本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及氯化二亞苯基碘鎓用于制備細(xì)菌感染治療藥物的用途。

背景技術(shù)：

感染性疾病是指病原微生物入侵機(jī)體并在局部或全身大量繁殖所引發(fā)的器質(zhì)性或功能性損害，是導(dǎo)致臨床患者死亡的主要因素之一。細(xì)菌是最為常見的病原微生物，細(xì)菌進(jìn)入機(jī)體中，一方面通過侵襲定植或釋放毒素等形式直接造成組織臟器損傷，另一方面細(xì)菌的菌體成分還可刺激機(jī)體炎癥細(xì)胞活化，誘導(dǎo)tnf-α、il-1、il-6和hmgb-1等炎癥介質(zhì)的大量釋放，進(jìn)而引發(fā)失控性炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致機(jī)體多器官、多系統(tǒng)的損傷和功能紊亂。最終導(dǎo)致患者死亡。

抵御細(xì)菌感染主要依賴于外源性的抗菌藥物和機(jī)體自身的免疫防御功能?？股氐膽?yīng)用和更新發(fā)展曾一度使得細(xì)菌性疾病得到有效的控制，但由于細(xì)菌耐藥性的增加以及多重耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn)，以抗生素為代表的抗菌藥物的研發(fā)和應(yīng)用已陷入困境。在此情況下，從提高機(jī)體自身免疫防御的角度出發(fā)，積極尋找新型抗菌藥物，對于拓寬細(xì)菌感染、特別是耐藥菌感染的解決措施就具有重要的意義。

機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)是應(yīng)對病原體入侵的第一道免疫防線。天然免疫細(xì)胞的吞噬效應(yīng)對其發(fā)揮抗菌防御功能至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞因廣泛分布于皮膚以及各組織臟器中，因而在天然免疫細(xì)胞中最先感知和抵御病原體入侵。研究表明，巨噬細(xì)胞通過直接吞噬作用，經(jīng)內(nèi)體-溶酶體途徑介導(dǎo)對病原體的降解清除。吞噬作用也可與細(xì)胞自噬作用結(jié)合，加快巨噬細(xì)胞內(nèi)體的酸化成熟及其與溶酶體的結(jié)合，提高對酵母真菌等的處理能力。另一方面，巨噬細(xì)胞吞噬病原體后，也可經(jīng)抗原提呈作用活化特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)一步加強(qiáng)對病原體的清除作用?；谏鲜稣J(rèn)識，巨噬細(xì)胞的吞噬能力對于機(jī)體抗菌免疫防御非常重要，基于調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬能力的策略有望為尋找感染性疾病的新型藥物靶點(diǎn)提供新思路。

氯化二亞苯基碘鎓（diphenyleneiodoniumchloride,dpi）屬于聯(lián)苯碘類化合物，最早發(fā)現(xiàn)其具有抑制糖異生的效應(yīng)，可導(dǎo)致血糖降低。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該化合物的藥理作用主要與其抑制nadph氧化酶的活性，進(jìn)而抑制呼吸鏈有關(guān)。研究表明，氯化二亞苯基碘鎓可能通過與nadph氧化酶的黃素基團(tuán)發(fā)生相互作用而抑制相應(yīng)電子轉(zhuǎn)運(yùn)體，從而抑制電子傳遞和ros產(chǎn)生，上述作用機(jī)制也是目前該化合物的公認(rèn)藥理機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氯化二亞苯基碘鎓在制備治療細(xì)菌感染藥物中的用途，該藥物可上調(diào)天然免疫細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬活性，抑制細(xì)菌感染所致的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對細(xì)菌的抵抗能力。其特點(diǎn)是通過增加機(jī)體天然免疫細(xì)胞的吞噬能力實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的吞噬和殺傷，是一種在預(yù)防及治療細(xì)菌感染性疾病的新型的抗菌藥物。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

