本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及雜交瘤細(xì)胞株2d4及其產(chǎn)生的抗游離棉酚通用單克隆抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

棉酚(gossypol)是存在于錦葵科植物屬色素腺產(chǎn)生的多酚萘衍生物，存在于葉和種子中。棉酚的結(jié)構(gòu)為1,1’6,6’7,7’-六羥基-3,3’-二甲基-5,5’-二異丙基-2,2’-聯(lián)萘-8,8’-二醛。棉酚按其存在形式可分為游離棉酚和結(jié)合棉酚兩類。游離棉酚中的活性基團(tuán)(醛基和羥基)可與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞酶活，降低蛋白質(zhì)消化率，導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩、中毒及死亡。

棉籽榨油后棉酚部分轉(zhuǎn)化為游離棉酚殘留在棉籽餅粕中，平均含量為700-1920mg/kg。棉粕蛋白含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近豆粕，在蛋白質(zhì)原料緊缺的形勢(shì)下，棉籽餅粕作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料在中國(guó)畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用日漸廣泛，但棉籽餅粕中含有游離棉酚，如果在日糧中使用不當(dāng)，容易造成動(dòng)物棉酚中毒，同時(shí)人類如果食用含棉酚畜產(chǎn)品也存在安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，歐盟、中國(guó)、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)制定了飼料、飼料原料和人類食品中棉酚含量限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，中國(guó)現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(gb13078-2001)對(duì)于飼料中游離棉酚允許量規(guī)定為棉籽餅粕原料≤1200mg/kg。棉酚是棉籽中重要內(nèi)源毒素質(zhì)量參數(shù)，建立快速、高效、簡(jiǎn)便的游離棉酚檢測(cè)方法能夠?yàn)槭召?gòu)過(guò)程中質(zhì)量定標(biāo)提供保障。

目前檢測(cè)棉籽餅粕及棉籽油中游離棉酚的方法主要包括高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法、分光光度法(苯胺法)、免疫化學(xué)分析法等。但是，高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法等運(yùn)用儀器的方法雖然靈敏度較高、操作簡(jiǎn)單，但對(duì)儀器設(shè)備要求高、檢測(cè)費(fèi)用高，很難推廣使用；分光光度法雖然普遍，但該方法存在靈敏度低、毒性大、操作費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對(duì)技術(shù)人員相對(duì)要求低等特點(diǎn)，適用于大量樣品的快速篩查。因此，提供對(duì)游離棉酚具有較高親和力和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體，對(duì)于檢測(cè)棉籽餅粕及棉籽油中游離棉酚具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抗游離棉酚通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供有上述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，該抗體對(duì)游離棉酚具有較好的親和力和檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立測(cè)定棉籽及其制品中游離棉酚總量的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明抗游離棉酚通用單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2d4已于2015年5月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為cgmccno.10872，分類命名為單克隆細(xì)胞株。

本發(fā)明抗游離棉酚通用單克隆抗體是由保藏號(hào)為cgmccno.10872的小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2d4所分泌。

上述抗游離棉酚通用單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株和其所分泌的單克隆抗體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述雜交瘤細(xì)胞株或單克隆抗體可應(yīng)用于檢測(cè)棉籽及其制品中的游離棉酚。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述雜交瘤細(xì)胞株或單克隆抗體可用于制備用于檢測(cè)棉籽及其制品中游離棉酚的藥劑或試劑盒中。

本發(fā)明提供的抗游離棉酚通用單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2d4的制備基本步驟為：

(1)免疫原的制備與鑒定：取醋酸棉酚溶于甲醇中，與bsa(牛血清白蛋白)溶液混合，之后加入氰基硼氫化鈉(nabh3cn)，室溫下避光攪拌。之后用pbs溶液透析，分裝保存；

(2)小鼠的免疫：將抗原與等量弗式佐劑混合均勻后，通過(guò)頸背部多點(diǎn)注射免疫balb/c小鼠。免疫過(guò)程總共六次：首次每只100μl，間隔21天，之后二免到五免每只50ul，最后一次為腹腔沖刺免疫，每只25ul；

(3)細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過(guò)聚乙二醇(peg4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)hat培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接elisa檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株2d4；

(4)雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：采用小鼠單抗ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗套裝測(cè)定；通過(guò)elisa法測(cè)定ic50值。

