本發(fā)明涉及一種灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

據(jù)申請(qǐng)人所知，灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)屬于半翅目，飛虱科，主要分布于從菲律賓至西伯利亞一帶的亞洲稻區(qū)、以及歐洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)。在我國(guó)，灰飛虱分布遍及各省市，以長(zhǎng)江流域和華北稻區(qū)發(fā)生較多。灰飛虱是一種多食性的昆蟲(chóng)，它能夠取食水稻、小麥、玉米等多種禾本科植物?；绎w虱除了利用本身的刺吸式口器吮吸寄主植物汁液外，主要危害形式是傳播植物病毒病，如條紋葉枯病、黑條矮縮病及玉米粗縮病等。一般情況下，灰飛虱通過(guò)刺吸汁液傷害作物帶來(lái)的損失所占比例較小，灰飛虱最重要的危害形式是種群暴發(fā)促進(jìn)植物病毒病的流行。2004年在江淮地區(qū)，特別是江蘇省蘇北地區(qū)，灰飛虱種群暴發(fā)引起水稻條紋葉枯病流行，危害水稻面積達(dá)157萬(wàn)公頃，致使80％的水稻產(chǎn)區(qū)受害，減產(chǎn)30％-40％。2007年以來(lái)，灰飛虱在江蘇、安徽、浙江、河南等地造成水稻黑條矮縮病暴發(fā)，釀成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何通過(guò)減少灰飛虱的暴發(fā)來(lái)增加水稻產(chǎn)量，是目前人類(lèi)需迫切解決的問(wèn)題。

目前主要以化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治灰飛虱，已造成灰飛虱對(duì)常用各類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了不同水平的抗性，而導(dǎo)致其頻繁暴發(fā)。20世紀(jì)70年代有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑由于環(huán)境污染、高毒性和高抗性被禁止用于防治稻飛虱。80至90年代部分有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑被應(yīng)用于稻田，但效果一般、環(huán)境相容性差、選擇性差。與此同時(shí)，作用機(jī)制新穎的噻嗪酮、氟蟲(chóng)腈和吡蟲(chóng)啉被相繼引入稻田使用，卻造成灰飛虱對(duì)噻嗪酮和吡蟲(chóng)啉產(chǎn)生極高水平的抗性，而氟蟲(chóng)腈因?qū)λ锔叨拘杂?009年被禁用。抗性監(jiān)測(cè)表明，灰飛虱對(duì)現(xiàn)階段使用的噻蟲(chóng)嗪、烯啶蟲(chóng)胺、毒死蜱、吡蚜酮和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了從低到高水平的抗性及敏感性下降的趨勢(shì)。鑒于灰飛虱抗藥性發(fā)生的日益嚴(yán)重，亟需通過(guò)對(duì)灰飛虱進(jìn)行抗藥性監(jiān)測(cè)和抗藥性形成機(jī)制的研究，開(kāi)發(fā)出治理技術(shù)和策略，實(shí)現(xiàn)灰飛虱的可持續(xù)防治。

抗藥性監(jiān)測(cè)是抗藥性研究中的重要組成部分，建立科學(xué)、簡(jiǎn)便易行的抗性監(jiān)測(cè)方法是科學(xué)開(kāi)展抗藥性研究工作的前提條件。目前灰飛虱抗藥性監(jiān)測(cè)常采用稻苗浸漬法、稻莖浸漬法和點(diǎn)滴法，反映藥劑對(duì)灰飛虱的毒力，從而確定灰飛虱對(duì)藥劑的抗性表現(xiàn)，但這種活體生物測(cè)定技術(shù)的靈敏度較低，很難對(duì)灰飛虱田間低頻率的抗藥性發(fā)生進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此，隨著對(duì)灰飛虱抗藥性分子機(jī)制的深入研究，灰飛虱高靈敏度的抗性分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)隨之建立。