氯化二亞苯基碘鎓在制備治療細(xì)菌感染藥物中的用途。

所述的細(xì)菌為革蘭陽性細(xì)菌或革蘭陰性細(xì)菌。

所述藥物用于增加機(jī)體天然免疫細(xì)胞的吞噬能力。

所述天然免疫細(xì)胞為單核巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。

所述氯化二亞苯基碘鎓為碘鎓鹽類化合物，其分子量為314.55，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為c12h8cli。分子結(jié)構(gòu)如下：

所述藥物按照每公斤體重0.1-1mg給藥，每天1次，給藥方式為靜脈注射。

申請人對氯化二亞苯基碘鎓的促吞噬和抗菌、抗炎活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)氯化二亞苯基碘鎓可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的吞噬作用，抑制細(xì)菌感染所致的炎癥反應(yīng)損傷，提高細(xì)菌感染小鼠模型的存活率。因此，該化合物可通過增強(qiáng)機(jī)體自身細(xì)胞的吞噬能力從而實(shí)現(xiàn)抗感染作用，并為其可能作為抗感染藥物應(yīng)用到臨床奠定基礎(chǔ)。

申請人對氯化二亞苯基碘鎓的體外促吞噬作用進(jìn)行了藥理學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)表明，其可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，且該作用與其促進(jìn)鈣離子內(nèi)流、上調(diào)肌動蛋白的活性有關(guān)；同時，氯化二亞苯基碘鎓可在體內(nèi)外抑制細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，降低小鼠組織細(xì)菌計(jì)數(shù)，提高存活率。申請人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，氯化二亞苯基碘鎓介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌活性與其對nadph氧化酶和ros的抑制效應(yīng)無關(guān)，因此是一種新穎的藥理作用。

本發(fā)明所述藥物并非直接針對細(xì)菌，而是通過誘導(dǎo)或增強(qiáng)機(jī)體的自噬效應(yīng)而實(shí)現(xiàn)，故對細(xì)菌的殺傷效應(yīng)具有廣譜性的特點(diǎn)，特別是對耐藥細(xì)菌也具有良好的殺菌活性，可用于預(yù)防、治療細(xì)菌感染性疾病相關(guān)藥物的開發(fā)。

附圖說明

圖1為氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌效應(yīng)的影響，圖中，ec：大腸埃希菌；sa：金黃色葡萄球菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01；

圖2為氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌作用的時效和量效關(guān)系測定,圖中，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓；其中圖2a表示不同濃度的氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響。圖2b表示氯化二亞苯基碘鎓作用不同時間后對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響；

圖3為氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌作用的特異性檢測，圖中，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01。其中圖3a表示細(xì)胞色素d對氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響，3b表示溫度對氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響；

圖4為三種nadph氧化酶抑制劑對大腸埃希菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生以及對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響，圖中，nc：陰性對照；ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓；va：vas2870；eb：ebselen，**：p<0.01。其中圖4a表示三種nadph氧化酶抑制劑氯化二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對大腸埃希菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響，4b表示氯化二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響。

圖5為氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的抑制活性檢測，圖中，nc：陰性對照，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01。其中圖5a表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞tnf-a，il-6mrna表達(dá)的影響，5b表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞隨時間變化釋放tnf-a，il-6的影響；

圖6為氯化二亞苯基碘鎓介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流和肌動蛋白聚集，進(jìn)而上調(diào)巨噬細(xì)胞吞噬活性的作用檢測。圖中，m：未處理對照組，ec：大腸埃希菌，dpi：氯化二亞苯基碘鎓，egta和bapta：鈣離子螯合劑，**：p<0.01。其中圖6a表示氯化二亞苯基碘鎓對巨噬細(xì)胞胞漿鈣離子水平的影響，圖6b表示鈣離子螯合劑對氯化二亞苯基碘鎓介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響，圖6c表示氯化二亞苯基碘鎓對肌動蛋白聚合能力的影響。

圖7為氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠組織菌計(jì)數(shù)、炎癥介質(zhì)水平和生存率的影響，圖中，ns：生理鹽水；ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，*：p<0.05，**：p<0.01。其中圖7a表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠存活率的影響，7b表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠后肺組織（左）以及腹腔液和腹腔巨噬細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)菌加載量（右）的影響，圖7c和7d表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠后肺、脾、肝組織以及血清中tnf-α和il-6產(chǎn)生的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述試劑和儀器如下：

