本發(fā)明涉及通式(I)新型二芳基脲類化合物作為用于炎癥性和腫瘤性藥物的用途。

背景技術(shù)：

絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是細胞內(nèi)蛋白激酶的一種，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶系列，能夠作為細胞內(nèi)眾多活化反應(yīng)和功能反應(yīng)的調(diào)節(jié)介質(zhì)，參與基因表達、細胞增殖和死亡等眾多的功能性過程。p38MAPK信號通路是MAPK家族的重要組成成員，它的活化是眾多前炎性因子和壓力因素作用的結(jié)果，不僅在眾多包括炎性細胞增殖分化和擴增的細胞內(nèi)信號反饋過程中發(fā)揮著非常重要的作用，而且參與應(yīng)激反應(yīng)的過程。有許多相關(guān)的文獻描述了p38MAPK相關(guān)的性質(zhì)和在疾病研究中的應(yīng)用以及前景。

p38MAPK原先被認為是通過細胞因子發(fā)揮抑制作用的抗炎藥物的結(jié)合蛋白(CSBP)，首先在1993年由Han等在實驗中發(fā)現(xiàn)，1994年由Han等首先在小鼠肝臟細胞中克隆了p38MAPK的基因，它是編碼由360個氨基酸組成的38KD的蛋白，在炎性細胞因子的生物合成過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

目前發(fā)現(xiàn)的p38MAPK家族包含著四種類型：p38α，p38β，p38γand p38δ。不同p38MAPK亞型在組織分布、上游激酶調(diào)節(jié)、下游作用底物以及對細胞外刺激的反應(yīng)都各有不同，不同亞型的p38MAPK在結(jié)構(gòu)上也有著不同程度的相似性。p38α和p38β在各種體內(nèi)組織中都有著廣泛的表達，同時它們包含了74％相同的氨基酸序列，并且它們都是特異性表達的，p38γ與p38α有著64％的氨 基酸同源性，p38γ則主要在骨骼肌中表達，而p38δ則在小腸、肺組織、腎上腺、前列腺等處比較常見。由于p38α和β在身體各部位的分布比較廣泛，因而針對p38MAPK的抑制劑主要是針對p38α和β的抑制。許多證據(jù)表明p38MAPK途徑在炎癥疾病和癌癥中表現(xiàn)出重要的作用。對p38MAPK在這些相關(guān)疾病中的作用進行了總結(jié)，同時也表明了p38MAPK的抑制劑具有作為治療手段的潛在價值。

我們創(chuàng)造性發(fā)明了全新的二芳基脲類化合物用作P38MAPK抑制劑的研究，通過高通量篩選評價了這類化合物在體外對P38MAPK通路的抑制作用。發(fā)現(xiàn)幾乎所有實施例化合物細胞活性與P38α酶活性都優(yōu)于文獻公認的P38抑制劑SB203580，其中化合物實施例9和文獻報道的陽性對照藥SB203580比較，TNF-α抑制活性增強10倍，P38α酶抑制活性增強40倍.此外與陽性對照藥BIRB-796比較，實施例2和實施例31對P38α酶選擇性明顯提高。

本發(fā)明報道的具有高活性的P38MAPK小分子抑制劑，用以克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病及腫瘤疾病的難題，特別是窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病，為這類疾病的臨床治療提供新的醫(yī)學(xué)策略。

本發(fā)明目的在于提供一類新型的二芳基脲類化合物作為用于炎癥性和腫瘤性藥物的用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

1.本發(fā)明涉及通式(I)化合物或其異構(gòu)體的內(nèi)容

其中：

Ar₁為C₆-C₁₀芳香碳環(huán)，包括但不限于苯環(huán)、取代苯環(huán)、環(huán)辛四烯等；或C₃-C₁₀飽和不飽的非芳香雜環(huán)，包括但不限于環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烯、環(huán)己二烯；C₅-C₁₀的芳香雜環(huán)，包括一到多個選自O(shè)，N，S的雜原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；或者C₅-C₈的單雜環(huán)或者C₈-C₁₁的雙雜環(huán)，包括一到多個選自O(shè)，N，S的雜原子，包括但不限于四氫呋喃、四氫噻吩、哌啶等；其中Ar₁獨立并選擇性的被一到多個R¹所取代；

R¹獨立的為

(1)C₁-C₁₀飽和的直連或支鏈烷烴，所述的烷基可部分或全部被鹵素原子取代，并且可以選擇性的被1-3個苯基，萘環(huán)或以下雜原子取代：喹啉基，異喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，異噁唑基，異噻唑基；上述的苯基，萘環(huán)或者雜環(huán)可以選擇性的被0-5個下述基團取代：鹵素，C₁-C₆的直連或支鏈烷基，C₂-C₆的直連或支鏈烯烴，C₁-C₆的直連或支鏈烷氧基，C₂-C₆的直連或支鏈烯氧基，鹵素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙?；减；?，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺?；?，羥基，氨基，單或雙C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

