcgmccno.13596，簡稱為hgc-27/ptx。

在誘導(dǎo)篩選獲得人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx的過程中，將親本細(xì)胞(即人胃癌細(xì)胞系hgc-27)常規(guī)培養(yǎng)并傳代，最終使親本細(xì)胞和人紫杉醇耐藥胃癌細(xì)胞hgc-27/ptx具有大致相同的傳代次數(shù)。將該培養(yǎng)后的親本細(xì)胞命名為hgc-27/dz。

二、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下分別觀察hgc-27/dz和hgc-27/ptx的形態(tài)，比較兩者細(xì)胞形態(tài)、大小及內(nèi)容物等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1(a和b為hgc-27/dz，c和d為hgc-27/ptx)。結(jié)果表明，hgc-27/dz和hgc-27/ptx均呈單層貼壁生長；hgc-27/dz細(xì)胞大小均一、邊界清晰、細(xì)胞多呈梭形；與hgc-27/dz相比，hgc-27/ptx明顯變短變圓，且有成團(tuán)聚集生長趨勢，多數(shù)細(xì)胞具有短觸角，有多核現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多。

實(shí)施例2、hgc-27/ptx對紫杉醇、順鉑和氟尿嘧啶的敏感性

1、hgc-27/ptx對紫杉醇的敏感性

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組，然后進(jìn)行如下步驟：

(1)在含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)待測細(xì)胞(hgc-27/ptx或hgc-27/dz)，獲得細(xì)胞懸浮液。

(2)取96孔板，每孔接種100μl步驟(1)制備的細(xì)胞懸浮液(每孔含待測細(xì)胞約1×10⁴個(gè))，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(3)完成步驟(2)后，取所述96孔板，加入紫杉醇注射液，得到處理體系；當(dāng)待測細(xì)胞為hgc-27/ptx時(shí)，處理體系中的紫杉醇的濃度為2.5nm、5nm、10nm、50nm、250nm或1250nm(每個(gè)紫杉醇濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)；當(dāng)待測細(xì)胞為hgc-27/dz時(shí)，處理體系中的紫杉醇的濃度為1nm、2nm、4nm、8nm、16nm、32nm、64nm或128nm(每個(gè)紫杉醇濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)。

(4)完成步驟(3)后，將所述96孔板置于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后棄掉各孔中培養(yǎng)基，每孔迅速加入100μlcck-8工作液，繼續(xù)5％co2、37℃培養(yǎng)30min、1h或2h。最后采用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光值，按吸光值在1.0～2.0之間的組(按培養(yǎng)時(shí)間不同分組的)的數(shù)據(jù)計(jì)算hgc-27/ptx細(xì)胞增殖程度。

設(shè)置空白對照組：用等體積“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基”代替細(xì)胞懸浮液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)紫杉醇濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

設(shè)置細(xì)胞對照組：用等體積“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基代替紫杉醇注射液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞懸浮液設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

以紫杉醇在孔中的濃度為橫坐標(biāo)，相對活性為縱坐標(biāo)，比較紫杉醇處理后待測細(xì)胞增殖的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1中第二行。結(jié)果表明，hgc-27/ptx的半數(shù)抑制濃度(ic50)為658.3nm，hgc-27/dz的半數(shù)抑制濃度(ic50)為4.73nm；耐藥指數(shù)(ri)為139.18。因此，hgc-27/ptx屬于高度耐紫杉醇(已有文獻(xiàn)記載：耐藥指數(shù)<5，為低度耐藥；5<耐藥指數(shù)<15，為中等耐藥；耐藥指數(shù)>15，為高度耐藥))。

表1

注：*表示差異顯著。

2、hgc-27/ptx對順鉑的敏感性

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組，然后進(jìn)行如下步驟：

(1)同步驟1中(1)。

(2)同步驟1中(2)。

(3)完成步驟(2)后，取所述96孔板，加入順鉑注射液，得到處理體系；處理體系中的順鉑的濃度為0.5nm、1nm、2nm、4nm、8nm或16nm(每個(gè)順鉑濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)。

(4)同步驟1中(4)。

設(shè)置空白對照組：用等體積“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基”代替細(xì)胞懸浮液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)順鉑濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

