本發(fā)明具體涉及甜菜堿在提高CELI家族酶活性中的應用，屬于生物技術領域。

背景技術：

CELI酶是一種單鏈、雙鏈都特異識別的特異性核酸酶，等電點為6.0-6.5，分子量大小為43kDa(Yang et al,1999)；CEL II酶被認為是CEL I的降解產(chǎn)物，其分子量大小為39kDa，CEL I酶和CEL II酶均屬于CELI家族酶(Yang et al,1999；Pimkin et al,2006)。傳統(tǒng)理論認為該酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺(Till et al,2004)，它可以識別八種錯配形式的堿基(mismatches)分別為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被廣泛應用于突變檢測領域，如植物TILLING技術平臺中(Till et al,2006)。該酶可以特異性切割錯配堿基(Bing Yang et al,1999)。通過酶切擴增的目標檢測片段并經(jīng)瓊脂糖或毛細管電泳分離檢測，一般可方便獲得突變位置和大小。因此，它是一種比較方便和經(jīng)濟的檢測未知和已知突變位點的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途徑是從芹菜中提取，主要提取方法是通過硫酸銨沉淀法，得到粗提酶液(Till et al,2006)。如果需要得到純度更高的酶，需要經(jīng)過刀豆體蛋白A-瓊脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脫，但是得率較低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突變體檢測實驗是用粗提酶來檢測的，該粗提酶的主要成分即為CELI(Yang et al,1999；Till et al,2006)。

傳統(tǒng)的理論認為CELI酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺，有沒有可能存在其他離子可提高CELI酶的活性。到目前為止，Kulinski等人(Kulinski et al,2000)發(fā)現(xiàn)Li⁺、K⁺、Na⁺、Cs⁺對CELI酶的活性皆沒有提高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供甜菜堿在促進CELI家族酶活性中的應用；或甜菜堿在制備CELI家族酶酶切緩沖液或CELI家族酶酶切緩沖體系中的應用。

上述應用中，所述CELI家族酶活性為切割錯配位點。

本發(fā)明的另一個目的是提供含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液。

本發(fā)明提供的含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述甜菜堿在所述CELI家族酶酶切緩沖液中的濃度為0.01-20mM。

上述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述甜菜堿在所述CELI家族酶酶切緩沖液中的濃度為0.1-10mM、2-20mM或0.01-4mM。

上述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述CELI家族酶酶切緩沖液為 CELI酶切緩沖液，其中，所述甜菜堿在所述CELI酶切緩沖液中的濃度為0.1-10mM；

或CELI家族酶酶切緩沖液為CELII酶切緩沖液，其中，所述甜菜堿在所述CELII酶切緩沖液中的濃度為0.01-20mM；更具體為2-20mM或0.01-4mM。

上述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液由甜菜堿、BSA、Triton X-100、KCl和HEPES緩沖液組成；

或所述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液由Mutation Detection Kit-S100試劑盒中的緩沖液和甜菜堿組成。

上述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述Mutation Detection Kit-S100試劑盒是美國環(huán)球基因公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為706025。

上述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液中，所述HEPES緩沖液為濃度為0.1M、pH值為7.5的HEPES緩沖液。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種酶切反應體系。

本發(fā)明提供的酶切反應體系包括上述含有甜菜堿的CELI家族酶酶切緩沖液和CELI家族酶。

本發(fā)明還有一個目的是提供含有上述酶切緩沖液或上述酶切反應體系的試劑盒。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應體系或上述試劑盒在促進CELI家族酶切割含有錯配位點DNA中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應體系或上述試劑盒在檢測待測DNA分子是否含有錯配位點中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種用CELI家族酶酶切含有錯配位點DNA的方法。

