本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種不飽和脂肪酸固相微萃取方法。

背景技術(shù)：

不飽和脂肪酸是食用植物油的主要組成成分，不飽和脂肪酸中所帶有的碳碳雙鍵有順式和反式兩種存在形式：順式鍵形成的不飽和脂肪酸室溫下是液態(tài)，反式鍵形成的不飽和脂肪酸室溫下是固態(tài)。在現(xiàn)代食品工業(yè)中，為防止油脂變質(zhì)和改善加工食品風(fēng)味，人們對植物油進(jìn)行部分氫化處理得到部分氫化植物油。部分氫化植物油中所含的大量不飽和脂肪酸都是室溫下可呈現(xiàn)固態(tài)的反式脂肪酸（trans-fattyacid,tfa）。因此，部分氫化油具有耐高溫、不易變質(zhì)、存放時間久等優(yōu)點(diǎn)，并在蛋糕、餅干、速溶咖啡、速凍比薩餅、薯?xiàng)l、爆米花等食品加工過程中得到普遍使用。研究表明，食用過多的tfa會增加心血管疾病風(fēng)險、降低紅細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)、促生糖尿病、升高膽固醇、導(dǎo)致必需脂肪酸的缺乏和影響嬰幼兒的生長發(fā)育等。世界衛(wèi)生組織提出tfa攝入所占能量應(yīng)該控制在小于攝入食品總能量的1%。針對當(dāng)前工業(yè)化食品中廣泛含有tfa的現(xiàn)象，開發(fā)快速準(zhǔn)確的tfa檢測方法勢在必行。目前，tfa檢測的主要難點(diǎn)在于因tfa與食品中大量存在的其順式異構(gòu)體——順式脂肪酸（cis-fattyacid,cfa）的結(jié)構(gòu)非常相近，導(dǎo)致其難以區(qū)分，對定性和定量分析造成較大的影響。

固相微萃?。╯olidphasemicroextraction,spme）是一種新型的樣品前處理方法，具有簡便、快速、高效、有機(jī)溶劑消耗量低、易與其他儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。spme的萃取原理是基于樣品組分與固定相之間的分配平衡，因此開發(fā)新型spme固定相成為了spme方法的核心。據(jù)文獻(xiàn)報道，銀納米粒與不飽和化合物所帶有的碳碳雙鍵之間存在著特殊的作用力，這種作用力隨著雙鍵數(shù)量的增加而提高，隨著碳鏈的增長而變小，同時順式不飽和化合物的作用力要強(qiáng)于反式不飽和化合物。由此啟發(fā)，本課題組將銀納米粒與spme技術(shù)相結(jié)合，制備了銀納米粒固定化spme整體柱，并基于該整體柱，結(jié)合管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜（in-tubespme-hplc）聯(lián)用系統(tǒng)，發(fā)展一種不飽和脂肪酸固相微萃取新方法，實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸的高效富集和不同順反異構(gòu)體的順序洗脫，滿足反式脂肪酸高效檢測要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種不飽和脂肪酸固相微萃取新方法。本發(fā)明是以銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱，結(jié)合管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜（in-tubespme-hplc）聯(lián)用系統(tǒng)，建立不飽和脂肪酸固相微萃取新方法。得益于負(fù)載的銀納米粒與不飽和脂肪酸碳碳雙鍵之間的相互作用實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸的富集；并利用銀納米粒與不飽和脂肪酸不同異構(gòu)體之間作用力的不同，實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸不同異構(gòu)體的順序洗脫。該固相微萃取方法可實(shí)現(xiàn)油酸甲酯（主要是順-6-十八碳烯酸甲酯、反-6-十八碳烯酸甲酯、順-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）、亞油酸甲酯（主要是順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯）等食品中常見不飽和脂肪酸類化合物的高效富集、順序洗脫，并滿足反式脂肪酸高效檢測要求。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種不飽和脂肪酸固相微萃取新方法，其是以銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱，結(jié)合管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)得以構(gòu)建。所述的不飽和脂肪酸固相微萃取新方法，包括以下步驟：