試劑：氯化二亞苯基碘鎓、vas2870、ebselen、皂苷、egta、bapta、dcfh-da購于sigm-aldrich公司；

細(xì)胞色素d購于selleck公司；

f-actin染色試劑盒購于abcam公司；

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物制品收藏中心（atcc）；

細(xì)胞培養(yǎng)基dmem購于lifetechnologies公司；

用于配制lb液體培養(yǎng)基的酵母提取物和胰蛋白胨購于oxoid公司；

氯化鈉購于成都科隆化學(xué)品有限公司；

dmso購于biosharp公司；

抗生素頭孢美唑鈉購于重慶藥友制藥有限公司；

tnf-α和il-6檢測試劑盒購于ebioscience公司；

rna提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒和rt-pcr試劑盒購于toyobo公司；

tnf-α和il-6引物由上海生工生物工程有限公司合成。

儀器：多功能讀數(shù)儀器（thermovarioskanflash），酶標(biāo)儀（伯樂smartspecplus），細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)儀（迅數(shù)菌落計(jì)數(shù)儀），實(shí)時熒光定量pcr儀（伯樂cfx96real-timesystem），二氧化碳培養(yǎng)箱（thermo3111型），恒溫孵箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司dnp-9162型），超凈工作臺（蘇凈vs-1300l-u型）。

實(shí)施例1：氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌效應(yīng)的影響

1.1實(shí)驗(yàn)方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞接種至24孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為5×10⁵/ml，1ml/孔。挑取種植于營養(yǎng)瓊脂平板上的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌株的單個菌落，轉(zhuǎn)入lb培養(yǎng)基中增菌至對數(shù)生長期（od600約為0.5-0.8），調(diào)整菌液濃度為5×10⁷cfu/ml，取10μl加入預(yù)先接種小鼠巨噬細(xì)胞的24孔板中，同時加入氯化二亞苯基碘鎓10μm，以加入同等體積dmso作為對照組，37℃，5%co2培養(yǎng)1h，加入抗生素殺滅胞外細(xì)菌后移除培養(yǎng)上清，細(xì)胞用200μl0.3%皂苷裂解，裂解液稀釋10倍后取100μl涂布營養(yǎng)瓊脂板上，37℃孵育12h，菌落計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)。吞噬指數(shù)=胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)/加樣總細(xì)菌數(shù)。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖1結(jié)果可知，氯化二亞苯基碘鎓處理細(xì)胞后其吞噬指數(shù)顯著增加，表明氯化二亞苯基碘鎓可有效促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的吞噬作用。

實(shí)施例2：氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌作用的時效和量效關(guān)系測定

2.1實(shí)驗(yàn)方法：采用不同濃度（0.625，1.25，2.5，5，10μm）的氯化二亞苯基碘鎓處理小鼠巨噬細(xì)胞，或采用同一濃度（10μm）氯化二亞苯基碘鎓分別作用不同時間（0.5，1，1.5，2，2.5h）后，檢測氯化二亞苯基碘鎓對細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的吞噬指數(shù)，具體操作方法同1.1。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖2a結(jié)果可知，隨著氯化二亞苯基碘鎓濃度的增加，其吞噬指數(shù)不斷升高。同時由圖2b結(jié)果可知，隨著氯化二亞苯基碘鎓作用時間的延長，其吞噬指數(shù)也不斷升高。以上結(jié)果表明氯化二亞苯基碘鎓成劑量依賴性和時間依賴性方式促進(jìn)細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬。

實(shí)施例3：氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌作用的特異性檢測

3.1實(shí)驗(yàn)方法：巨噬細(xì)胞的接種和細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.1，加入氯化二亞苯基碘鎓（10μm）或同時加入細(xì)胞色素d（2.5μm）處理，按照1.1方法檢測細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬指數(shù)。同時將細(xì)胞分別置于4℃或37℃環(huán)境下，加入氯化二亞苯基碘鎓處理后，檢測細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬指數(shù)。