本發(fā)明提供的用CELI家族酶酶切含有錯配位點DNA的方法包括如下步驟：將含有錯配位點DNA在上述酶切反應體系中進行酶切反應，實現(xiàn)酶切。

上述方法中，所述錯配位點的錯配形式為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。

上述方法中，所述酶切反應溫度為45℃；所述酶切反應時間為30min。

上述應用或上述的酶切緩沖液或上述酶切反應體系或上述試劑盒或上述方法中，所述CELI家族酶為CEL I酶或CEL II酶。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的催化活性物質甜菜堿，通過實驗證明：甜菜堿可以進一步提高CELI酶活，特別是對低豐度突變的檢測，由于CEL II屬于CELI家族酶，為了進一步驗證甜菜堿可以同時提高CELI家族酶的酶切活性，本發(fā)明還設計了CEL II酶切活性檢測實驗，實驗結果同樣表明甜菜堿也可以提高CEL II酶活。與傳統(tǒng)的酶切方法相比，本發(fā)明的方法更為靈敏：甜菜堿的終濃度在0.01-20mM范圍內(nèi)都可以提高CELI酶和 CELII酶的檢測靈敏度。對低豐度未知突變體的檢測，如某癌癥基因都有很好的檢測效果，特別是TILLING技術平臺檢測誘變?nèi)后w時，有明顯優(yōu)勢，不僅僅簡化了PCR純化步驟，同時相應地提高了檢測分辨率。

附圖說明

圖1為甜菜堿對CELI酶切效果。

圖2為甜菜堿對CELII酶切效果。

圖3為甜菜堿對CELII酶切效果。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

Mutation Detection Kit-S100試劑盒是美國環(huán)球基因公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為706025。

Binding Buffer是美國Zymo Research公司的產(chǎn)品；DNA Clean&Concentrator^TM-25。

HEPES緩沖液(0.1M、pH值為7.5)是Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為H3375-25G。

實施例1、甜菜堿在提高CELI家族酶活性中的應用

一、待酶切DNA樣品的制備

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，將其按2:1比例(質量比)混合，得到待PCR擴增的DNA(濃度為1ng/ul)。

序列2為將序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

2、PCR擴增

以步驟1獲得的待PCR擴增的DNA為模板，采用F和R引物對所述模板進行PCR擴增，擴增至45個熱循環(huán)，然后進行99℃變性10min，降溫至70℃，每個循環(huán)降低0.3℃，69個循環(huán)結束，得到PCR擴增產(chǎn)物，即待酶切DNA樣品。待擴增完畢后，用1％瓊脂糖凝膠檢測，檢測條帶是否特異，條帶亮度是否達到要求。若條帶較暗或不特異，需要重新擴增。引物序列如下：

F：5’-ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG-3’；

R：5’-TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA-3’。

對PCR擴增產(chǎn)物進行測序。測序結果表明PCR擴增產(chǎn)物含有序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA 分子。

PCR擴增體系(10ul)：10倍PCR緩沖液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂06.78ul；

PCR擴增熱循環(huán)：95℃2min；94℃10s，60℃30s，72℃1-3min；72℃5min，12℃hold。

異源錯配雙鏈形成：99℃10min；70℃20s，-0.3℃per cycle，70cycles；12℃10min。

3、PCR產(chǎn)物純化

(1)用在1倍體積的PCR擴增產(chǎn)物中加入2倍體積的Binding Buffer，翻轉充分混勻(對小于200bp的PCR擴增產(chǎn)物，加入5倍體積的Binding Buffer)得到混合液。

(2)將所述混合液加入DNA純化柱內(nèi)(如果溶液體積>700μl，分次轉移溶液)；室溫放置1-2min或更長時間。

(3)13,000g離心1min，棄廢液(目的DNA長度≤500bp時，離心結束后將收集管中的溶液再次轉入DNA純化柱中，離心)。

(4)在DNA純化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g離心30秒，棄廢液，將DNA純化柱放回收集管。

(5)重復步驟(4)。

(6)13,000g離心3min，以去除柱中殘余乙醇。

(7)將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在60℃預熱的30-50μl Elution Buffer或ddH₂O，室溫放置1-2min或更長時間。

二、CELI酶的制備

1、取10kg芹菜，放入榨汁機中，緩慢榨汁后，避免溫度過熱，在汁液中加入預冷勻漿緩沖液(含100mM Tris-HCl(pH均為7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、將所述混合液4℃下14000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液；向上清液中緩慢加入硫酸銨(每100ml上清液加25g硫酸銨)，分10次加入(每100ml體積加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速攪拌30min；14000rpm離心45min，棄沉淀，取上清液。

