專利名稱：一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種黑曲霉菌株利用馬鈴薯生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法。
背景技術(shù)：
黑曲霉A/sジ屬于真菌中的ー個(gè)常見種，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壌中，因其所產(chǎn)酶類豐富，所以在エ業(yè)應(yīng)用中是最常見的菌種之一。真菌中含有多種多不飽和脂肪酸，是花生四烯酸(ARA)、Y-亞麻酸(GLA)、亞油酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十ニ碳六烯酸(DHA)等脂肪酸的重要來源。多不飽和脂肪酸(PUFAs)可以調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，在抗過敏、抗炎癥，降低心血管疾病的發(fā)病率，輔助改善記憶、輔助兒童智力發(fā)育，延緩衰老等方面具有重要的生理作用。目前商業(yè)上多不飽和脂肪酸尤其是《_3多不飽和脂肪酸主要從深海魚油中提取，高等植物和動(dòng)物中很少含有w-3多不飽和脂肪酸，其生產(chǎn)エ藝復(fù)雜、成本高、穩(wěn)定性差，還受到氣候條件和資源的限制。而微生物中含量最豐富，主要以油脂和膜脂的形式存在，并且微生物具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)繁殖迅速、生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、不受原料產(chǎn)地限制等特點(diǎn)。因此，利用微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸是一條重要途徑，尋求高產(chǎn)菌株和研究發(fā)酵エ藝，及新碳源的選擇及廉價(jià)資源的應(yīng)用正成為研究方向。世界馬鈴薯常年栽培面積1800萬t，平均單產(chǎn)鮮薯15t/hmz。1999年世界馬鈴薯產(chǎn)量已達(dá)到28978萬 t。馬鈴薯加工在帶動(dòng)整個(gè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)鏈良性發(fā)展方面起著重要的作用。作為實(shí)現(xiàn)糧食增值的主要途徑之一的馬鈴薯加工業(yè)發(fā)展已進(jìn)入高潮，目前馬鈴薯基本用于鮮食或加工成粉絲、粉條及淀粉，屬于初級(jí)加工階段，其增值幅度有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述問題而提供的一種獲得的不飽和脂肪酸含量高，培養(yǎng)基質(zhì)容易獲得，發(fā)酵條件穩(wěn)定、エ藝簡(jiǎn)單的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法。一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括
(1)菌種活化
將黑曲霉(Aspergillus niger xj )菌株接于PDA固體斜面培養(yǎng)基上，27°C靜置培養(yǎng)3天，活化3次，保存于4°C冰箱備用；
(2)孢子懸液的制備
將活化好的菌株，用含0.05%吐溫80無菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的100 mL無菌水中，攪拌后再在旋渦震蕩器上震蕩，充分打散孢子，用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成均一孢子懸液；
(3)種子液的制備將孢子懸液，以體積比5%接種量接種于IOOmLPDA液體種子培養(yǎng)基中，27°C，150rpm,搖瓶培養(yǎng)3天，得種子液；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)
取種子液按體積比5%接種于13L PDA發(fā)酵培養(yǎng)基中，28±1° C，攪拌速度200_300rpm，通氣量控制在l_2L/min，培養(yǎng)5天終止發(fā)酵，4層無菌紗布過濾除去菌絲體，收集發(fā)酵液，即得。上述的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其中PDA固體斜面培養(yǎng)基的制備方法如下馬鈴薯200g切塊，用水煮沸30min，過濾取汁，加葡萄糖20g，瓊脂20g，水補(bǔ)足lOOOmL，pH自然。滅菌條件121°C,30min。上述的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其中PDA液體種子培養(yǎng)基的制備方法如下馬鈴薯20(^切塊，用水煮沸301^11，過濾取汁，加葡萄糖2(^，水補(bǔ)足1000111し？11自然。滅菌條件121°C，30min。上述的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其中PDA發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下馬鈴薯2600g切塊，用水煮沸30min，過濾取汁，加葡萄糖260g，水補(bǔ)足13000mL，pH自然，121 °C，滅菌30min。該菌種已于2005年3月7日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào)CCTCC NO M 206021，名稱為黑曲霉Usperぬ7A/s niger xj)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知利用產(chǎn)多不飽和脂肪酸黑曲霉Xj對(duì)以馬鈴薯為主的培養(yǎng)基進(jìn)行生物降解與轉(zhuǎn)化，發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，可為解決多不飽和脂肪酸來源及馬鈴薯加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素提供一條新途徑。且黑曲霉(Aspergi/A/sxj)菌株來源可靠,對(duì)溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應(yīng)范圍廣，容易培養(yǎng)和保存，產(chǎn)不飽和脂肪酸的條件穩(wěn)定，可作為提取不飽和脂肪酸的菌株，擴(kuò)充資源庫。培養(yǎng)體系中用的馬鈴薯，資源豐富，來源可靠、安全。該技術(shù)路線合理，可大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括以下步驟
D菌種活化
將黑曲霉niger xj)菌株接于PDA固體斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯200g切塊，用水煮沸30min，過濾取汁，加葡萄糖20g，瓊脂20g，水補(bǔ)足lOOOmL，pH自然，121°C，滅菌30min)上，27°C靜置培養(yǎng)3天，活化3次，保存于4°C冰箱備用；