(2)C₃-C₁₀的環(huán)烷基和環(huán)烯基，所述基團可部分或全部被鹵素取代，或選擇性的被1-3個C₁-C₆的直連或支鏈烷基或C₁-C₆烷氧基取代；上述的環(huán)烷基或者環(huán)烯基的1-3個亞甲基可以選擇性的被O，NH，S，SO，SO₂，羰基，羥甲基取代；上述的環(huán)烷基或者環(huán)烯基的0-5個以下基團取代：鹵素，C₁-C₆的直連或支鏈烷基或C₁-C₆烷氧基；

(3)C₃-C₁₀不飽和的直連或支鏈烯基，所述的烷基可部分或全部被鹵素取代，并且選擇性的被1-3個C₁-C₆的直連或支鏈烷基，苯基，萘基或以下雜環(huán)取代：喹啉基，異喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，異噁唑基，異噻唑基；上述的苯基，萘環(huán)或者雜環(huán)可以選擇性的被0-5個下述基團取代：鹵素，C₁-C₆的直連或支鏈烷基，C₂-C₆的直連或支鏈烯烴，C₁-C₆的直連或支鏈烷氧基，C₂-C₆的直連或支鏈烯氧基，鹵素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙?；减；?，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺?；?，羥基，氨基，單或雙C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

(4)鹵素，硝基，羥基，氨基，羧基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，以及各種單取代或是雙取代的氨基化合物；

R₁獨立的為C₁-C₁₀飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴，鹵素取代；

R₂獨立的為C₁-C₁₀飽和的直連、支鏈以及環(huán)烷烴取代，苯環(huán)或取代苯環(huán)取代，苯并雜環(huán)取代，雜環(huán)取代：喹啉基，異喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，異噁唑基，異噻唑基；

另一方面，本發(fā)明提供包含化合物通式(I)化合物藥物的藥用組合物，其含有至少一種通式(I)化合物或其可藥用鹽、溶劑化物，一級一種或多種藥用載體或賦形劑。

另一方面，本發(fā)明還涉及制備通式(I)化合物或者其藥用鹽或溶劑化物的方法。

再一方面，本發(fā)明涉及通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病的藥用用途。

在又一方面，本發(fā)明提供通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細胞因子(TNF- α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險因子或病癥的方法，包括給予有此需要的對象治療或是預(yù)防有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明中所述的細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險因子或病癥包括下列疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性肺阻塞，窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，萊特爾氏綜合征，痛風(fēng)，骨關(guān)節(jié)炎，外傷性關(guān)節(jié)炎，急性滑膜炎，類風(fēng)濕性脊柱炎，痛風(fēng)性疾病和其他關(guān)節(jié)疾病，敗血癥，膿毒性休克，骨髓增生異常綜合征，中毒性休克，腦性瘧，腦膜炎，局部出血性中風(fēng)，骨質(zhì)疏松，充血性心力衰竭，冠狀動脈旁路搭橋術(shù)，腎小球性腎炎，慢性腎衰竭，糖尿病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，肌肉退化，濕疹，接觸性皮炎，牛皮癬，結(jié)膜炎，癌癥的輔助治療等。

在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽或溶劑化物，

其中：

Ar₁為苯環(huán)、取代苯環(huán)等；C₅-C₁₀的芳香雜環(huán)，包括一到多個選自O(shè)，N，S的雜原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；包括芳基取代的芳香雜環(huán)，如苯基取代的吡唑、咪唑等；

R₁獨立的為H或鹵素原子；

R₂苯環(huán)或取代苯環(huán)取代，苯并雜環(huán)取代，萘酚取代；

另一方面，本發(fā)明提供包含化合物通式(I)化合物藥物的藥用組合物， 其含有至少一種通式(I)化合物或其可藥用鹽、溶劑化物，一級一種或多種藥用載體或賦形劑。

另一方面，本發(fā)明還涉及制備通式(I)化合物或者其藥用鹽或溶劑化物的方法。

再一方面，本發(fā)明涉及通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病的藥用用途。

在又一方面，本發(fā)明提供通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險因子或病癥的方法，包括給予有此需要的對象治療或是預(yù)防有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明中所述的細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險因子或病癥包括下列疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性肺阻塞，窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損，傷牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，萊特爾氏綜合征，痛風(fēng)，骨關(guān)節(jié)炎，外傷性關(guān)節(jié)炎，急性滑膜炎，類風(fēng)濕性脊柱炎，痛風(fēng)性疾病和其他關(guān)節(jié)疾病，敗血癥，膿毒性休克，骨髓增生異常綜合征，中毒性休克，腦性瘧，腦膜炎，局部出血性中風(fēng)，骨質(zhì)疏松，充血性心力衰竭，冠狀動脈旁路搭橋術(shù)，腎小球性腎炎，慢性腎衰竭，糖尿病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，肌肉退化，濕疹，接觸性皮炎，牛皮癬，結(jié)膜炎，癌癥的輔助治療等。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽或溶劑化物，

Ar₁為異丙基苯環(huán)，2-三氟甲基氯苯，3-叔丁基-1-對甲基苯基吡唑，3-叔丁基-1-對硝基苯基吡唑，3-叔丁基-1-對氟苯基吡唑，3-叔丁基-1-苯基吡唑取代；