其中，在步驟(1)中，醋酸棉酚的醛基與蛋白上的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)后，形成席夫堿，但由于碳氮雙鍵不穩(wěn)定，故又通過(guò)加入氰基硼氫化鈉來(lái)還原碳氮雙鍵為單鍵，使偶聯(lián)產(chǎn)物可以穩(wěn)定存在。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明中所使用的氰基硼氫化鈉還原了蛋白與小分子之間的碳氮雙鍵，使免疫原更加穩(wěn)定，更有利于免疫原的保存；

(2)本發(fā)明獲得的抗游離棉酚單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)游離棉酚有較好的檢測(cè)靈敏度和親和力(ic50值為100ug/kg)；

(3)本發(fā)明的細(xì)胞株應(yīng)用產(chǎn)生的免疫分析方法對(duì)儀器設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，便于快速檢測(cè)及推廣使用。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1為完全抗原紫外吸收光譜表征圖；其中，gos-bsa30、gos-bsa60、gos-bsa90分別表示小分子與蛋白投料比例為30:1、60:1、90:1；

圖2為細(xì)胞株2d4所產(chǎn)單克隆抗體對(duì)游離棉酚的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株2d4的制備

1、完全抗原的合成

取醋酸棉酚(5mg)溶于2ml的甲醇中，與15ml的bsa(牛血清白蛋白)溶液(用pbs稀釋50mgbsa)混合，之后加入60mg氰基硼氫化鈉(nabh3cn)，室溫下避光攪拌12小時(shí)。之后在4℃用pbs溶液透析48小時(shí)，-20℃分裝保存。

因醋酸棉酚的醛基與蛋白上的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)后，形成席夫堿，但由于碳氮雙鍵不穩(wěn)定，故又通過(guò)加入氰基硼氫化鈉來(lái)還原碳氮雙鍵為單鍵，使偶聯(lián)產(chǎn)物可以穩(wěn)定存在。通過(guò)在4℃用pbs溶液透析48小時(shí)分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定完全抗原是否偶聯(lián)成功，如圖1所示，bsa的特征峰在280nm處，小分子蛋白反應(yīng)后，偶聯(lián)物的紫外圖在小分子特征峰240nm處有明顯的凸起，且其同時(shí)具有bsa的特征峰，故判斷偶聯(lián)成功。

2、動(dòng)物免疫

選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進(jìn)行免疫。取醋酸棉酚完全抗原(1mg/ml)與等量弗氏佐劑乳化均勻后，通過(guò)皮下多點(diǎn)注射免疫balb/c小鼠，每只100μl。首次免疫采用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，沖刺免疫時(shí)免疫劑量為前一次免疫劑量的一半，與生理鹽水混合均勻后直接進(jìn)行腹腔注射；各次免疫間隔為21天。第三次免疫后，間隔一周采血檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；選擇抑制最好的小鼠，在五免后21天沖刺免疫，不使用佐劑，腹腔注射，準(zhǔn)備融合。

3、細(xì)胞融合

在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg(聚乙二醇，分子量為4000)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：(1)無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(2)收集sp2/0細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(3)將脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞按照1：10的比例混合，離心后用50％peg融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20％胎牛血清，2％的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立

在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20％胎牛血清，1％的100×ht的rpmi-1640過(guò)渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。

篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用棉酚為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法的具體操作如下：

(1)包板：用包被緩沖液(cbs)將包被抗原稀釋1000倍加入酶標(biāo)板，每孔100μl，37℃孵育2h；

(2)洗板：用洗滌液(pbst)洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，吸水紙拍干；

(3)封閉：每孔加入200μl含0.2％明膠的pbs，37℃孵育2h；

(4)洗板：同(2)；

(5)加入棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和細(xì)胞上清；每孔加入濃度為100μg/ml的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照；

(6)洗板：同(2)；

(7)加酶標(biāo)二抗：每孔加入100μl經(jīng)1:3000倍pbst稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-羊抗小鼠igg，37℃孵育0.5h；

(8)洗板：同(2)；

(9)顯色：每孔加入100μltmb顯色液，37℃孵育0.5h；

(10)終止：每孔加入50μl2mol/l的硫酸溶液；

(11)吸光度測(cè)定：用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的各孔吸光值；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)的陽(yáng)性孔一部分會(huì)對(duì)游離棉酚有較好的抑制，另一部分對(duì)游離棉酚沒(méi)有抑制或抑制效果較差，選擇對(duì)棉酚有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，獲得細(xì)胞株2d4。5、單克隆抗體的制備與鑒定

