一種花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因AhLPAAT1及其用途，屬于分子生物學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的AhLPAAT1具有SEQIDNO：1所示的基因cDNA核苷酸序列，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本發(fā)明的花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因具有改變植物組織尤其是種子中脂肪酸含量，并提高多聚不飽和脂肪酸比例的作用，在植物品種選育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化有AhLPAAT1基因的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及所述AhLPAAT1基因用于改變植物種子脂肪酸含量及成分比例的方法。
【專利說明】一種花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]油脂是油料作物籽粒的主要貯藏物質(zhì)之一，種子油分含量的高低及其組成決定了油料作物的經(jīng)濟(jì)價值。植物脂肪酸是植物油脂的主要成分，同時也是生物膜的重要組成部分，脂肪酸的組成對植物油的營養(yǎng)價值、食品加工用途及工業(yè)用途有重要影響，生物膜的脂肪酸組成還影響到植物膜系統(tǒng)有關(guān)的抗逆特性(黃冰艷等，河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，9:75-78)。在植物種子中,脂肪酸主要以三酰甘油酯的形式存在(Somerville C and BrowseJj Science, 1991，252:80 - 87; Voelker T and Kinney AJj Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol, 2001, 52:335-361 )，其品質(zhì)及用途也大多取決于其脂肪酸成分及含量。現(xiàn)在大多植物油用于人類食用，但是脂肪酸在工業(yè)生產(chǎn)上也具有重要用途，如潤滑劑、表面活性劑、包埋劑、聚烯類產(chǎn)品、醫(yī)療及理療產(chǎn)品和生物能源原料等。
[0003]通過鑒定已知植物產(chǎn)生的脂肪酸種類有200多種，這些脂肪酸在碳鏈的長度、雙鍵的位置及數(shù)目、生理功能作用等方面存在著差異。根據(jù)烴鏈的飽和程度，可將脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸。其中單不飽和脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸又統(tǒng)稱為不飽和脂肪酸。根據(jù)烴鏈的長短，可將脂肪酸分為鏈長為4-7個碳的短鏈脂肪酸、鏈長為8-18個碳的中長鏈脂肪酸，以及鏈長為含有20或20個碳以上的超長鏈脂肪酸(盧善發(fā)，植物學(xué)通報，2000，17?):481-491)。不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸在植物界中，特別是高等植物中含量豐富，植物脂肪酸除含烯鍵外，可含炔鍵、羥基、酮基、環(huán)氧基和環(huán)戊基等。大部分用于食用的油料作物主要含有油酸(oleic acid，C18:l，A9)、亞油酸(linoleic acid, C18: 2，Λ 9，12)、亞麻酸(a-1inolenic acid, C18: 3，Λ 9，12，15)、硬月旨酸(stearic acid, C18:0)和棕櫚酸(palmitic acid, C16:0)等5種脂肪酸,而其他植物則含有在種類及含量上變化各異的脂肪酸。亞油酸和亞麻酸等多聚不飽和脂肪酸的營養(yǎng)價值和保健作用日益受到人們的關(guān)注。
[0004]高等植物中脂肪酸的生物合成是一個相當(dāng)復(fù)雜的生化過程，其合成途徑首先發(fā)生在質(zhì)體中，蔗糖一般作為種子中脂肪酸合成的主要碳源，經(jīng)過糖酵解途徑轉(zhuǎn)變成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化下被氧化成肪酸合成的前體乙酰CoA，在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA。然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每個循環(huán)增加兩個碳的方式合成碳鏈，進(jìn)一步合成16至18碳的飽和脂肪酸。這些不斷增長的?；兼溑c酰基載體蛋白ACP結(jié)合，經(jīng)過數(shù)次循環(huán)聚合，?；?ACP硫脂酶或酰基轉(zhuǎn)移酶終止脂肪酸的合成。不同碳鏈長度的酰基-ACP于終止反應(yīng)后在?；鵆oA合成酶作用下合成?；鵆oA，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中，再經(jīng)多種酶的作用下進(jìn)一步合成和修飾，其中有脂肪酸的去飽和超長鏈脂肪酸的合成及環(huán)氧化、羥化等。
[0005] 在油料作物種子中，從脂肪酸到甘油三酯TAG的合成是通過Kennedy途徑(Stymne S，et al., Biochim Biophys Acta, 752:198-208)進(jìn)行，主要包括四大酶促反應(yīng)。首先3-磷酸甘油(G-3-P)經(jīng)3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(G3PAT)作用合成溶血性磷脂酸(LAP)，隨后在溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)作用下形成磷脂酸(PA)，磷脂酸磷酸化酶(PAP)將磷脂酸(PA)脫磷酸化形成甘油二酯(DAG)，再被二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DAGAT)催化合成甘油三酯(TAG)。甘油三酯的Sn-1和Sn-3的位置上通常被飽和脂肪酸占據(jù)，而不飽和脂肪酸通常占據(jù)Sn-2的位置。