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖3a結(jié)果可知，細(xì)胞色素d是公認(rèn)的細(xì)胞吞噬抑制劑，氯化二亞苯基碘鎓處理細(xì)胞后可顯著增加細(xì)胞對細(xì)菌的攝取能力，同時加入細(xì)胞色素d處理后相對于單獨(dú)氯化二亞苯基碘鎓組其細(xì)胞對細(xì)菌的攝取能力顯著降低，表明氯化二亞苯基碘鎓促進(jìn)細(xì)胞對細(xì)菌的攝取能力是通過促進(jìn)其吞噬能力實(shí)現(xiàn)的。由圖3b結(jié)果可知，低溫可降低細(xì)胞的吞噬能力，正常未處理細(xì)胞置于4℃時比37℃時的吞噬能力顯著降低，加入氯化二亞苯基碘鎓處理后置于4℃時同樣比37℃時的細(xì)胞攝取細(xì)菌的能力顯著降低。以上結(jié)果表明氯化二亞苯基碘鎓可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)對細(xì)菌的攝取和清除。

實(shí)施例4：三種nadph氧化酶抑制劑對大腸埃希菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生以及對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的影響

4.1實(shí)驗(yàn)方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞接種至24孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為5×10⁵/ml，1ml/孔。按照1.1方法加入大腸埃希菌，同時分別加入二亞苯基碘鎓、vas2870和ebselen三種nadph氧化酶抑制劑各10μm作用小鼠巨噬細(xì)胞，以加入同等體積dmso作為對照組，37℃，5%co2培養(yǎng)1h，加入活性氧熒光探針dcfh-da，37℃，5%co2繼續(xù)孵育20min，更換培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡檢測胞內(nèi)活性氧探針熒光強(qiáng)度。同時檢測二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的吞噬指數(shù)，具體操作方法同1.1。

4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖4a結(jié)果可知，大腸埃希菌可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平升高，加入三種nadph氧化酶抑制劑后其活性氧水平均顯著降低，表明二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen可有效抑制大腸埃希菌誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。由圖4b結(jié)果可知，二亞苯基碘鎓可顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞對大腸埃希菌的吞噬作用，另兩種nadph氧化酶抑制劑vas2870和ebselen對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌無促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，二亞苯基碘鎓促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用與其對nadph氧化酶的抑制無關(guān)。

實(shí)施例5：氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的抑制活性檢測

5.1實(shí)驗(yàn)方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞接種至96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為5×10⁵/ml，200μl/孔。大腸埃希菌按照1.1方法培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度為5×10⁷cfu/ml加樣。取氯化二亞苯基碘鎓（10μm）和細(xì)菌（5×10⁵cfu/ml）加入預(yù)先接種的細(xì)胞，37℃，5%co2孵育2-10h，分別取上清稀釋后檢測tnf-α和il-6。取培養(yǎng)4h細(xì)胞提取rna，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行rt-pcr，檢測tnf-α和il-6mrna水平的表達(dá)情況。

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖5a結(jié)果可知，大腸埃希菌感染后，小鼠巨噬細(xì)胞tnf-α和il-6mrna表達(dá)顯著上調(diào)，而加入氯化二亞苯基碘鎓處理可顯著降低tnf-α和il-6mrna水平。同時由圖5b結(jié)果可知，對上清tnf-α和il-6的檢測發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌加入后2-10h可觀察到tnf-α和il-6持續(xù)釋放，而氯化二亞苯基碘鎓處理組以時間依賴的方式明顯抑制tnf-α和il-6的釋放。

實(shí)施例6：氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細(xì)胞胞漿鈣離子水平和肌動蛋白聚合的影響