1）銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備：

所述的銀納米粒固定化整體柱是基于粘多糖功能化整體柱制備的，即先由粘多糖、尿素溶液、甲醛溶液在催化劑溶液作用下原位脫水縮聚制備粘多糖功能化整體柱；再制備性能穩(wěn)定、分散性良好的球形銀納米粒溶液，在微量注射泵輔助下，將銀納米粒固定化到粘多糖功能化整體柱表面。

其中，粘多糖功能化整體柱的制備配方按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)之和為100%計(jì)，各組分占整體柱制備配方組成總質(zhì)量的百分比為：粘多糖0.1~1%、尿素溶液38~52%、甲醛溶液34~47%、催化劑7.5~9.5%。

其中，所述粘多糖為透明質(zhì)酸鈉或硫酸軟骨素；

所述尿素溶液，其濃度為1g/ml；

所述甲醛溶液，其中甲醛的質(zhì)量濃度為33%~37%；

所述催化劑為鹽酸溶液，其濃度為0.20mol/l；

所述銀納米粒溶液通過如下方式制備：將1mmol/lagno3溶液、2.8mmol/l酒石酸鉀鈉溶液和2mmol/l檸檬酸鈉溶液等體積混合，調(diào)節(jié)混合溶液ph值為10，即得到平均粒徑在30nm左右、紫外-可見光吸收光譜350~450nm區(qū)段有明顯吸收峰、尺寸分布區(qū)間狹窄、性能穩(wěn)定、分散性良好的1mmol/l球形銀納米粒溶液。

2）管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜（in-tubespme-hplc）聯(lián)用系統(tǒng)的構(gòu)建：所述的管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)由微萃取和分析兩部分組成，結(jié)構(gòu)如附圖1所示。微萃取部分包括：一個六通閥（v1）、一臺液相色譜輸液泵（泵a）、0.5mlpeek管定量環(huán)。分析部分包括：一臺液相色譜輸液泵（泵b）、一個六通閥（v2）、銀納米粒固定化固相微萃取整體柱、氨基分析柱、二極管陣列檢測器。

3）不飽和脂肪酸固相微萃取：

首先，六通閥v1和v2都在load位置。裝載液通過泵a平衡銀納米粒固定化固相微萃取整體柱，流速為0.1ml/min。流動相通過泵b直接經(jīng)分析柱以獲得色譜分離要求的穩(wěn)定基線，流速為1.0ml/min。同時，通過進(jìn)樣針將樣品溶液注滿定量環(huán)。

當(dāng)六通閥v1調(diào)至inject位置，固相微萃取開始，定量環(huán)中的樣品經(jīng)由裝載液帶入固相微萃取整體柱，經(jīng)過給定的時間，六通閥v1調(diào)回load位置，裝載液繼續(xù)沖洗固相微萃取整體柱90s以消除殘留的樣品溶液，降低其干擾。

然后，泵b流速設(shè)置為0.1ml/min，六通閥v2調(diào)節(jié)至inject位置，利用流動相將固相微萃取整體柱上富集的分析對象順序洗脫。當(dāng)洗脫完成時，六通閥v2調(diào)節(jié)至load位置，設(shè)置泵b流速為1.0ml/min進(jìn)行分析檢測。

所述的裝載液組成為正己烷/異丙醇=95%/5%(v/v)；所述的流動相為正己烷；所述的分析柱為氨基色譜柱，柱溫箱溫度為30℃，檢測波長為203nm。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

1）由于順反式脂肪酸極為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其他常規(guī)spme材料與兩者的作用力往往都是相同的，因此通常只能實(shí)現(xiàn)富集，而難以實(shí)現(xiàn)順序洗脫。與其他常規(guī)spme材料不同，銀納米粒固定化整體柱得益于負(fù)載的銀納米粒與不飽和脂肪酸不同異構(gòu)體之間作用力的不同，可實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸不同異構(gòu)體的順序洗脫，提高順反式脂肪酸的分離度，滿足反式脂肪酸高效檢測的要求。

2）銀納米粒固定化整體柱是利用銀納米粒與不飽和脂肪酸碳碳雙鍵之間的相互作用實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸的富集，而對飽和脂肪酸沒有富集能力，降低了食品樣品中存在的大量飽和脂肪酸對不飽和脂肪酸檢測的干擾，提高了分離度和檢測靈敏度。