R₁獨立的為H或F原子；

R₂獨立的為苯并吡啶取代，1，2，3，4四氫萘酚取代；

另一方面，本發(fā)明提供包含化合物通式(I)化合物藥物的藥用組合物，其含有至少一種通式(I)化合物或其可藥用鹽、溶劑化物，一級一種或多種藥用載體或賦形劑。

另一方面，本發(fā)明還涉及制備通式(I)化合物或者其藥用鹽或溶劑化物的方法。

再一方面，本發(fā)明涉及通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病的藥用用途。

在又一方面，本發(fā)明提供通式(I)化合物用于治療或預(yù)防細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險因子或病癥的方法，包括給予有此需要的對象治療或是預(yù)防有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明中所述的細胞因子(TNF-α，IL-1等)介導(dǎo)的疾病，危險因子或病癥包括下列疾?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，慢性肺阻塞，窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，萊特爾氏綜合征，痛風(fēng)，骨關(guān)節(jié)炎，外傷性關(guān)節(jié)炎，急性滑膜炎，類風(fēng)濕性脊柱炎，痛風(fēng)性疾病和其他關(guān)節(jié)疾病，敗血癥，膿毒性休克，骨髓增生異常綜合征，中毒性休克，腦性瘧，腦膜炎，局部出血性中風(fēng)，骨質(zhì)疏松，充血性心力衰竭，冠狀動脈旁路搭橋術(shù)，腎小球性腎炎，慢性腎衰竭，糖尿病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，肌肉退化，濕疹，接觸性皮炎，牛皮癬，結(jié)膜炎，癌癥的輔助治療等。

本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括：

1-[3-(叔丁基)-1-(對甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

1-[3-(叔丁基)-1-(對硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

1-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

1-[3-(叔丁基)-1-(對硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

1-[3-(叔丁基)-1-(對甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

1-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}-3-(3-異丙基苯基)脲

1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

1-[3-(叔丁基)-1-對硝基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

1-[3-(叔丁基)-1-對硝基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

以及其可藥用鹽或溶劑化物。

本發(fā)明提供了通式(I)化合物及其藥用鹽的制備方法。

R₁＝CH₃，NO₂，H

R₂＝H，F(xiàn)

取代的苯肼A與氰基頻那酮B于80℃乙醇回流8小時得到中間體C；中間體C，E，G通過與氯甲酸三氯乙酯在0℃四氫呋喃溶液中反應(yīng)12小時得到中間 體D，F(xiàn)，H。

取代的鄰氰基氟苯I與6-羥基喹啉在90℃DMSO溶液中反應(yīng)2小時得到中間體M，中間體M在65℃四氫呋喃溶液中通過氫化鋁鋰還原1小時得到中間體N。

取代的鄰氰基氟苯I與6-羥基1，2，3，4四氫萘酮在90℃DMSO溶液中反應(yīng)2小時得到中間體J，中間體J在65℃四氫呋喃溶液中通過氫化鋁鋰還原1小時得到中間體K。

取代的鄰氰基氟苯I與6-羥基喹啉在90℃DMSO溶液中反應(yīng)2小時得到中間體M；中間體M在65℃四氫呋喃溶液中通過氫化鋁鋰還原1小時得到中間體N。

中間體D，F(xiàn)，H與中間體N，K在100℃DMSO溶液中反應(yīng)1小時得到終產(chǎn)物L(fēng)，O。

再一方面，本發(fā)明提供一種用于克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物組合物，其包含上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。

再一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，另外包含一種或多種克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物組合物，其包含上述式I的化合物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。

再一方面，本發(fā)明提供上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上 可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，它們用作克克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病藥物。

再一方面，本發(fā)明提供一種克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病的方法，其包括向該受試者給予治療有效量的上述式I的化合物，或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物，并且任選聯(lián)合給予一種或多種其它抗炎藥物。

再一方面，本發(fā)明提供上述式I的化合物或它們的異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或N-氧化物在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于克服炎癥、炎癥相關(guān)疾病、腫瘤及窒息性氣體或刺激性氣體造成的急性肺損傷疾病。