6.1實(shí)驗(yàn)方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿或24孔孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為5×10⁵/ml。大腸埃希菌按照1.1方法培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度為5×cfu/ml，取氯化二亞苯基碘鎓（10μm）和大腸埃希菌（5×10⁵cfu/ml）加入預(yù)先接種在共聚焦培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，37℃，5%co2孵育30min，共聚焦培養(yǎng)皿中加入鈣離子探針fluo4-am，37℃，5%co2孵育20min，pbs洗滌后激光共聚焦顯微鏡檢測胞內(nèi)鈣離子情況。同時將共聚焦培養(yǎng)皿的細(xì)胞用多聚甲醛固定后，使用鬼筆環(huán)肽對肌動蛋白f-actin染色，用dapi對細(xì)胞核染色后進(jìn)行激光共聚焦檢測，觀察f-actin聚合情況。24孔板加入大腸埃希菌（5×10⁵cfu/ml）和氯化二亞苯基碘鎓（10μm）或同時加入鈣離子螯合劑egta(5mm)或bapta(10μm)，按照1.1方法進(jìn)行吞噬指數(shù)檢測。

6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖6a結(jié)果可知，大腸埃希菌可誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子較少的增加，加入二亞苯基碘鎓處理后，其胞內(nèi)鈣離子進(jìn)一步增加。由圖6b對吞噬指數(shù)檢測結(jié)果顯示，氯化二亞苯基碘鎓可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬作用，然而同時加入鈣離子螯合劑egta或bapta其吞噬作用受到顯著抑制。由圖6c中f-actin的熒光染色結(jié)果顯示，不加試劑對照組沒有觀察到f-actin的明顯聚集，然而二亞苯基碘鎓處理組可顯著促進(jìn)f-actin在膜上的聚集。以上結(jié)果顯示，二亞苯基碘鎓可通過促進(jìn)胞內(nèi)鈣離子增加誘導(dǎo)f-actin聚合，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬作用。

實(shí)施例7：氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠組織菌計(jì)數(shù)、炎癥介質(zhì)水平和生存率的影響

7.1實(shí)驗(yàn)方法：6-8周的野生型balb/c小鼠腹腔注射生理鹽水或大腸埃希菌（1×10⁸cfu/kg)，同時注射氯化二亞苯基碘鎓(1mm/kg)或等體積生理鹽水，觀察72h的存活率（n=10）。注射6h后將小鼠麻醉，用生理鹽水對腹腔進(jìn)行灌洗，收集灌洗液，1000rpm離心，取上清涂布營養(yǎng)瓊脂板上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，上清加入抗生素殺滅胞外細(xì)菌后，去除上清，細(xì)胞沉淀用0.3%saponin裂解，取裂解液涂布瓊脂板上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。同時解剖獲取肝，脾，肺和血液，臟器加入500μl生理鹽水勻漿后離心，檢測上清細(xì)胞因子和將上清涂板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢測。血液離心后取血清檢測細(xì)胞因子。

7.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖7a結(jié)果可知，腹腔注射大腸埃希菌后，模型組小鼠72h存活率為40%，氯化二亞苯基碘鎓處理組72h存活率為80%，表明氯化二亞苯基碘鎓可提高大腸埃希菌感染小鼠的存活率。由圖7b結(jié)果可知，對組織細(xì)菌加載量的檢測發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌感染6h后肺組織細(xì)菌顯著增加，而氯化二亞苯基碘鎓處理組肺組織勻漿中細(xì)菌加載量顯著減少。同時對腹腔灌洗液上清及腹腔巨噬細(xì)胞胞內(nèi)的細(xì)菌量檢測發(fā)現(xiàn)，氯化二亞苯基碘鎓處理的小鼠其上清中的細(xì)菌量顯著減少，而胞內(nèi)的細(xì)菌量顯著增加，表明氯化二亞苯基碘鎓可通過促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬作用而增強(qiáng)對細(xì)菌的清除能力。由圖7c和7d所示，注射大腸埃希菌顯著增加了肺，脾，肝勻漿和血液上清中的tnf-α和il-6水平，然而氯化二亞苯基碘鎓可顯著抑制各臟器tnf-α和il-6水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯化二亞苯基碘鎓可在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬，從而增強(qiáng)了對細(xì)菌的清除，改善炎癥反應(yīng)進(jìn)而提高大腸埃希菌感染小鼠的存活率。