[0006]大量的研究表明不同來源的G3PAT和DAGAT對?；鵆oA的選擇性較小，而LPAAT則具有很強(qiáng)的底物選擇性，TAG的Sn-2位受LPAAT對?；鵆oA的選擇特異性高度限制。例如從油菜和擬南芥中分離出來的質(zhì)體LPAAT對16:0-CoA的偏好性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過18:1-CoA(Bourgis F，et al., Plant Physiol, 1999, 120: 913 - 921; Kim HU and Huang AHC,Plant Physiol, 2004，134:1206-1216; Yu B, et al., Plant Cell Physiol, 2004，45:503-510),而對從幾類不同植物中分離出來的胞質(zhì)LPAAT進(jìn)行研究表明對18:1-CoA的偏好性超過 16:0-CoA (Ohlrogge J and Browse J, Plant Cell, 1995; 7:957-970)。在油脂型種子的植物類型中Sn-2位置上有一些比較特殊的?；鵆oA，表明這些植物當(dāng)中含有另外一些對特殊的酰基CoA有活性的種子特異性的LPAAT (Cao YZ, et al.，PlantPhysiol, 1990, 94: 1199-1206; Laurant P and Huang AHC, Plant Physiol.1992,99:1711-1715; Brown A P, et al., Plant Mol Biol, 1994, 26:211-223; FrentzenM, Fett Lipid.1998; 100:161-166)。一些植物成熟種子或其他組織來源的LPAAT基因也已經(jīng)被分離克隆出來，包括椰子(Knutzon D S，et al., Plant Physiol, 1995,109:999-1006)、玉米(Brown A P, et al., Plant Mol Biol, 1994，26:211-223)、池花屬{Limnanthes) (Brown A P, et al., Plant Mol.Biol.29 (1995), 267 - 278)等。
[0007]不同來源的植物L(fēng)PAAT由于其底物偏好性和功能的差別，使植物脂肪酸的合成呈多樣化，因此可通過生物工程途徑利用不同來源的基因有目地對植物進(jìn)行有針對性的改良，從而改變植物脂肪酸的含量和成分，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)、滿足人類需求的優(yōu)良新品種。鑒于植物油的提取工藝非常成熟，許多研究者已經(jīng)將目光轉(zhuǎn)向油料作物的代謝工程，研究如何利用轉(zhuǎn)基因植物作“綠色細(xì)胞工廠”生產(chǎn)各種有用脂肪酸產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明人在已構(gòu)建花生種子發(fā)育中期cDNA文庫的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計簡并引物克隆得到花生溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因，該cDNA含有一個大小為1131bp的開放閱讀框(0RF)。開放閱讀框編碼376個氨基酸殘基的蛋白，AhLPAATl基因編碼的蛋白與GenBank中蓖麻、葡萄、擬南芥、玉米、水稻、北美云杉等物種的LPAAT相似性分別高達(dá)90 %、90%、85%、88%、83%、80%。
[0009]通過轉(zhuǎn)基因驗證花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因功能，與對照組比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化了 基因的轉(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)生的種子脂肪酸總含量下降，同時多聚不飽和脂肪酸的比例有不同程度的增加。由此驗證了基因可改變種子中脂肪酸的含量與成分比例。
[0010]本發(fā)明首先提供一種花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列。所述基因的序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種花生溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.一種蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種含根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體的重組細(xì)胞。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，或根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸序列，或根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，或感染有根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸序列、根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求4的重組細(xì)胞在改變植物組織中的應(yīng)用。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸序列、根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求4的重組細(xì)胞在制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種中的應(yīng)用。
8.一種改變植物種子脂肪酸含量及成分，并提高種子多聚不飽和脂肪酸比例的方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求1的核苷酸序列或權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)化入植物，或包括用權(quán)利要求4的重組細(xì)胞感染植物。
9.一種改變植物組織或培養(yǎng)細(xì)胞的脂肪酸含量及成分，產(chǎn)生具有較高多聚不飽和脂肪酸比例的轉(zhuǎn)基因植物，或轉(zhuǎn)基因愈傷組織組織，或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: S1.將權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)化入植物組織或細(xì)胞，或用感染有權(quán)利要求4的重組細(xì)胞感染植物組織或細(xì)胞； S2.利用所述植物組織或細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物； 所述植物包括雙子葉植物、單子葉植物及藻類植物，特別是擬南芥、花生、大豆、油菜、油茶、麻瘋樹、芝麻、向日葵、橄欖、玉米、水稻、小麥、油藻。
【文檔編號】C12N9/10GK103725700SQ201310725260
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】黎茵, 黃上志, 劉琛, 顏瑞卿 申請人:中山大學(xué)