現(xiàn)將本申請說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)的用于描述本發(fā)明的術(shù)語定義如下。對于特定的術(shù)語，如果本申請中定義的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義不一致，則以本申請中定義的含義為準；如果在本申請中沒有定義，則其具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷基”是指直鏈或支鏈一價飽和烴基?！癈₁-C₁₀烷基”是指具有1～10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、異戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基和辛基等。術(shù)語“C₁-C₆烷基”意指具有1～6，即1、2、3、4、5或6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，典型地為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基等。相似地，術(shù)語“C₁-C₃烷基”意指具有1、2或3個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 即甲基、乙基、正丙基和異丙基。本發(fā)明中的烷基優(yōu)選是C₁-C₆烷基，更優(yōu)選是C₁-C₃烷基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴以及碘原子。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳香基”是指包含至少一個不飽和芳環(huán)的任選被取代的單環(huán)或二環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)，優(yōu)選具有6～10，即6、7、8、9或10個碳原子的芳基。本發(fā)明中的芳香基的實例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氫萘基、吲哚基和茚基等。本發(fā)明中的芳香基可以被以下基團取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳香雜環(huán)基”是指包含至少一個獨立地選自N、O或S的雜原子的任選被取代的單環(huán)或雙環(huán)不飽和芳環(huán)系統(tǒng)，優(yōu)選具有5～10，即5、6、7、8、9或10個原子的芳香雜環(huán)基?！胺枷汶s環(huán)基”的實例包括但不限于噻吩基、吡啶基、噻唑基、異噻唑基、呋喃基、吡咯基、三唑基、咪唑基、三嗪基、噁二唑基、噁唑基、異噁唑基、吡唑基、咪唑酮基、噁唑、噻唑酮基、四唑基、噻二唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、四氫三唑并吡啶基、四氫三唑并嘧啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、硫茚基、吲哚基、異吲哚基、吡啶酮基、噠嗪基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、咪唑并吡啶基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并噠嗪基、噁唑并噠嗪基、噻唑并噠嗪基、蝶啶基、呋咱基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基和嘌呤基等。本發(fā)明中的雜芳基可以被以下基團取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的飽和碳環(huán)基團。該環(huán)烷基可以是單環(huán)或者多環(huán)稠合系統(tǒng)，而且可以稠合在芳環(huán)上。這些基團的實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基等。 本文的環(huán)烷基可以是未取代的，或者在一個或多個可取代的位置被合適的基團取代。例如，本發(fā)明中的環(huán)烷基可任選被以下基團取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指包含至少一個和最多四個獨立地選自N、O或S的雜原子的任選被取代的單環(huán)和雙環(huán)飽和、部分飽和或不飽和的環(huán)狀系統(tǒng)，優(yōu)選具有4～10，即4、5、6、7、8、9或10個原子的5、6或7元雜環(huán)基，條件是該雜環(huán)基的環(huán)不含兩個相鄰的O或S原子。優(yōu)選的雜環(huán)基包括但不限于吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、哌啶基、嗎啉基或哌嗪基等。本發(fā)明中的雜環(huán)基可以被以下基團取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、鹵素、羥基、氨基、硝基、單(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆鹵代烷基或C₁-C₆鹵代烷氧基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳基烷基”是指被一個或多個如上定義的芳基取代的如上定義的烷基。優(yōu)選的芳基烷基是芳基-C₁-C₃烷基。本發(fā)明中的芳基烷基的實例包括芐基和苯基乙基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳香雜環(huán)基烷基”是指被如上定義的芳香雜環(huán)基取代的如上定義的烷基。更優(yōu)選的芳香雜環(huán)基烷基是5-或6-元雜芳基-C₁-C₃-烷基。本發(fā)明中的雜芳基烷基的實例包括吡啶基乙基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基烷基”是指被如上定義的雜環(huán)基取代的如上定義的烷基。更優(yōu)選的雜環(huán)基烷基是5或6元雜環(huán)基-C₁-C₃-烷基。本發(fā)明中的雜環(huán)基烷基的實例包括四氫吡喃基甲基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”意指在制藥上可接受的并且具有母體化合物的所需藥理學(xué)活性的本發(fā)明化合物的鹽。這類鹽包括：與 無機酸或與有機酸形成的酸加成的鹽，所述的無機酸諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有機酸諸如乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟腦磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母體化合物上存在的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子或堿土金屬離子取代時形成的鹽；或與有機堿形成的配位化合物，所述的有機堿諸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“溶劑化物”意指本發(fā)明化合物與制藥上可接受的溶劑結(jié)合形成的物質(zhì)。制藥上可接受的溶劑包括水，乙醇，乙酸等。溶劑化物包括化學(xué)計算量的溶劑合物和非化學(xué)計算量的溶劑合物，優(yōu)選為水合物。本發(fā)明的化合物可以用水或各種有機溶劑結(jié)晶或重結(jié)晶，在這種情況下，可能形成各種溶劑化物。

本發(fā)明的藥物組合物包括有效劑量的本發(fā)明式式I化合物或其異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽或水合物和一種或多種適宜的藥學(xué)上可接受的載體。這里的藥用載體包括但不限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，羊毛脂。

本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用：口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。

當(dāng)口服用藥時，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。如果需要，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。

當(dāng)局部用藥時，特別是治療局部外敷容易達到的患面或器官，如眼睛、皮膚或下腸道神經(jīng)性疾病時，可根據(jù)不同的患面或器官將本發(fā)明化合物制成不同的局部用藥制劑形式，具體說明如下：

當(dāng)眼部局部施用時，本發(fā)明化合物可配制成一種微粉化懸浮液或溶液的制劑形式，所使用載體為等滲的一定pH的無菌鹽水，其中可加入也可不加防腐劑如氯化芐基烷醇鹽。對于眼用，也可將化合物制成膏劑形式如凡士林膏。

當(dāng)皮膚局部施用時，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)能浉唷⑾磩┗蛩獎┲苿┬问?，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于：礦物油，液體凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蠟和水；洗劑或霜劑可使用的載體包括但不限于：礦物油，脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，吐溫60，十六烷酯蠟，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，芐醇和水。

