本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域，涉及乙內(nèi)酰脲類化合物、其制備方法、包含它們的藥物組合物及其作為β-分泌酶抑制劑用于制備預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病及其它由β-淀粉樣多肽聚集或沉淀引起的疾病的藥物的用途。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)是一種常見的慢性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶減退和認(rèn)知障礙，最終喪失生活自理能力，其病理特征表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangle)以及細(xì)胞外存在老年斑(senileplaque)。老年斑的主要成分是一系列長短不等的β-淀粉樣多肽(β-amyloidpeptide，Aβ)。Aβ是一種含有39-43個氨基酸的多肽，來源于β淀粉樣前體蛋白(β-amyloidprecursorprotein,β-APP)。β-APP在體內(nèi)裂解有兩種途徑：非淀粉樣途徑和淀粉樣途徑。非淀粉樣途徑是指β-APP經(jīng)α-分泌酶、γ-分泌酶裂解后，不產(chǎn)生Aβ；淀粉樣途徑是指β-分泌酶(β-secretase)在β-APP的N端進(jìn)行裂解，產(chǎn)生包含完整Aβ序列的β-CTF(C-terminalfragments)，隨后β-CTF被γ-分泌酶裂解形成Aβ。β-分泌酶屬于天冬氨酸蛋白酶，也稱之為BACE1、Asp2或Memapsin-2(SinhaS,AndersonJP,BarbourR,etal:Nature,1999,402(6761):537-540)。由于Aβ的產(chǎn)生與代謝、解離與聚積的不均衡，異常多的Aβ逐漸聚積形成老年斑，從而導(dǎo)致了其它如神經(jīng)纖維纏結(jié)、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥、神經(jīng)元細(xì)胞衰亡和神經(jīng)遞質(zhì)缺乏等病理改變，最終形成老年癡呆癥。β-分泌酶是產(chǎn)生Aβ的限速酶，因此，通過抑制β-分泌酶的活性來減少或阻斷Aβ的生成，從而降低Aβ的含量，防止Aβ在腦內(nèi)聚積繼續(xù)形成老年斑來預(yù)防或治療阿爾茨海默病(HardyJ,DennisDJ.Science,2002,297:353-356)。同時也可以用于預(yù)防或治療其它由β-淀粉樣多肽聚集或沉淀引起的淀粉樣變性血管病，庫魯(Kuru)病和唐氏(Down)綜合癥等疾病。BACE1基因敲除的小鼠腦內(nèi)沒有Aβ的產(chǎn)生，生活基本正常，進(jìn)一步表明可以通過阻斷Aβ的產(chǎn)生來預(yù)防或治療由Aβ聚集或沉淀引起的疾病，特別是阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病，并且推斷不會產(chǎn)生很大的副作用(RoberdsSL,AndersonJ,BasiG,etal:HumMolGenet,2001,10(12):1317-1324)。因此，目前需要開發(fā)新的能夠有效抑制β-分泌酶活性的藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了式I所示的化合物。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，式I的化合物或其可藥用鹽能夠有效地抑制β-分泌酶的活性，可以減少淀粉樣前體蛋白被β-分泌酶代謝生成β-淀粉樣多肽，從而降低β-淀粉樣多肽在體內(nèi)的含量，防止其在體內(nèi)繼續(xù)聚積形成沉淀。因此，本發(fā)明的式I化合物或其可以用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病以及其它與β-淀粉樣多肽聚集或沉淀相關(guān)的疾病或病癥例如由β-淀粉樣多肽聚集或沉淀引起的淀粉樣變性血管病、庫魯病和唐氏綜合癥等。由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一個方面涉及式I所示的化合物或其可藥用鹽，其中：G1為其中R1選自氫、鹵素、甲基、三氟甲基、三氟甲氧基和硝基；G2選自其中R2選自氫、R3選自氫、上述各取代基中的虛線表示連接位點。術(shù)語“鹵素”選自氟、氯、溴、碘等。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的化合物或其可藥用鹽，其選自下面的表1中的化合物，或其可藥用鹽：表1：本發(fā)明涉及的部分化合物本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽的制備方法，包括下述步驟：其中，條件a表示TBAF，PdCl2(PPh3)2，回流，CuI，條件b表示KMnO4，MgSO4，Na2CO3，條件c表示1-甲基鹽酸胍，Na2CO3,EtOH/H2O；上述G1和G2的含義分別如上面任一項中所述。在本發(fā)明的一個實施方案中，通式I化合物骨架的基本合成步驟如下：條件a表示TBAF，PdCl2(PPh3)2，回流，CuI，條件b表示KMnO4，MgSO4，Na2CO3，條件c表示1-甲基鹽酸胍，Na2CO3,EtOH/H2O；對于不同的G1、G2取代基團，具體的合成路線會有所不同。主要區(qū)別在于結(jié)構(gòu)的構(gòu)建以及G1、G2基團的衍生化，骨架的合成方法類似。上述G1和G2的含義分別如上面任一項中所述。