灰飛虱抗藥性分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)是基于對(duì)灰飛虱抗藥性分子機(jī)制的研究建立起來(lái)。目前灰飛虱對(duì)稻田常用殺蟲(chóng)劑的抗藥性主要涉及代謝抗性和靶標(biāo)抗性，代謝抗性主要是通過(guò)解毒代謝酶基因擴(kuò)增或過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致解毒代謝活性顯著升高，解毒代謝能力增強(qiáng)而對(duì)殺蟲(chóng)劑形成抗性。靶標(biāo)抗性是由于體內(nèi)殺蟲(chóng)劑的靶標(biāo)構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致殺蟲(chóng)劑與靶標(biāo)結(jié)合力下降，不能有效地殺死害蟲(chóng)，從而使害蟲(chóng)產(chǎn)生對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性。由于目前采用麥-稻-麥套種的輕型種植模式，利于灰飛虱就地轉(zhuǎn)移，灰飛虱的越冬代成蟲(chóng)可以在麥田產(chǎn)卵孵化，主要在麥田為害，并于近麥?zhǔn)諘r(shí)節(jié)羽化為成蟲(chóng)，大量遷移到水稻秧田危害，因此需建立麥、稻兩田的抗藥性分子檢測(cè)方法和開(kāi)發(fā)控制麥、稻田的灰飛虱的治理技術(shù)。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的普遍現(xiàn)象，可以作為防御機(jī)制來(lái)抵抗體內(nèi)非正常的核酸。RNA干擾主要是由后轉(zhuǎn)錄調(diào)控和雙鏈RNA(dsRNA)引起的，壓制靶標(biāo)基因的表達(dá)。最近幾年，RNAi技術(shù)已成為研究基因功能和害蟲(chóng)治理的一種有利用價(jià)值的工具。在實(shí)際的應(yīng)用中，通過(guò)導(dǎo)入需要沉默的基因的雙鏈RNA(dsRNA)來(lái)特異性降解細(xì)胞內(nèi)mRNA，壓制靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生功能表型缺失。目前RNAi可以沉默抗性相關(guān)基因，提高昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性。因此，RNAi為昆蟲(chóng)抗性治理提供了理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以從實(shí)驗(yàn)室向田間實(shí)現(xiàn)對(duì)害蟲(chóng)抗性的控制，有望從根本上解決這一問(wèn)題。

經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，專(zhuān)利號(hào)為201110122777.1、授權(quán)公告號(hào)為CN102220339B、名稱(chēng)為《灰飛虱致死基因片段》的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，利用RNAi技術(shù)沉默Ribosomal protein L9-B基因，對(duì)灰飛虱具有明顯的致死效果；應(yīng)用時(shí)，先合成Ribosomal protein L9-B基因dsRNA，再通過(guò)喂食使灰飛虱死亡。

專(zhuān)利號(hào)為201410041114.0、授權(quán)公告號(hào)為CN103820461B、名稱(chēng)為《一種褐飛虱基因Nl19243及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用》的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，基于RNAi技術(shù)，沉默褐飛虱的Nl19243基因，進(jìn)而使其死亡；應(yīng)用時(shí)將褐飛虱基因Nl19243轉(zhuǎn)化入水稻體內(nèi)，使該轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)Nl19243基因的dsRNA片段，從而對(duì)褐飛虱具有極好的抗蟲(chóng)效果。

申請(qǐng)?zhí)枮?01511029003.9、申請(qǐng)公布號(hào)為CN105685092A、名稱(chēng)為《一種幾丁質(zhì)合成抑制類(lèi)殺蟲(chóng)劑及其制備方法及應(yīng)用》的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)，利用RNAi技術(shù)，以雙鏈RNA沉默褐飛虱的幾丁質(zhì)合成酶A基因(NlCHSA)，從而阻礙褐飛虱的正常發(fā)育和繁殖。應(yīng)用時(shí)，以雙鏈RNA混入飼料中飼喂褐飛虱，使其無(wú)法正常發(fā)育和繁殖，進(jìn)而起到防治作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12，利用該基因可獲得降低灰飛虱抗藥性的基因片段(即dsRNA)，并進(jìn)行喂食RNAi，進(jìn)而降低灰飛虱抗藥性。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

一種灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12，其特征是，該基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

該基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為2956bp，其中，開(kāi)放閱讀框?yàn)閺?′端第665位到第2380位堿基，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1716bq；5′端UTR區(qū)從第1位到第664位堿基，3′端UTR區(qū)從2381位到2956位堿基。該基因的等電點(diǎn)是7.25，分子重量是64.195kDa。