本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。

具體實施方式

下面的具體實施例是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其不應(yīng)理解為對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

化合物的熔點由RY-1熔點儀測定，溫度計未較正。質(zhì)譜由Micromass ZabSpec高分辨率質(zhì)譜儀(分辨率1000)測定。¹H NMR由JNM-ECA-400超導(dǎo)NMR儀測定，工作頻率¹H NMR 400MHz，¹³C NMR 100MHz。

實施例

實施例1 1-[3-(叔丁基)-1-(對甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

在250mL茄型瓶中加入100mL乙醇，(30mmol)特戊酰基乙腈，(33.63mmol)4-甲基苯肼，攪拌下滴加3.6mL濃鹽酸，加熱回流8小時，冷卻，濃縮，殘余物用稀氫氧化鈉調(diào)pH 10-11，用乙酸乙酯提取三次，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到的固體用乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶得到白色晶體C，收率80.3％。5-叔丁基-2-對甲基苯基-3-氨基吡唑(3.5mmolC)置于100ml三頸瓶中，以30ml四氫呋喃溶解，將三頸瓶置于低溫槽降溫至-20℃，攪拌下分批加入2.9g碳酸氫鈉，15min后，逐滴滴加氯甲酸三氯乙酯(3.5mmol)，控制溶液溫度不超過0℃，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30min，然后升溫至0℃反應(yīng)12h.反應(yīng)完畢，混合物過濾，濾渣用乙酸乙酯沖洗，濾液濃縮，收率85％。

在500ml三口瓶中加入16.2g(100mmol)6-羥基1，2，3，4四氫萘酮，200ml DMSO溶解，41.4g碳酸鉀(300mmol)，升溫90℃，滴加鄰氰基氟苯13.3g(110mmol)入反應(yīng)，反應(yīng)2小時，反應(yīng)液倒入冰水中，析出淡黃色固體，抽濾干燥，產(chǎn)率80％。在100ml三口瓶中加入40ml無水四氫呋喃，加入1.14g氫化鋁鋰室溫攪拌10分鐘，向反應(yīng)液中緩慢加入2-[(5，6，7，8四氫萘酮-2基)氧基]苯腈2.63g，升溫65℃，回流反應(yīng)1小時，反應(yīng)畢，混合液中加入乙醇至無氣泡產(chǎn)生，過濾，濃縮，以柱層析分離產(chǎn)物，產(chǎn)率73％。

在50mL三口瓶中加入20mL二甲亞砜，加入化合物0.5mmol2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基)酰胺，再加入中間體K 0.5mmol，滴加0.5ml三乙胺入反應(yīng)，加熱80℃反應(yīng)1小時。冷卻，倒入150ml水中，用乙酸乙酯提取3次，有機層用飽和氯化鈉洗滌3次，無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮，柱層析分離產(chǎn)物N，產(chǎn)率58％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.25(s，1H)，7.38(m，2H)，7.35(m，2H)，7.11(m，3H)，7.15(m，1H)，6.91(t，1H)，6.86(m，1H)，6.74(m，1H)，6.61(d，1H)，6.24(s，1H)，5.09(d，1H)，4.54(s，1H)，4.28(d，2H)，2.65(m，2H)，2.37(s，3H)，1.87(m，2H)，1.63(m，2H)，1.29(s，9H).¹³C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：160.90(1C，pyrazole)，155.98(1C，CO)，154.86(1C，pyrazole)，154.46，138.95，138.25，137.01，136.74，135.88，131.25，130.68，130.09，129.34，128.92，124.71，124.12，119.16，117.60，115.96(18C，Ar-C)，95.77(1C，pyrazole)，66.41(1C，HO-C)，38.25(1C，N-CH₂)，32.67(1C，CH₂)，32.34(1C，C)，30.61(3C，CH₃)，29.15(1C，CH₂)，20.91(1C，Ar-CH₃)，19.00(1C，CH₂).ESI-MS(+Q，m/z)：525[M+H]+，547 [M+Na]+.

實施例2 1-[3-(叔丁基)-1-(對硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為對硝基苯肼，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.59(s，1H)，8.33(d，2H)，7.83(d，2H)，7.38(d，1H)，7.25(m，2H)，7.09(t，1H)，6.96(t，1H)，6.81(d，1H)，6.74(m，1H)，6.61(d，1H)，6.33(s，1H)，5.08(d，1H)，4.53(s，1H)，4.24(d，2H)，2.64(m，2H)，1.87(m，2H)，1.63(m，2H)，1.27(s，9H).¹³C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：162.87(1C，pyrazole)，155.92(1C，CO)，155.10(1C，pyrazole)，154.42，145.32，144.75，139.07，138.95，135.90，131.17，130.68，129.23，128.92，125.28，124.02，123.58，119.14，117.60，115.98(18C，Ar-C)，99.10(1C，pyrazole)，66.40(1C，HO-C)，38.65(1C，N-CH₂)，32.83(1C，CH₂)，32.70(1C，C)，30.45(3C，CH₃)，29.52(1C，CH₂)，19.39(1C，CH₂).ESI-MS(+Q，m/z)：556[M+H]+，578[M+Na]+.