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的制備方法，其選自如下的方法(1)至(4)中的任意一種方法：方法(1)：當(dāng)G2為G1為R2為時，合成路線如下：條件a表示TBAF，PdCl2(PPh3)2，回流，CuI，條件b表示KMnO4，MgSO4，Na2CO3，條件c表示1-甲基鹽酸胍，Na2CO3，EtOH/H2O；條件d表示acetone，K2CO3；方法(2)：當(dāng)G2為G1為R2為時，合成路線如下：條件a表示TBAF,PdCl2(PPh3)2，CuI，回流，條件b表示PdCl2(PPh3)2，TBAF，條件c表示KMnO4，MgSO4,Na2CO3，條件d表示1-甲基鹽酸胍，Na2CO3；方法(3)：當(dāng)G2為G1為時，合成路線如下：條件a表示TBAF,PdCl2(PPh3)2,CuI,回流，條件b表示KMnO4,MgSO4,Na2CO3，條件c表示HCl/THF，條件d表示THF,DIPEA，條件e表示1-甲基鹽酸胍，Na2CO3；以及方法(4)：當(dāng)G2為G1為時，合成路線如下：條件a表示PdCl2(PPh3)2,K2CO3，條件b表示1-甲基鹽酸胍,Na2CO3，條件c表示acetone,K2CO3，條件d表示PdCl2(PPh3)2,TBAF。對于G為不同取代基的各衍生物，其合成路線分別如下：1、當(dāng)G2為(且R2不為)時，以G1為/R2為為例，合成路線如下：a.)TBAF,PdCl2(PPh3)2,回流,CuI,b.)KMnO4,MgSO4,Na2CO3,c.)1-甲基鹽酸胍,Na2CO3,EtOH/H2O；d.)acetone,K2CO3G1為時，反應(yīng)路線同上。R2為其它基團時，只需要將換成其它相應(yīng)試劑；或?qū)㈤g溴苯酚換成Boc保護的間溴苯胺，生成乙內(nèi)酰脲骨架之后再脫除Boc保護，之后再進(jìn)行衍生化即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該容易理解這些酚羥基或芳香胺的?；蛉〈磻?yīng)。2、當(dāng)G2為(且R2為)時，以G1為為例，合成路線如下：a.)TBAF,PdCl2(PPh3)2,CuI,回流,b.)PdCl2(PPh3)2,TBAF,c.)KMnO4,MgSO4,Na2CO3,d.)1-甲基鹽酸胍,Na2CO3G1為時，反應(yīng)路線同上。3、當(dāng)G2為時，以G1為為例，合成路線如下：a.)TBAF,PdCl2(PPh3)2,CuI,回流,b.)KMnO4,MgSO4,Na2CO3,c.)HCl/THFd.)THF,DIPEAe.)1-甲基鹽酸胍,Na2CO3在脫除MOM保護基時得到兩個中間體，經(jīng)分離后分別能得到一種終產(chǎn)物。G1為時，反應(yīng)路線同上。4、當(dāng)G2為時，以G1為為例，只需要選取關(guān)鍵中間體使用相應(yīng)的間氨基苯硼酸/間羥基苯硼酸/間溴苯硼酸/苯硼酸作為結(jié)構(gòu)單元，就能進(jìn)行進(jìn)一步的衍生化。合成路線如下，不同路線選取不同R3基團作為代表，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該容易理解各種基團之間是可以自由替代的。a.)PdCl2(PPh3)2,K2CO3,b.)1-甲基鹽酸胍,Na2CO3c.)acetone,K2CO3d.)PdCl2(PPh3)2,TBAFG1為時，反應(yīng)路線同上。根據(jù)本發(fā)明的詳細(xì)教導(dǎo)以及已有的合成常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地合成本發(fā)明的式I化合物。本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含治療和/或預(yù)防有效量的本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽，以及任選的藥學(xué)上可接受的輔料或載體。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1－90重量％的式Ⅰ化合物和/或其可藥用鹽。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將式Ⅰ化合物或其可藥用鹽與一種或多種固體或液體藥物輔料結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?。本發(fā)明的式Ⅰ化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿⒕忈屩苿?、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種輔料。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分式Ⅰ化合物或其可藥用鹽與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分式Ⅰ化合物或其可藥用鹽制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。本發(fā)明式Ⅰ化合物，或其可藥用鹽的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。本文所用的術(shù)語“組合物”意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品?？筛淖儽景l(fā)明藥物組合物中各活性成分的實際劑量水平，以便所得的活性化合物量能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體化合物的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽在制備用于治療和/或預(yù)防和/或輔助治療與β-淀粉樣多肽聚集或沉淀有關(guān)的疾病或病癥的藥物中的用途；優(yōu)選地，所述與β-淀粉樣多肽聚集或沉淀有關(guān)的疾病或病癥是由β-淀粉樣多肽聚集或沉淀引起的疾病或病癥；優(yōu)選地，所述的疾病或病癥選自阿爾茨海默病、淀粉樣變性血管病、庫魯病和唐氏綜合癥中的任意一種或者多種。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽在制備抑制β-分泌酶的藥物或者試劑中的用途。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽在制備減少或阻斷Aβ的生成的藥物中的用途。本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療與β-淀粉樣多肽聚集或沉淀有關(guān)的疾病或病癥的方法，包括給與受試者有效量的本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽的步驟。