設(shè)置細(xì)胞對照組：用等體積“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基”代替順鉑注射液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞懸浮液設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

以順鉑在孔中的濃度為橫坐標(biāo)，相對活性為縱坐標(biāo)，比較順鉑處理后待測細(xì)胞增殖的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1中第三行。結(jié)果表明，hgc-27/dz和hgc-27/ptx對順鉑的敏感性無顯著差異。

3、hgc-27/ptx對氟尿嘧啶的敏感性

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組，然后進(jìn)行如下步驟：

(1)同步驟1中(1)。

(2)同步驟1中(2)。

(3)完成步驟(2)后，取所述96孔板，加入氟尿嘧啶注射液，得到處理體系；處理體系中的氟尿嘧啶的濃度為1nm、2nm、4nm、8nm、16nm、32nm、64nm或128nm(每個(gè)氟尿嘧啶濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)。

(4)同步驟1中(4)。

設(shè)置空白對照組：用等體積“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基”代替細(xì)胞懸浮液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)氟尿嘧啶濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

設(shè)置細(xì)胞對照組：用等體積“含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基”代替氟尿嘧啶注射液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞懸浮液設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

以氟尿嘧啶在孔中的濃度為橫坐標(biāo)，相對活性為縱坐標(biāo)，比較氟尿嘧啶處理后待測細(xì)胞增殖的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1中第四行。結(jié)果表明，hgc-27/dz和hgc-27/ptx對氟尿嘧啶的敏感性無顯著差異。

上述結(jié)果表明，hgc-27/ptx對紫杉醇產(chǎn)生耐藥，但對其它兩個(gè)胃癌常用化療藥物(順鉑和氟尿嘧啶)無耐藥性，是理想的單藥紫杉醇耐藥機(jī)制研究模型。

實(shí)施例3、hgc-27/ptx的細(xì)胞周期檢測

1、在含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素/鏈霉素的rpmi-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)待測細(xì)胞(hgc-27/ptx或hgc-27/dz)，獲得細(xì)胞懸浮液甲。

2、取6孔板，每孔接種2ml步驟(1)制備的細(xì)胞懸浮液甲(每孔約含待測細(xì)胞30×10⁴個(gè))，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

3、取所述6孔板，加入紫杉醇注射液，得到處理體系；當(dāng)待測細(xì)胞為hgc-27/ptx時(shí)，處理體系中的紫杉醇的濃度為128nm、200nm或400nm(每個(gè)紫杉醇濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)；當(dāng)待測細(xì)胞為hgc-27/dz時(shí)，處理體系中的紫杉醇的濃度為1nm、2nm或4nm(每個(gè)紫杉醇濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)。

4、完成步驟3后，將所述6孔板置于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，獲得細(xì)胞懸浮液乙。

5、取細(xì)胞懸浮液甲或細(xì)胞懸浮液乙，室溫1000rpm/min離心5min，收集沉淀。

6、取步驟5收集的沉淀，加入1ml預(yù)冷的pbs緩沖液重懸，然后室溫1000rpm/min離心5min，收集沉淀。

7、取步驟6收集的沉淀，加入250μl預(yù)冷的pbs緩沖液重懸，然后逐滴加入750μl預(yù)冷的無水乙醇(邊滴加邊搖動)，混勻，置于4℃冰箱中過夜固定。

8、完成步驟7后，室溫1000rpm/min離心5min，收集沉淀。

9、取步驟8收集的沉淀，加入1mlpbs緩沖液重懸，室溫1000rpm/min離心5min，收集沉淀。

10、取步驟9收集的沉淀，加入300μlpi/rnase緩沖液，室溫避光孵育15min；細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，然后用graphpadprism5軟件分析細(xì)胞周期的分布。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，與hgc-27/dz相比，hgc-27/ptx的s期(41.44％vs.32.9％，p＜0.01)與g2/m期細(xì)胞(37.87％vs.18.36％，p＜0.01)的比例明顯增多；用紫杉醇處理hgc-27/dz時(shí)，g2/m期細(xì)胞比例隨紫杉醇濃度增加而增加；用紫杉醇處理hgc-27/ptx時(shí)，紫杉醇對細(xì)胞周期的影響較小，說明hgc-27/ptx已對紫杉醇產(chǎn)生耐藥。