實施例3 1-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為苯肼鹽酸鹽，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.31(s，1H)，7.49(m，4H)，7.39(m，2H)，7.26(m，2H)，7.11(m，1H)，6.92(t，1H)，6.83(d，1H)，6.72(m，1H)，6.61(d，1H)，6.26(s，1H)，5.08(d，1H)，4.53(s，1H)，4.24(d，2H)，2.64(m，2H)，1.87(m，2H)，1.67(m，2H)，1.25(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：160.70(1C，pyrazole)，155.49(1C，CO)，154.48(1C，pyrazole)，153.93，138.75，138.48，137.78，135.39，130.78，130.21，129.20，128.80，128.43，127.06，124.16，123.69，118.71，117.11，115.47(18C，Ar-C)，95.65(1C，pyrazole)，65.92(1C，HO-C)，38.10(1C，N-CH2)，32.36(1C，CH2)，32.04(1C，C)，30.23(3C，CH3)，29.03(1C，CH2)，18.90(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：511[M+H]+，533[M+Na]+.

實施例4 1-[3-(叔丁基)-1-(對硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為對硝基苯肼鹽酸鹽，2-氰基氟苯改為2-氰基-4-氟氟苯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.59(s，1H)，8.33(d，2H)，7.83(d，2H)，7.38(d，1H)，7.25(m，1H)，7.09(t，1H)，6.96(t，1H)，6.81(d，1H)，6.72(m，1H)，6.61(d，1H)，6.31(s，1H)，5.05(d，1H)，4.53(s，1H)，4.23(d，2H)，2.64(m，2H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.25(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：162.38(1C，pyrazole)，159.57(1C，CO)，157.19(1C，pyrazole)，155.78，154.81，149.45，144.87，144.30，138.52，138.37，135.30，133.75，130.25，124.75，123.02，121.03，116.48，114.88，114.55(18C，Ar-C)，99.35(1C，pyrazole)，65.89(1C，HO-C)，37.97(1C，N-CH2)，32.36(1C，CH2)，32.23(1C，C)，29.96(3C，CH3)，29.05(1C，CH2)，18.90(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：574[M+H]+，596[M+Na]+.

實施例5 1-[3-(叔丁基)-1-(對甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

采用實施例1的方法，將其中的2-氰基氟苯改為2-氰基-4-氟氟苯，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.29(s，1H)，7.37(d，2H)，7.35(d，2H)，7.11(m，2H)，6.95(t，1H)，6.86(m，1H)，6.98(m，1H)，6.70(m，1H)，6.58(d，1H)，6.23(s，1H)，5.07(d，2H)，4.52(s，1H)，4.18(d，2H)，2.61(m，2H)，2.35(s，3H)，1.84(m，2H)，1.63(m，2H)，1.21(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：160.43(1C，pyrazole)，159.61(1C，CO)，157.23(1C，pyrazole)，155.80，154.56，149.57，138.52，137.55，136.54，136.33，135.32，133.81，130.25，129.58，124.11，121.04，116.54，114.91，114.59(18C，Ar-C)，95.77(1C，pyrazole)，65.91(1C，HO-C)，37.95(1C，N-CH₂)，32.37(1C，CH2)，32.04(1C，C)，30.27(3C，CH3)，29.05(1C，CH₂)，20.65(1C，Ar-CH₃)，18.90(1C，CH₂).ESI-MS(+Q，m/z)：543[M+H]+，565[M+Na]+.

實施例6 1-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}-3-(3-異丙基苯基)脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為3-異丙基苯胺，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.57(s，1H)，7.37(d，2H)，7.26(m，2H)，7.12(m，3H)，6.85(d，1H)，6.76(m，2H)，6.66(d，1H)，6.48(t，1H)，5.10(d，1H)，4.53(s，1H)，4.28(d，2H)，2.81(m，1 H)，2.64(m，2H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.15(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：155.56(1C，CO)，155.29，154.03，148.94，140.48，138.55，135.46，131.19，130.24，128.88，128.61，128.40，123.73，119.29，118.74，117.17，115.70，115.51，115.36(18C，Ar-C)，65.99(1C，HO-C)，38.02(1C，N-CH2)，33.61(1C，CH2)，32.43(1C，C)，29.09(1C，CH2)，23.94(2C，CH3)，18.95(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：431[M+H]+，453[M+Na]+.

實施例7 1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-{2-[(5-羥基-5，6，7，8-四氫萘-2-基)氧基]芐基}脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為3-三氟甲基-4-氯苯胺，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：9.15(s，1H)，8.07(d，2H)，7.56(m，2H)，7.38(m，2H)，7.25(m，1H)，7.13(m，1H)，6.86(m，1H)，6.76(m，2H)，6.65(d，2H)，5.10(d，1H)，4.53(s，1H)，4.31(d，2H)，2.68(m，2H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H).13CN MR(100MHz，DMSOed6)，δ：155.49(1C，CO)，154.92，153.97，140.08，138.48，135.39，131.87，130.78，130.23，128.80，128.45，123.70，122.31，121.55，118.73，117.11，116.17，116.11，115.47(18C，Ar-C)，65.92(1C，HO-C)，38.05( 1C，N-CH₂)，32.36(1C，CH₂)，29.25(1C，CH₂)，18.90(1C，CH₂).ESI-MS(+Q，m/z)：491[M+H]+，513[M+Na]+.