當(dāng)用于上述治療和/或預(yù)防和/或輔助治療時，治療和/或預(yù)防有效量的一種本發(fā)明化合物可以以純形式應(yīng)用，或者以藥學(xué)可接受的鹽的形式應(yīng)用?；蛘?，所述化合物可以以含有該目的化合物與一種或多種藥物可接受輔料的藥物組合物給藥。但應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明化合物和組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴(yán)重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時間；與所采用的具體化合物組合使用或同時使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說來，本發(fā)明式Ⅰ化合物用于哺乳動物特別是人的劑量可以介于0.001-1000mg/kg體重/天，例如介于0.01-100mg/kg體重/天，例如介于0.01-10mg/kg體重/天。根據(jù)本發(fā)明的化合物可以有效地預(yù)防和/或治療本發(fā)明所述的各種疾病或病癥。術(shù)語“有效量”是指可在受試者中實現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的劑量。術(shù)語“疾病和/或病癥”是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所述疾病和/或病癥有關(guān)。術(shù)語“受試者”可以指患者或者其它接受本發(fā)明藥物組合物以治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外抑制β-分泌酶的方法，包括使用有效量的本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法是非治療目的的。本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外減少或阻斷Aβ的生成的方法，包括使用有效量的本發(fā)明任一項所述的化合物或其可藥用鹽的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法是非治療目的的。在本發(fā)明的上下文中，使用如下縮略語：Boc：叔丁氧羰基TBAF：四丁基氟化氨DMSO：二甲基亞砜dppf：1,1-雙二苯基膦二茂鐵PdCl2(PPh3)：1,1-雙三苯基膦二氯化鈀復(fù)合物PdCl2(dppf)：1,1-雙二苯基膦二茂鐵二氯化鈀復(fù)合物。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品?；衔锏娜埸c由RY-1熔點儀測定，溫度計未較正。質(zhì)譜由MicromassZabSpec高分辨率質(zhì)譜儀(分辨率1000)測定。1H-NMR由JNM-ECA-400超導(dǎo)NMR儀測定，工作頻率1H-NMR400MHz。實施例1：3-(4-環(huán)丙基-2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-咪唑烷)苯基-乙基(甲基)氨基甲酸酯的制備(化合物1)反應(yīng)路線：中間體制備：3-(環(huán)丙乙炔基)苯酚環(huán)丙乙炔(1.2g)和間溴苯酚(3.4g)溶于30mlTHF中，加入TBAF15.6g，PdCl2(PPh3)20.42g，油浴80℃反應(yīng)8h。體系冷卻至室溫，加水50ml、乙酸乙酯40ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，得黃色油狀液體2.9g，收率92％。1-環(huán)丙基-2-(3-羥基苯基)乙烷-1,2-二酮上步中間體溶于96ml丙酮和60ml水的混合溶劑中，依次加入硫酸鎂4.4g、碳酸鈉2.9g、高錳酸鉀11.6g，室溫反應(yīng)2h，加水100ml、乙酸乙酯150ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，濃縮，得黃色油狀液體2.2g，收率63％。5-環(huán)丙基-5-(3-羥基苯基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮上步中間體與1-甲基胍鹽酸鹽1.5g、碳酸鈉3.2g混合，加入30ml50％乙醇溶解，油浴90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，濃縮除去乙醇，加水25ml、乙酸乙酯25ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比10:1洗脫，得白色固體1.2g，收率42％。目標(biāo)產(chǎn)物制備：上步中間體(0.5g)溶于15ml無水THF中，加入N-甲基-N-乙基-氨基甲酰氯0.62g、DIPEA2ml，回流反應(yīng)24h。體系冷卻至室溫，直接硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比30:1洗脫，得無色油狀液體0.24g。油狀液體溶于5ml乙醚，劇烈攪拌下滴加2.2NHCl/Et2O0.5ml，有白色固體析出，過濾，烘干，得目標(biāo)化合物0.07g，收率21％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.4246-0.5458(4H,m),1.0397-1.1048(4H,m),1.6457-1.6863(1H,m),2.8542(2H,s),2.9572(3H,s),3.0489-3.0840(2H,m),3.3194-3.3376(1H,m),3.5295-3.5463(1H,m),6.7158-6.7410(1H,m),6.9379-6.9491(2H,m),7.1803(1H,t,J＝8.12Hz),9.1468(1H,d,J＝18.48Hz)。