3）本發(fā)明方法簡單，工藝巧妙，所需儀器普及度較高，易于推廣。

附圖說明

圖1是管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜（in-tubespme-hplc）聯(lián)用系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是以不同整體柱作為固相微萃取整體柱，建立管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜(in-tubespme-hplc)聯(lián)用系統(tǒng)對兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體（順-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）的色譜分離圖。

圖中a曲線反映的是以粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱，b曲線反映的是以銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱。

圖3是以不同整體柱作為固相微萃取整體柱，建立in-tubespme-hplc聯(lián)用系統(tǒng)對亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體混合物（反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯）的色譜分離圖。

圖中a曲線反映的是以粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱，b曲線反映的是以銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

步驟一、銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備：

1.粘多糖功能化整體柱的制備：

1)ptfe管空柱的清洗：將內(nèi)徑為750μmptfe管接上液相泵，用色譜純甲醇在0.5ml/min流速下沖洗10min，除去管內(nèi)壁殘留的有機(jī)物雜質(zhì)等，然后通氮?dú)?，并置?0℃的烘箱中烘干10min。

2)管內(nèi)快速縮聚：將8mg透明質(zhì)酸鈉，550mg1g/ml尿素溶液，450mg甲醛溶液，100mg0.2mol/l鹽酸溶液均勻混合，快速超聲振蕩1~2min，然后將混合物快速注滿經(jīng)清洗干燥的ptfe管（或peek管）中，兩端封閉并浸于70℃水浴中恒溫加熱10min；待反應(yīng)完成后，以水為流動相，在液相色譜泵上沖洗ptfe管整體色譜柱約1h，沖去床層內(nèi)殘留的溶劑和反應(yīng)殘留試劑，即得到粘多糖功能化整體柱。

2.銀納米粒溶液的制備：將1mmol/lagno3溶液、2.8mmol/l酒石酸鉀鈉溶液、2mmol/l檸檬酸鈉溶液等體積混合，振蕩超聲，調(diào)節(jié)混合溶液ph值為10，即還原得到平均粒徑在30nm左右、紫外-可見光吸收光譜350~450nm區(qū)段有明顯吸收峰、尺寸分布區(qū)間狹窄、性能穩(wěn)定、分散性良好的1mmol/l球形銀納米粒溶液。

3.銀納米粒固定化固相微萃取整體柱的制備：固定化銀納米粒前，先用乙腈沖洗基質(zhì)整體柱，利用微泵將1ml銀納米粒溶液通入基質(zhì)整體柱，然后整體柱兩端封閉并浸于70℃水浴中恒溫加熱2h。完成后，以乙腈為流動相，在液相色譜泵上沖洗該整體柱約1h，即得到銀納米粒固定化固相微萃取整體柱。

步驟二、管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜（in-tubespme-hplc）聯(lián)用系統(tǒng)的構(gòu)建：

所述的管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)由微萃取和分析兩部分組成，結(jié)構(gòu)如附圖1所示。微萃取部分包括：一個六通閥（v1）、一臺液相色譜輸液泵（泵a）、0.5mlpeek管定量環(huán)。分析部分包括：一臺液相色譜輸液泵（泵b）、一個六通閥（v2）、銀納米粒固定化固相微萃取整體柱、氨基分析柱、二極管陣列檢測器。

步驟三、不飽和脂肪酸固相微萃?。?/p>

1.首先，六通閥v1和v2都在load位置。裝載液通過泵a平衡銀納米粒固定化固相微萃取整體柱，流速為0.1ml/min。流動相通過泵b直接經(jīng)分析柱以獲得色譜分離要求的穩(wěn)定基線，流速為1.0ml/min。同時，通過進(jìn)樣針將樣品溶液注滿定量環(huán)。

2.當(dāng)六通閥v1調(diào)至inject位置，固相微萃取開始，定量環(huán)中的樣品經(jīng)由裝載液帶入固相微萃取整體柱，經(jīng)過5min，六通閥v1調(diào)回load位置，裝載液繼續(xù)沖洗固相微萃取整體柱90s以消除殘留的樣品溶液，降低其干擾。