實施例8 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

采用實施例1的方法，將其中的6-羥基1，2，3，4四氫萘酮改為6羥基喹啉得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.82(m，1H)，8.25(s，1H)，8.22(s，1H)，8.05(d，1H)，7.49(m，2H)，7.33(m，4H)，7.24(m，4H)，7.02(d，1H)，6.93(t，1H)，6.20(d，1H)，4.28(d，2H)，2.35(s，3H)，1.20(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：506[M+H]+，528[M+Na]+.

實施例9 1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為苯肼鹽酸鹽，將其中的6-羥基1，2，3，4四氫萘酮改為6羥基喹啉得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.81(m，1H)，8.28(s，1H)，8.23(d，1H)，8.04(d，1H)，7.50(m，6H)，7.33(m，3H)，7.26(m，2H)，7.01(d，1H)，6.94(t，1H)，6.21(d，1H)，4.26(d，2H)，1.20(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：492[M+H]+，514[M+Na]+.

實施例10 1-[3-(叔丁基)-1-對硝基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為對硝基苯肼鹽酸鹽，將其中的6-羥基1，2，3，4四氫萘酮改為6羥基喹啉，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.81(m，1H)，8.55(s，1H)，8.28(d，2H)，8.24(d，1H)，8.05(d，1H)，7.81(d，2H)，7.49(m，2H)，7.37(m，2H)，7.27(d，1H)，7.20(t，1H)，7.00(m，2H)，6.27(s，1H)，4.26(d，2H)，1.20(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：537[M+H]+，559[M+Na]+.

實施例11 1-[3-(叔丁基)-1-對硝基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為對硝基苯肼鹽酸鹽，2-氰基氟苯改為2-氰基-4-氟氟苯，將其中的6-羥基1，2，3，4四氫萘酮改為6羥基喹啉，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.81(m，1H)，8.62(s，1H)，8.32(d，2H)，8.24(d，1H)，8.03(d，1H)，7.81(d，2H)，7.48(m，2H)，7.37(m，2H)，7.20(t，1H)，7.00(m，2H)，6.27(s，1H)，4.22(d，2H)，1.26(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：555[M+H]+，577[M+Na]+.

實施例12 1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

采用實施例1的方法，將其中的對甲基苯肼改為苯肼鹽酸鹽，2-氰基氟苯改為2-氰基-4-氟氟苯，將其中的6-羥基1，2，3，4四氫萘酮改為6羥基喹啉，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.80(m，1H)，8.32(s，1H)，8.22(d，1H)，8.04(d，1H)，7.48(m，6H)，7.45(m ，1H)，7.22(m，4H)，6.98(t，1H)，6.21(s，1H)，4.22(d，2H)，1.24(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：510[M+H]+，532[M+Na]+.

實施例13 1-[3-(叔丁基)-1-對甲基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)芐基]脲

采用實施例1的方法，將其中的2-氰基氟苯改為2-氰基-4-氟氟苯，將其中的6-羥基1，2，3，4四氫萘酮改為6羥基喹啉，得白色固體。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

δ：8.80(m，1H)，8.26(s，1H)，8.22(d，1H)，8.03(d，1H)，7.50(m，2H)，7.34(d，2H)，7.24(m，3H)，7.13(m，3H)，6.97(t，1H)，6.19(s.1H)，4.22(d，2H)，2.34(s，3H)，1.24(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：524[M+H]+，546[M+Na]+.

實施例14 采用GFP-MAPKAPk2_BHK細胞模型篩選p38-MAPK抑制劑

實驗材料與方法

儀器：IN Cell Analyzer 1000活細胞成像系統(tǒng)(美國GE公司)

細胞株：表達GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK細胞株(美國GE公司)

細胞培養(yǎng)液：含1mg/ml G418和10％FBS的F12培養(yǎng)液

分析培養(yǎng)液：含10mM HEPES、0.2％BSA的F12培養(yǎng)液

固定液：12％甲醛溶液(PBS配，3×)

染色液：含1μM Hoechst 33342(美國Invitrogen公司)的PBS

化合物的配制：

激動劑Anisomycin用DMSO配成10mM母液，用分析培養(yǎng)液配成300nM工作液。

化合物用DMSO配成30mM母液，用激動劑即300nM Anisomycin配成1×工作液，初篩選用0.3μM、3μM和10μM三個終濃度，復(fù)篩根據(jù)化合物活性按梯度分別選用終濃度0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM中的連續(xù)七個濃度做量效關(guān)系。陽性化合物MOL-p38-001選用終濃度0.3μM和3μM作為對照，在復(fù)篩時同時做量效關(guān)系。