實施例2：5-環(huán)丙基-5-(3-(環(huán)丙乙炔基)苯基)-2-亞氨基-3-甲基-咪唑啉-4-酮的制備(化合物2)反應(yīng)路線：中間體制備：中間體制備路線與實施例1基本相同，只是原料之一換成間二溴苯，在1-環(huán)丙基-2-(3-溴-苯基)乙烷-1,2-二酮制備得到之后多出一步，與環(huán)丙乙炔反應(yīng)得1-環(huán)丙基-2-(3-(環(huán)丙乙炔基)苯基)乙烷-1,2-二酮。該步操作如下：環(huán)丙乙炔0.33g與1-環(huán)丙基-2-(3-溴-苯基)乙烷-1,2-二酮0.6g混合溶于30ml無水THF中，加入TBAF3.9g、PdCl2(PPh3)20.11g，油浴80℃反應(yīng)8h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，加水40ml、乙酸乙酯40ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，石油醚/乙酸乙酯體積比25:1洗脫，得黃色油狀液體0.45g。目標(biāo)產(chǎn)物制備：將上步中間體0.21g與1-甲基胍鹽酸鹽0.18g、碳酸鈉0.36g混合，加入15ml50％乙醇溶解，油浴90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，濃縮除去乙醇，加水20ml、乙酸乙酯20ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比20:1洗脫，得白色固體59mg，收率24％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.12-0.14(1H,m),0.30-0.35(3H,m),0.72-0.74(2H,m),0.86-0.88(2H,m),1.46-1.56(2H,m),2.91(3H,s),6.89(1H,s,br),7.22-7.33(2H,m),7.53-7.56(2H,m)。實施例3：5-環(huán)丙基-2-亞氨基-5-(1H-茚-7-基)-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物3)該實施例與下一實施例的合成路線如下：中間體制備：4-(環(huán)丙乙炔基)-1-(甲氧基-亞-甲氧基)-2,3-二氫-1H-茚環(huán)丙乙炔(1.2g)與中間體47(5.1g)溶于30mlTHF中，加入TBAF15.6g、PdCl2(PPh3)20.42g，油浴80℃反應(yīng)8h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，加水40ml、乙酸乙酯40ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，石油醚/乙酸乙酯體積比20:1洗脫，得黃色油狀液體4.5g(混合物)。1-環(huán)丙基-2-(1-(甲氧基-亞-甲氧基)-2,3-二氫-1H-茚-4-基)乙烷-1,2-二酮上步中間體溶于96ml丙酮與60ml水的混合溶劑中，依次加入硫酸鎂3.6g、碳酸鈉2.1g、高錳酸鉀9.4g，室溫反應(yīng)2h，然后加水100ml、乙酸乙酯100ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，石油醚/乙酸乙酯體積比20:1洗脫，得黃色油狀液體4.2g(混合物)。1-(1-氯-2,3-二氫-1H-茚-4-基)-2-環(huán)丙基乙烷-1,2-二酮上步中間體溶于30ml的THF中，劇烈攪拌下加入濃鹽酸30ml，室溫攪拌30min，加入水20ml、乙酸乙酯25ml，充分振蕩，分液，有機相以飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，石油醚/乙酸乙酯體積比10:1-5:1洗脫，得目標(biāo)中間體0.10g，同時分得中間體4-(環(huán)丙乙炔基)-1-氯-2,3-二氫-1H-茚1.60g。目標(biāo)產(chǎn)物制備：將上步目標(biāo)中間體與1-甲基胍鹽酸鹽0.1g、碳酸鈉0.3g混合，加入10ml50％乙醇溶解，加熱至90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，濃縮除去乙醇，加水15ml、乙酸乙酯15ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比20:1洗脫，得白色固體38mg，收率34％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.1243-0.6119(3H,m),1.2333(1H,s),1.5745-1.5948(1H,m),2.9694-3.0541(5H,m),6.5374-6.5515(2H,m),6.8933-6.9067(1H,m),7.1315-7.4062(2H,m),7.6198-7.6934(1H,m)。實施例4：5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基-5-(1-(甲基(2-丙炔基)氨基))-2,3-二氫-1H-茚-4-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物4)中間體制備：1-環(huán)丙基-2-(1(甲基(2-丙炔基)氨基))-2,3-二氫-1H-茚-4-基)乙烷-1,2-二酮中間體4-(環(huán)丙乙炔基)-1-氯-2,3-二氫-1H-茚1.60g溶于10ml無水THF中，加入甲基丙炔胺0.5g、DIPEA2ml，回流反應(yīng)24h。體系冷卻至室溫，直接硅膠柱分離，石油醚/乙酸乙酯體積比2:1洗脫，得無色油狀液體0.62g，收率34％。目標(biāo)產(chǎn)物制備：中間體64與1-甲基胍鹽酸鹽0.3g、碳酸鈉0.6g混合，加入20ml50％乙醇溶解，加熱至90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，濃縮除去乙醇，加水15ml、乙酸乙酯15ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比20:1洗脫，得白色固體53mg。