2)孢子懸液的制備
將活化好的菌株，用含0. 05%吐溫80 (Toween-80)無菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的裝有100 mL無菌水的250 mL三角瓶中，用玻棒攪拌后再在旋渦震蕩器上震蕩，充分打散孢子，用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成均一孢子懸液；
3)種子液的制備
將孢子懸液，以5% (v/v)接種量接種于裝有IOOmLPDA液體種子培養(yǎng)基(馬鈴薯200g切塊，用水煮沸30min,過濾取汁,加葡萄糖20g,水補(bǔ)足lOOOmL,pH自然，121°C,滅菌30min)的500mL三角瓶中，27°C，150rpm,搖瓶培養(yǎng)3天
4)發(fā)酵培養(yǎng)
取種子液5% (v/v)接種于裝有13L PDA發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯2600g切塊，用水煮沸30min,過濾取汁,加葡萄糖260g，水補(bǔ)足13000mL,pH自然，121°C，滅菌30min)的19L發(fā)酵罐中，28± 1° C，攪拌速度200-300rpm，通氣量控制在l_2L/min，培養(yǎng)5天終止發(fā)酵，4層無菌紗布過濾除去菌絲體，收集發(fā)酵液，即得。黑曲霉(Aspergillus niger xj)發(fā)酵液中多不飽和脂肪酸的鑒定
(I)浸膏的制備
取上述所得發(fā)酵液，用石油醚萃取，減壓回收溶劑，得到供試樣品石油醚部分和水部分，并將石油醚部分旋蒸濃縮得到浸膏。2)樣品的分離
取石油醚萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，用V(石油醚)V (こ酸こ酷)=1:0-8:1進(jìn)行洗脫，得到油狀物質(zhì)，經(jīng)TLC (薄層層析法)分析，為脂肪酸類成分。3)樣品的甲酯化 取54mg油狀物質(zhì)于錐形瓶中，加入20ml苯-石油醚(1: 1，v/v)溶解，再加0. 2mol/lKOH-MeOH溶液10ml，振蕩均勻，在40°C水浴中恒溫30min，冷卻，加入20ml蒸餾水，搖勻，靜置，待分層清晰后取上清液減壓回收溶劑，得到甲酯化產(chǎn)物。(4) GC-MS 分析條件
氣相色譜條件HP-5MS (0. 25mmX30m, 0. 25 u m);柱溫 50°C (保留 2min)，升溫至 280°C(5°C /min)，保持3min ;汽化室溫度為250°C ;以高純氦為載氣；柱前壓7. 62psi，載氣流量1. OmL/min ;進(jìn)樣量 IuL ;分流比 50 :1。質(zhì)譜條件離子源為EI源；接ロ溫度280°C ;離子源溫度230°C ;倍增器電壓1785V ;四極桿溫度150°C ;電子能量70eV ;發(fā)射電流34. 6 y A ;質(zhì)量范圍10 550amu ;溶劑延遲 3min。(5)結(jié)論發(fā)酵液中的脂肪酸成分主要為亞油酸、10-十八碳烯酸、14-甲基十五烷酸和棕櫚酸，其中十八碳烯酸含量最高，含量為48. 112%，其次是亞油酸，含量為41.919%，不飽和脂肪酸占90. 031%。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括 (1)菌種活化 將黑曲霉Xj菌株接于PDA固體斜面培養(yǎng)基上，27°C靜置培養(yǎng)3天，活化3次，保存于4°C冰箱備用； (2)孢子懸液的制備 將活化好的菌株，用含O. 05%吐溫80無菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的100 mL無菌水中，攪拌后再在旋渦震蕩器上震蕩，充分打散孢子，用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成均一孢子懸液； (3)種子液的制備 將孢子懸液，以體積比5%接種量接種于IOOmLPDA液體種子培養(yǎng)基中，27°C，150rpm,搖瓶培養(yǎng)3天，得種子液； (4)發(fā)酵培養(yǎng) 取種子液按體積比5%接種于13L PDA發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ±1° C，攪拌速度200_300rpm，通氣量控制在l_2L/min，培養(yǎng)5天終止發(fā)酵，4層無菌紗布過濾除去菌絲體，收集發(fā)酵液，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其中PDA固體斜面培養(yǎng)基的制備方法如下馬鈴薯200g切塊，用水煮沸30min，過濾取汁，加葡萄糖20g，瓊脂20g，水補(bǔ)足IOOOmL, pH 自然；滅菌條件121°C，30min。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其中PDA液體種子培養(yǎng)基的制備方法如下馬鈴薯200g切塊，用水煮沸30min，過濾取汁，加葡萄糖20g，水補(bǔ)足IOOOmL, pH 自然；滅菌條件121°C，30min。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其中PDA發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下馬鈴薯2600g切塊，用水煮沸30min，過濾取汁，加葡萄糖260g，水補(bǔ)足13000mL，pH自然，121。。，滅菌 30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑曲霉菌株利用馬鈴薯產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括將黑曲霉xj菌株接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)3天，活化3次，再接入PDA液體種子培養(yǎng)基中，27℃，150rpm，搖瓶培養(yǎng)3天，得種子液，以5%(v/v)的比例將種子液轉(zhuǎn)接到13LPDA發(fā)酵培養(yǎng)基中，28±1°C，攪拌速度200-300rpm，通氣量控制在1-2L/min，培養(yǎng)5天終止發(fā)酵。4層無菌紗布過濾除去菌絲體，收集發(fā)酵液，即得。本方法獲得的不飽和脂肪酸含量高，培養(yǎng)基質(zhì)容易獲得，發(fā)酵條件穩(wěn)定、工藝簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12R1/685GK103031350SQ201210136580
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月6日
發(fā)明者李祝, 陳青, 周禮紅, 王嬙, 劉吳娟, 馮煥鵬 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)