3、向上清液中緩慢加入硫酸銨至(每100ml上清液加80g硫酸銨)，分十次加入(每100ml體積加入39.0g固體硫酸銨)。低速攪拌30min后，14000rpm離心3min。棄上清，收集沉淀。

4、用1/10體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)溶解步驟3中得到的沉淀，1000rpm離心20min，棄沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成適當長度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸 5min。用超純水清洗透析袋。將透析袋放入10倍蛋白質溶液以上體積的緩沖液(0.1MTris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)中，透析過夜，透析4-5次至透析液無顏色為止。

6、取40ml透析過的酶液經(jīng)ConA-Sapharose-4B柱，用緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)沖洗，經(jīng)alpha-甘露糖苷洗脫后，經(jīng)緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)透析過夜，得到純化后的CELI酶，經(jīng)過SDS-PAGE檢測，其大小為43kDa，得到目的產(chǎn)物，分裝-80度保存。

三、酶切反應及其效果

1、酶切緩沖液的配制

酶切緩沖液配制分成如下4組：

組1：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

組2：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同濃度的甜菜堿(0.01mM、0.1mM、1mM、4mM、10mM和20mM)；

組3：向Mutation Detection Kit-S100試劑盒(含有Mg²⁺)中的緩沖液加入不同量的甜菜堿，得到酶切緩沖液，使甜菜堿的濃度分別為0mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM。

組4：10倍digestion buffer(不含Mg²⁺緩沖液配制)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同濃度的甜菜堿(0.01mM、0.1mM、1mM、4mM、10mM、20mM)。

2、酶切反應

取2ul的待酶切DNA樣品作為酶切反應底物，用上述各組酶切緩沖液進行酶切反應，得到酶切產(chǎn)物。

CELI酶切反應體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

CELII酶切反應體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、CELII酶(來源于Mutation Detection Kit-S100試劑盒)0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

酶切反應條件：45℃溫育30min。

若酶切產(chǎn)物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，則待酶切DNA樣品含有錯配位點(AC)；若酶切產(chǎn)物僅含有791bp的酶切片段，則待酶切DNA樣品不含有錯配位點(AC)。

3、毛細管電泳

酶切反應結束后立即加入2ul的0.225M的EDTA終止反應(15ul體系應加入3ul EDTA)，再補入91ul超純水稀釋樣品，可直接上機(FS 96，美國AATI公司)進行毛細管電泳，毛細管電泳條件如表1所示。

表1、毛細管電泳條件

4、甜菜堿對CELI酶和CELII酶酶切效果的影響

(1)甜菜堿對CELI酶切效果的影響

酶切產(chǎn)物經(jīng)用毛細管分離的結果如圖1所示(其中CK的酶切緩沖液為組1；其余泳道為含有不同濃度甜菜堿的組2；CELI酶切反應體系)。從圖1可以看出：酶切產(chǎn)物分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，與待酶切DNA樣品中錯配位點(AC)一致，并且濃度范圍在0.1-10mM的甜菜堿的酶切效果好于鎂離子的酶切結果，說明濃度范圍在0.1-10mM的甜菜堿均可提高CELI酶切活性。

(2)甜菜堿對CELII酶切效果的影響

酶切產(chǎn)物經(jīng)用毛細管分離的結果如圖2和圖3所示(其中圖2不同泳道為含有不同濃度甜菜堿的組3；圖3不同泳道為含有不同濃度甜菜堿的組4；圖2和圖3均為CELII酶切反應體系)。從圖2和圖3可以看出：酶切產(chǎn)物分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，與待酶切DNA樣品中錯配位點(AC)一致，圖2中濃度范圍在2-20mM的甜菜堿的酶切效果好于沒有甜菜堿的酶切效果，圖3中濃度范圍在0.01-10mM，尤其0.01-4mM的甜菜堿均可提高CELII酶切活性。說明濃度范圍在0.01-20mM的甜菜堿均可提高CELII酶切活性。