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.1016-0.1247(1H,m),0.3636-0.4715(2H,m),0.6439-0.6880(1H,m),1.0351(1H,d,J＝5.88Hz),1.5098-1.5630(1H,m),1.9035-1.9519(2H,m),2.1018-2.1123(3H,m),2.5235-2.5810(1H,m),3.0160(3H,s),3.1365-3.1471(1H,m),3.2199-3.3677(4H,m),4.2603-4.3233(1H,m),7.2329-7.2665(2H,m),7.6952-7.7177(1H,m)。實施例5：3'-(4-環(huán)丙基-2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-咪唑烷)-[1,1'-二苯基]-3-基-乙基(甲基)氨基甲酸酯的制備(化合物5)反應(yīng)路線：中間體制備：該化合物中間體的合成也是以1-(3-溴苯基)-2-環(huán)丙乙烷-1,2-二酮為關(guān)鍵中間體，再與3-羥基苯硼酸發(fā)生Suzuki反應(yīng)。從該步驟開始，具體操作如下：1-環(huán)丙基-2-(3'-羥基-[1,1'-二苯基]-3-基)乙烷-1,2-二酮將中間體1-(3-溴苯基)-2-環(huán)丙乙烷-1,2-二酮(1.2g)與3-羥基苯硼酸1.2g溶于30ml1,4-二氧六環(huán)，然后加入碳酸鉀2.4g、PdCl2(PPh3)20.15g，慢慢加水至體系澄清，加熱至90℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，加水30ml、乙酸乙酯40ml，充分振蕩，分液，有機相以飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，得白色固體1.2g，收率95％。5-環(huán)丙基-5-(3'-羥基-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮上步中間體與1-甲基胍鹽酸鹽0.6g、碳酸鈉1.2g混合，加入15ml50％乙醇溶解，油浴90℃反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，濃縮除去乙醇，加水25ml、乙酸乙酯30ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比10:1洗脫，得白色固體0.82g，收率62％。目標(biāo)產(chǎn)物制備：上步中間體(0.3g)溶于10mlTHF中，加入N-甲基-N-乙基-氨基甲酰氯0.3g、DIPEA0.5ml，回流反應(yīng)36h，體系冷卻至室溫，直接硅膠柱分離，得白色固體0.07g，收率19％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.4810-0.5685(4H,m),1.0421-1.1082(3H,m),1.7348-1.8015(1H,m),2.8636(2H,s),2.9800(3H,d,J＝4.04Hz),3.0670(1H,s),3.5143-3.5664(1H,m),6.7723-6.7964(1H,m),7.0206-7.0615(2H,m),7.2722(1H,t,J＝7.64Hz),7.4482-7.5681(3H,m),7.7665(1H,s),9.2919(1H,d,J＝20.4Hz),9.5853(1H,s)。實施例6：3'-(4-環(huán)丙基-2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-咪唑烷)-[1,1'-二苯基]-3-基-二甲基氨基甲酸酯的制備(化合物6)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.4750-0.5664(4H,m),1.7540-1.7904(1H,m),2.8850(3H,s),2.9854(3H,s),3.0952(3H,s),6.7730-6.7971(1H,m),7.0196-7.0594(2H,m),7.2724(1H,t,J＝7.84Hz),7.4489-7.5683(3H,m),7.7555(1H,s),9.2945(1H,s),9.5919(1H,s)。實施例7：5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物7)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.1764-0.1966(1H,m),0.3104–0.4389(3H,m),1.5423-1.5866(1H,m),2.9384(3H,s),3.6110(1H,t,J＝2.24Hz),4.8804(2H,d,J＝2.24Hz),6.9900-7.0152(1H,m),7.1845-7.2114(2H,m),7.3941-7.4417(2H,m),7.5342-7.5538(1H,m),7.5970-7.6166(1H,m),7.8419(1H,s)。實施例8：5-環(huán)丙基-5-(3'-(2-氟乙氧基)-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物8)參考實施例5合成方法。此系列最后一步取代反應(yīng)后處理稍有不同：將中間體5-環(huán)丙基-5-(3'-羥基-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮(0.15g)溶于5ml丙酮中，然后依次加入碳酸鉀0.92g、1-溴-2-氟苯0.12g，室溫反應(yīng)36h。反應(yīng)完成后，體系直接過濾，濾渣用5ml丙酮洗滌，合并濾液，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比20:1洗脫，得白色固體58mg，收率34％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.18-0.20(1H,m),0.34-0.44(3H,m),1.55-1.62(1H,m),2.95(3H,s),4.27-4.36(2H,m),4.71-4.85(2H,m),6.98-7.00(1H,m),7.16-7.20(2H,m),7.39-7.44(2H,m),7.55-7.62(2H,m),7.85(1H,s)。