3.然后，泵b流速設(shè)置為0.1ml/min，六通閥v2調(diào)節(jié)至inject位置，利用流動相將固相微萃取整體柱上富集的分析對象順序洗脫。當(dāng)洗脫完成時，六通閥v2調(diào)節(jié)至load位置，設(shè)置泵b流速為1.0ml/min進(jìn)行分析檢測。

所述的裝載液組成為正己烷/異丙醇=95%/5%(v/v)；所述的流動相為正己烷；所述的分析柱為氨基色譜柱，柱溫箱溫度為30℃，檢測波長為203nm。

應(yīng)用實(shí)施例1

按上述具體實(shí)施方式所述制備粘多糖功能化整體柱（a）和銀納米粒固定化固相微萃取整體柱（b），并以這兩種整體柱作為固相微萃取整體柱，結(jié)合管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜(in-tubespme-hplc)聯(lián)用系統(tǒng)，考察兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體（順-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）的固相微萃取行為（圖2）。

具體分離條件：裝載液組成：正己烷/異丙醇=95%/5%(v/v)；樣品溶劑：100%正己烷；進(jìn)樣流速：0.1ml/min；進(jìn)樣體積：500μl；洗脫液組成：100%正己烷；洗脫流速：0.1ml/min；洗脫體積：150μl；分離流動相：100%正己烷；分離流速：1.0ml/min；柱溫箱溫度：30℃；檢測波長：203nm。圖2中b曲線，檢測峰1是反-9-十八碳烯酸甲酯，檢測峰2是順-9-十八碳烯酸甲酯。

如圖2所示，使用粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線a）時，檢測峰強(qiáng)度較低，且兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體無法得到分離；而使用銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線b）時，檢測峰強(qiáng)度得到增強(qiáng)，且兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體得到分離。以上結(jié)果表明基于粘多糖功能化整體柱的固相微萃取方法，無法實(shí)現(xiàn)兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體的富集和順序洗脫；而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，基于銀納米粒固定化整體柱的固相微萃取方法，不僅實(shí)現(xiàn)了兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體的富集，并且由于順-9-十八碳烯酸甲酯與銀納米粒的作用力強(qiáng)于反-9-十八碳烯酸甲酯，兩種油酸甲酯順反異構(gòu)體按照作用力強(qiáng)度也實(shí)現(xiàn)順序洗脫，并得以有效分離分析。

應(yīng)用實(shí)施例2

按上述具體實(shí)施方式所述制備粘多糖功能化整體柱（a）和銀納米粒固定化固相微萃取整體柱（b），并以這兩種整體柱作為固相微萃取整體柱，結(jié)合管內(nèi)固相微萃取-高效液相色譜(in-tubespme-hplc)聯(lián)用系統(tǒng)，考察亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體混合物（反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯、順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯）的固相微萃取行為（圖3）。

具體分離條件：裝載液組成：正己烷/異丙醇=95%/5%(v/v)；樣品溶劑：100%正己烷；進(jìn)樣流速：0.1ml/min；進(jìn)樣體積：500μl；洗脫液組成：100%正己烷；洗脫流速：0.1ml/min；洗脫體積：150μl；分離流動相：100%正己烷；分離流速：1.0ml/min；柱溫箱溫度：30℃；檢測波長：203nm。圖3中b曲線，檢測峰1是反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯，檢測峰2、3分別是順-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯，檢測峰4是順-9,順-12-十八碳二烯酸甲酯。

如圖3所示，使用粘多糖功能化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線a）時，檢測峰強(qiáng)度較低，且亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體無法得到分離；而使用銀納米粒固定化整體柱作為固相微萃取整體柱（曲線b）時，檢測峰強(qiáng)度得到增強(qiáng)，且亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體得到分離。以上結(jié)果表明基于粘多糖功能化整體柱的固相微萃取方法，無法實(shí)現(xiàn)亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體的富集和順序洗脫；而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，基于銀納米粒固定化整體柱的固相微萃取方法，不僅實(shí)現(xiàn)了亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體的富集，并且由于亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體與銀納米粒的作用力不同，碳碳雙鍵的順式結(jié)構(gòu)作用力強(qiáng)于反式結(jié)構(gòu)，亞油酸甲酯四種順反異構(gòu)體按照作用力強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)順序洗脫，并得以有效分離分析。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。