取8-10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶雜交瘤細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。

使用小鼠單抗ig類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗套裝測(cè)定單克隆抗體的亞型，從表1中可以看出：其亞型為igg2a型。

表1雜交瘤細(xì)胞株2d4單克隆抗體的亞型鑒定

通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)elisa，繪出單克隆抗體對(duì)游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(如圖2)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出該單抗對(duì)游離棉酚的ic50為100ug/kg，其中，間接競(jìng)爭(zhēng)elisa方法靈敏度為0.03ug/kg，能夠滿足棉籽及其制品中游離棉酚的測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制過(guò)程如下：

(1)包板：用包被緩沖液(cbs)將包被抗原稀釋1000倍加入酶標(biāo)板，每孔100μl，37℃孵育2h；

(2)洗板：用洗滌液(pbst)洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，吸水紙拍干；

(3)封閉：每孔加入200μl含0.2％明膠的pbs，37℃孵育2h；

(4)洗板：同(2)；

(5)加入棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和抗體；用含30％甲醇的磷酸鹽緩沖液(pbs)分別配置0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1μg/ml的游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到已經(jīng)封閉好的酶標(biāo)板中，每孔50μl，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)3個(gè)孔，再每孔加入50μl1:16000稀釋的抗游離棉酚單克隆抗體，37℃孵育半小時(shí)；

(6)洗板：同(2)；

(7)加酶標(biāo)二抗：每孔加入100μl經(jīng)1:3000倍pbst稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-羊抗小鼠igg，37℃孵育0.5h；

(8)洗板：同(2)；

(9)顯色：每孔加入100μltmb顯色液，37℃孵育0.5h；

(10)終止：每孔加入50μl2mol/l的硫酸溶液；

(11)吸光度測(cè)定：用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的各孔吸光值；

(12)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用origin8.5繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。

實(shí)施例2抗游離棉酚特異性單克隆抗體應(yīng)用

1、溶液的配置：

碳酸鹽緩沖液(cbs)：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

磷酸鹽緩沖液(pbs)：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05％吐溫20的pbs；

tmb顯色液：a液：na2hpo412h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按1：5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混；

異丙醇-正己烷混合溶劑：6:4(v/v)；

溶劑a：量取約500ml異丙醉、正己烷混合溶劑，2ml3-氨基-1-丙醇，8ml冰乙酸和50ml水于1000ml的容量瓶中，再用異丙醇-正己烷混合溶劑定容至刻度。

2、將雜交瘤細(xì)胞株2d4通過(guò)體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于游離棉酚elisa添加回收試驗(yàn)：

(1)用碳酸鹽緩沖液(cbs)稀釋好的1.5μg/mlafb1-bsa作為包被原包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μl，37℃包被2h后，用pbst洗液洗板三次，每次每孔250μl，每次3min，拍干；

(2)用含0.01％明膠的cbs進(jìn)行封閉，每孔200μl，37℃封閉2h，用pbst洗液洗板三次，每次每孔250μl，每次3min，拍干；

(3)用含30％甲醇的磷酸鹽緩沖液(pbs)分別配置0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1μg/l的游離棉酚b1標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液以及待檢測(cè)樣品提取液，分別加入到已經(jīng)封閉好的酶標(biāo)板中，每孔50μl，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔，再每孔加入50μl1：16000稀釋的抗游離棉酚單克隆抗體，37℃反應(yīng)半小時(shí)后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μl用含0.01％明膠的pbs1：3000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗，37℃反應(yīng)半小時(shí)后，洗板拍干。每孔加入100μltmb顯色液，37℃顯色15min后，每孔加入50μl2mh2so4終止液，450nm測(cè)吸光值；

(5)添加回收及樣品前處理：稱取5g粉碎的棉籽樣品置入250ml具塞三角瓶中，分別添加10ng、50ng和100ng游離棉酚，加入20粒玻璃珠，用移液管準(zhǔn)確加入50ml溶劑a，塞緊瓶塞，放入振蕩器內(nèi)振蕩1h(每分鐘120次左右)。用干燥的定墩濾紙過(guò)濾，過(guò)濾時(shí)在漏斗上加蓋一表玻璃以減少溶劑揮發(fā)，棄去最初幾滴濾液，收集濾液于100ml具塞三角燒瓶中。濾液用含0.01％明膠的pbs稀釋4倍后，作為elisa樣品提取液，采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，其回收率分別為72％，85％，93％。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。