實施例9：5-環(huán)丙基-5-(3'-乙氧基-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物9)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.40-0.60(4H,m),1.36(3H,t,J＝7.00Hz),1.73-1.76(1H,m),3.09(3H,s),4.10(2H,q,J＝7.00Hz),6.96-6.98(1H,m),7.16-7.21(2H,m),7.38-7.42(1H,m),7.50-7.53(1H,m),7.60-7.68(2H,m),7.81(1H,s),9.22(2H,s,br)。實施例10：5-(3'-(3-氯丙氧基)-[1,1'-二苯基]-3-基)-5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物10)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.21-0.22(1H,m),0.36-0.45(3H,m),1.56-1.63(1H,m),2.17-2.23(2H,m),2.96(3H,s),3.83(2H,t,J＝6.44Hz),4.17(2H,t,J＝6.20Hz),6.97-6.99(1H,m),7.14-7.19(2H,m),7.38-7.45(2H,m),7.55-7.62(2H,m),7.84(1H,s)。實施例11：5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-丙氧基-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物11)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.15-0.18(1H,m),0.28-0.44(3H,m),1.00(3H,t,J＝7.28Hz),1.53-1.60(1H,m),1.71-1.80(2H,m),2.93(3H,s),3.99(2H,t,J＝6.48Hz),6.83(1H,s,br),6.93-6.96(1H,m),7.10-7.15(2H,m),7.36-7.43(2H,m),7.53-7.55(1H,m),7.60-7.62(1H,m),7.84(1H,s)。實施例12：5-(3'-丁氧基-[1,1'-二苯基]-3-基)-5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物12)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.18-0.19(1H,m),0.33-0.44(3H,m),0.95(3H,t,J＝7.28Hz),1.43-1.49(2H,m),1.56-1.59(1H,m),1.69-1.76(2H,m),2.94(3H,s),4.03(2H,t,J＝6.20Hz),6.93-6.96(1H,m),7.10-7.15(2H,m),7.36-7.43(2H,m),7.53-7.62(2H,m),7.83(1H,s)。實施例13：5-環(huán)丙基-5-(3'-(3-氟丙氧基)-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物13)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.18-0.21(1H,m),0.35-0.45(3H,m),1.57-1.60(1H,m),2.09-2.18(2H,m),2.95(3H,s),4.15(2H,t,J＝6.16Hz),4.58(1H,t,J＝5.88Hz),4.70(1H,t,J＝5.88Hz),6.96-6.99(1H,m),7.13-7.18(2H,m),7.38-7.44(2H,m),7.55-7.62(2H,m),7.84(1H,s)。實施例14：5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)氨基)-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物14)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.17-0.18(1H,m),0.33-0.44(3H,m),1.51-1.56(1H,m),2.93(3H,m),3.08(1H,t,J＝2.24Hz),3.90-3.93(2H,m),6.15(1H,t,J＝6.16Hz),6.63-6.66(1H,m),6.80-6.85(2H,m),7.19-7.23(1H,m),7.32-7.46(2H,m),7.56-7.58(1H,m),7.80(1H,s)。實施例15：5-環(huán)丙基-5-(3'-(環(huán)丙乙炔基)-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物15)參考實施例5合成方法。中間體5-環(huán)丙基-5-(3'-溴-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮(0.32g)與環(huán)丙乙炔(0.2g)溶于20mlTHF中，加入TBAF0.78g，PdCl2(PPh3)221mg，油浴80℃反應(yīng)24h。反應(yīng)完成后，體系冷卻至室溫，加水20ml、乙酸乙酯20ml，充分振蕩，分液，有機相以無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比20:1洗脫，得白色固體75mg，收率24％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.15-0.16(1H,m),0.30-0.36(3H,m),0.88-0.92(2H,m),1.23-1.31(2H,m),1.45-1.59(2H,m),2.92(3H,m),6.84(2H,s),7.25-7.33(1H,m),7.43-7.47(2H,m),7.54-7.67(3H,m),7.72-7.85(2H,m)。