以含終濃度0.3‰DMSO的分析培養(yǎng)液作為Control對照，以含終濃度0.3‰DMSO的300nM Anisomycin作為激動劑對照。

實驗步驟：

將穩(wěn)定表達GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK細胞，37℃5％CO2培養(yǎng)于含1mg/ml G418和10％FBS的F12培養(yǎng)液中。按照細胞2.0×104個/100μl/孔種于96孔黑色底透細胞培養(yǎng)板中，37℃5％CO2培養(yǎng)18-24h。配制激動劑和化合物工作液。細胞用100μl/孔分析培養(yǎng)液洗一次，加入100μl/孔化合物工作液，實驗設(shè)Control對照和激動劑對照，化合物每個濃度平行重復(fù)3孔。細胞37℃5％CO2孵育90min，加入室溫預(yù)暖的3×固定液50μl/孔混勻，室溫孵育20min。細胞用染色液200μl/孔洗三次，并留在200μl/孔染色液中室溫染色1hr。細胞在IN Cell Analyzer 1000活細胞成像系統(tǒng)上進行測定。測定條件為：20倍物鏡，激發(fā)波長Ex＝460nm，發(fā)射波長Em＝535nm，曝光300ms檢測細胞核通道藍色熒光；激發(fā)波長Ex＝475nm，發(fā)射波長Em＝535nm，曝光1000ms檢測細胞質(zhì)通道綠色熒光GFP，每孔5個視野連續(xù)拍照。使用GE公司IN Cell Analyzer 1000Nuclear Trafficking Analysis Module軟件分析細胞核轉(zhuǎn)位，計算化合物抑制核轉(zhuǎn)位的活性。

化合物抑制率(％)＝(化合物處理細胞核轉(zhuǎn)位-激動劑處理細胞核轉(zhuǎn)位)/(Control對照處理細胞核轉(zhuǎn)位-激動劑處理細胞核轉(zhuǎn)位)×100％

實施例15 在脂多糖誘導(dǎo)的外周血單核細胞TNF-α檢測實驗中進行藥物篩選

新鮮血液收集和PBMC分離

1.采血員聯(lián)系志愿者，采集足夠新鮮血液儲存于肝素鈉采血管中。

2.轉(zhuǎn)移DPBS對比稀釋的血液至加有15ml Lymphoprep分離液的SepMate分離管中，

3.常溫1200g離心30分鐘，無剎車停止離心。

4.吸出白膜層(包含PBMC)，DPBS洗兩次。

5.用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基重懸PBMC，細胞計數(shù)。

LPS誘導(dǎo)的TNF-α釋放實驗

1.PBMC鋪板每孔8萬個細胞，按計劃加稀釋過的化合物，37度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一小時。

2.加LPS刺激細胞。終濃度為10ng/ml。37度細胞培養(yǎng)箱孵育過夜。

3.離心取上清，按照TNF-αELISA試劑盒步驟檢測細胞上清中的TNF-α含量。

4.FlexStation3讀取吸光度，導(dǎo)出數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計計算IC₅₀。

實施例40 藥物對p38α酶的抑制實驗篩選化合物

1.準備濃度為500ng/ml的p38α緩沖液。

2.利用濃度為500ng/ml激酶緩沖溶液連續(xù)2倍稀釋，稀釋16個點。

3.取5uL稀釋過的p38α緩沖溶液加入384孔板中。

4.準備0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。

5.在每個空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出發(fā)反應(yīng)。

6.密封室溫培養(yǎng)1小時。

7.準備ATF-2抗體1ml。

8.向每個孔中加入10ul的抗體，混合均勻。

9.密封，室溫培養(yǎng)30分鐘。

10.在儀器上讀取TR-FRET信號。

11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每個孔3倍稀釋，11個濃度，2次重復(fù)(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。

12.加入4uL p38α到每個孔中。

13.室溫培養(yǎng)15分鐘。

14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激發(fā)反應(yīng)。

15.室溫培養(yǎng)1小時。

16.每個孔加入10uL抗體。

17.室溫培養(yǎng)30分鐘。

18.儀器上讀取TR-FRET信號，計算IC₅₀值。

實施例41 化合物對p38α/β/γ/δ酶的選擇性抑制實驗

1.準備濃度為500ng/ml的p38α/β/γ/δ緩沖液。

2.利用濃度為500ng/ml激酶緩沖溶液連續(xù)2倍稀釋，稀釋16個點。

3.取5uL稀釋過的p38α緩沖溶液加入384孔板中。

4.準備0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。

5.在每個空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出發(fā)反應(yīng)。

6.密封室溫培養(yǎng)1小時。

7.準備ATF-2抗體1ml。

8.向每個孔中加入10ul的抗體，混合均勻。

9.密封，室溫培養(yǎng)30分鐘。

10.在儀器上讀取TR-FRET信號。

11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每個孔3倍稀釋，11個濃度，2次重復(fù)(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。

12.加入4uL p38α到每個孔中。

13.室溫培養(yǎng)15分鐘。

14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激發(fā)反應(yīng)。

15.室溫培養(yǎng)1小時。

16.每個孔加入10uL抗體。

17.室溫培養(yǎng)30分鐘。

18.儀器上讀取TR-FRET信號，計算IC₅₀值。