實施例16：5-([1,1'-二苯基]-3-基)-5-環(huán)丙基-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮的制備(化合物16)參考實施例5合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:0.16-0.18(1H,m),0.30-0.44(3H,m),1.53-1.59(1H,m),2.93(3H,s),6.76(2H,s,br),7.35-7.54(5H,m),7.59-7.70(3H,m),7.86(1H,s)。實施例17：3'-(4-(3-氯苯基)-2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-咪唑烷)-[1,1'-二苯基]-3-基-乙基(甲基)氨基甲酸酯的制備(化合物17)與實施例5基本合成路線相似，只是將環(huán)丙乙炔替換為相應(yīng)的苯乙炔結(jié)構(gòu)(該類結(jié)構(gòu)可商業(yè)購買，也可由3-取代碘苯與TMS保護的乙炔反應(yīng)生成)，其它步驟一致。中間體5-(3-氯苯基)-5-(3'-羥基-[1,1'-二苯基]-3-基)-2-亞氨基-3-甲基咪唑啉-4-酮(0.12g)溶于10ml丙酮中，加入碳酸鉀0.48g、N-甲基N-乙基-氨基甲酰氯0.3g，室溫反應(yīng)36h。反應(yīng)完成后，體系直接過濾，濾渣用5ml丙酮洗滌，合并濾液，硅膠柱分離，二氯甲烷/甲醇體積比20:1洗脫，得白色固體0.02g，收率14％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:1.06-1.35(4H,m),2.89-2.91(3H,m),3.03-3.05(3H,m),3.44-3.46(1H,m),7.11-7.13(1H,m),7.28-7.72(12H,m)。實施例18：3'-(4-(3-氯苯基)-2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-咪唑烷)-[1,1'-二苯基]-3-基-二甲基氨基甲酸酯的制備(化合物18)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:2.87-2.92(5H,m),3.01(1H,s),3.07(3H,s),7.11-7.14(1H,m),7.31-7.73(12H,m)。實施例19：5-(3-氯苯基)-2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物19)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.01(3H,s),3.59(1H,t,J＝2.12Hz),4.87(2H,d,J＝2.56Hz),6.83(1H,s,br),6.99-7.01(1H,m),7.13-7.15(2H,m),7.33-7.53(8H,m),7.72(1H,s)。實施例20：3'-(2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-(3-(三氟甲氧基)苯基)-4-咪唑烷)-[1,1'-二苯基]-3-基-乙基(甲基)氨基甲酸酯的制備(化合物20)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:1.09-1.28(3H,m),2.91(2H,s),3.01-3.05(4H,m),3.30-3.34(2H,m),3.42-3.47(1H,m),6.91(1H,s,br),7.11-7.13(1H,m),7.24-7.27(2H,m),7.38-7.58(7H,m),7.72(1H,s)。實施例21：3'-(2-亞氨基-1-甲基-5-氧代-4-(3-(三氟甲氧基)苯基)-4-咪唑烷)-[1,1'-二苯基]-3-基-二甲基氨基甲酸酯的制備(化合物21)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:2.93(3H,s),3.01(3H,s),3.07(3H,s),6.89(1H,s,br),7.11-7.13(1H,m),7.25-7.27(2H,m),7.39-7.58(9H,m),7.73(1H,s)。實施例22：2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)-5-(3-(三氟甲氧基)苯基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物22)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.01(3H,s),3.58(1H,t,J＝2.24Hz),4.86(2H,d,J＝2.52Hz),6.84-7.01(3H,m),7.12-7.14(2H,m),7.25-7.27(1H,m),7.38-7.65(7H,m),7.71(1H,s)。實施例23：5-(3-氟苯基)-2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物23)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.00(3H,s),3.57(1H,s),4.86(2H,d,J＝2.04Hz),6.78(2H,s,br),6.99-7.01(1H,m),7.08-7.15(3H,m),7.24-7.27(1H,m),7.37-7.42(4H,m),7.46-7.48(1H,m),7.52-7.54(1H,m),7.72(1H,s)。實施例24：2-亞氨基-3-甲基-5-苯基-5-(3'(2-丙炔基)-氧代)[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物24)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.00(3H,s),3.59(1H,t,J＝2.24Hz),4.86(2H,d,J＝2.24Hz),6.72(1H,s,br),6.98-7.00(1H,m),7.12-7.14(2H,m),7.23-7.53(9H,m),7.73(1H,s)。實施例25：5-(3-溴苯基)-2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物25)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.00(3H,s),3.59(1H,t,J＝2.24Hz),4.86(2H,d,J＝2.24Hz),6.82(2H,s,br),6.99-7.01(1H,m),7.13-7.15(2H,m),7.30(1H,t,J＝7.84Hz),7.38-7.47(4H,m),7.53-7.55(2H,m),7.66-7.71(2H,m)。實施例26：2-亞氨基-3-甲基-5-(3-硝基苯基)-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物26)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.02(3H,s),3.58(1H,t,J＝2.24Hz),4.86(2H,d,J＝1.96Hz),6.91-7.01(3H,m),7.14-7.16(2H,m),7.38-7.49(3H,m),7.55-7.56(1H,m),7.63-7.67(1H,m),7.73(1H,s),8.00-8.02(1H,m),8.13-8.15(1H,m),8.41(1H,s)。實施例27：2-亞氨基-3-甲基-5-(3'(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)-5-(3(三氟甲基)苯基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物27)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:3.01(3H,s),3.59(1H,t,J＝2.24Hz),4.86(2H,d,J＝2.52Hz),6.88(2H,s,br),6.99-7.01(1H,m),7.13-7.15(2H,m),7.38-7.46(3H,m),7.54-7.65(3H,m),7.72(1H,s),7.86-7.88(2H,m)。實施例28：2-亞氨基-3-甲基-5-(3'-(2-丙炔基)-氧代)-[1,1'-二苯基]-3-基)-5-(3-甲基苯基)咪唑啉-4-酮的制備(化合物28)參考實施例17合成方法。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:2.25(3H,s),2.99(3H,s),3.59(1H,t,J＝2.24Hz),4.86(2H,d,J＝2.52Hz),6.71(2H,s,br),6.98-7.05(2H,m),7.12-7.21(3H,m),7.27-7.29(2H,m),7.37-7.53(4H,m),7.72(1H,s)。實施例29：化合物抑制BACE1的活性1.實驗試劑TruPointTMBeta-SecretaseAssayKit384(PerkinElmer，AD0258),包含BACE1底物及反應(yīng)緩沖液。RecombinantHumanBACE1(新購beta-Secretase，Invitrogen，P2947酶，活性138Units/ml)。取138mU/μL的BACE14.9μL與反應(yīng)緩沖液995μL混合，配制成為0.67mU/μL濃度備用。去離子水(mili-Q－Biocel制備)；二甲基亞砜(DimethyIsulfoxidDMSO，ACROS公司產(chǎn)品，12779)。2.實驗方法實驗共分為3組，包括：空白對照組、陰性對照組和受試藥物組。實驗步驟如下：[1]測試樣品(S)：①建立BACE1反應(yīng)體系，在384孔板中，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)配制的不同濃度本發(fā)明化合物2μL(5個濃度級別，從10-5到10-9)；②然后每孔加入15μL0.67mU/μL含BACE1酶的反應(yīng)緩沖液；③室溫孵育30min。④再加入15μL400nmol/LTruPointTMBACE1底物。[2]陰性對照(C)：①向孔中加入2μLDMSO；②然后加入15μL0.67mU/μL含BACE1酶的反應(yīng)緩沖液；③室溫孵育30min；④再加入15μL400nmol/LTruPointTMBACE1底物。[3]空白對照(B)：①向孔中加入2μLDMSO；②然后加入15μL不含酶的分析緩沖液(前述TruPointTM試劑盒中自帶)；③室溫孵育30min；④再加入15μL400nmol/LTruPointTMBACE1底物。[4]孵育：室溫孵育6小時，孵育過程中用蓋子蓋上板子以防蒸發(fā)。[5]終止反應(yīng)：向測試樣品孔、背景孔以及空白孔中加入10μLBACE1終止液以終止反應(yīng)。[6]使用VICTOR-Ш(PE)多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光波長340nm和發(fā)射光波長615nm測量熒光強度。結(jié)果計算：抑制率(％)＝[1-(S-B)/(C-B)]×100B：是指空白對照(DMSO，底物和分析緩沖液)在溫孵6小時測定的熒光強度。C：是指陰性對照(底物和含BACE1酶的反應(yīng)緩沖液)在溫孵6小時測定的熒光強度。S:是指樣品(底物，溶解于DMSO的本發(fā)明的化合物和含BACE1酶的反應(yīng)緩沖液)在溫孵6小時測定的熒光強度。測定5個濃度的抑制率數(shù)值，計算化合物IC50值。3.實驗結(jié)果本發(fā)明部分化合物的BACE1抑制活性測定結(jié)果見下面的表2。表2：BACE1抑制活性測定結(jié)果實施例序號抑制率(％，c＝0.1μM)IC50(nM)139.51660265.3407790.7134894.584.7988.83031069.16031169.45411376.93311590.81451962.21822287.92822491.91272594.91292687.92322777.12642878.7270結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物能夠有效地抑制BACE1的活性。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解：根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁1 2 3