本發(fā)明還提供：

由前文所述灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12編碼的多肽，其特征是，該多肽的序列如SEQ ID NO.2所示。

該多肽由572個(gè)氨基酸殘基組成，其中，Ser147、Glu278和His403構(gòu)成催化三聯(lián)體，可形成電荷傳遞系統(tǒng)；Gly70、Phe71和Ala148形成氧離子洞；位點(diǎn)41–51為羧酸酯酶B型保守區(qū)域(EDCLYLNIWTT)；位點(diǎn)134–149為羧酸酯酶B型絲氨酸區(qū)域(FGGDHRSVTLMGHSAG)；還含有六個(gè)糖基化位點(diǎn)。

本發(fā)明還提供：

一種降低灰飛虱抗藥性的基因片段，其特征是，該基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還提供：

前文所述降低灰飛虱抗藥性的基因片段的合成方法，其特征是，包括以下步驟：

第一步、從灰飛虱材料中提取灰飛虱總RNA；所述灰飛虱材料至少包括灰飛虱卵、灰飛虱若蟲(chóng)、灰飛虱成蟲(chóng)之一；

第二步、先以灰飛虱總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；再以PCR合成灰飛虱cDNA模板；

第三步、采用引物dsLSCE12-F和引物dsLSCE12-R、以及灰飛虱cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得dsRNA模板并進(jìn)行純化；其中，所述引物dsLSCE12-F的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.5所示序列，所述引物dsLSCE12-R的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO.7所示；

第四步、采用純化后的dsRNA模板，體外合成dsRNA并保存?zhèn)溆?；所得dsRNA即為目標(biāo)基因片段。

該合成方法進(jìn)一步完善的技術(shù)方案如下：

優(yōu)選地，第一步的具體過(guò)程為：

采用總RNA提取試劑盒從灰飛虱材料中提取灰飛虱總RNA；以瓊脂糖凝膠電泳純化灰飛虱總RNA；以核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)灰飛虱總RNA的濃度以及吸光度值；將灰飛虱總RNA凍存；

第二步的具體過(guò)程為：

以灰飛虱總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈；然后，采用cDNA第一鏈，于PCR儀中合成灰飛虱cDNA模板，具體合成條件為：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得灰飛虱cDNA模板凍存；

第三步的具體過(guò)程為：

采用引物dsLSCE12-F和引物dsLSCE12-R、以及灰飛虱cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并獲得dsRNA模板，擴(kuò)增時(shí)的PCR反應(yīng)條件為：94℃3min，94℃30s、68℃30s以及72℃1min 10個(gè)循環(huán)，94℃30s以及72℃1min 28個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持；電泳純化所得dsRNA模板，并以回收試劑盒進(jìn)行純化后保存；

第四步的具體過(guò)程為：

采用純化后的dsRNA模板，以試劑盒體外合成dsRNA，并以2～5倍反應(yīng)體系的無(wú)核酸酶水溶解所得dsRNA，然后凍存?zhèn)溆谩?/p>

更優(yōu)選地，第一步中，凍存灰飛虱總RNA的溫度為-80℃以下；第二步中，凍存灰飛虱cDNA模板的溫度為-20℃±5℃；第三步中，純化后保存dsRNA模板的溫度為0℃-4℃或-20℃±5℃；第四步中，凍存dsRNA的溫度為-80℃以下。

本發(fā)明還提供：

一種前文所述的合成方法中所用引物，其特征是，包括引物dsLSCE12-F和引物dsLSCE12-R，所述引物dsLSCE12-F的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.5所示序列，所述引物dsLSCE12-R的序列為5′端加有T7啟動(dòng)子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO.7所示。

本發(fā)明還提供：

一種前文所述灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12的用途，其特征是，該用途為用于合成前文所述降低灰飛虱抗藥性的基因片段。

本發(fā)明還提供：

一種前文所述降低灰飛虱抗藥性的基因片段的用途，其特征是，該用途為用于降低灰飛虱抗藥性。

該用途進(jìn)一步完善的技術(shù)方案如下：

優(yōu)選地，該用途為降低灰飛虱針對(duì)溴氰菊酯的抗藥性。

發(fā)明人經(jīng)反復(fù)地深入實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)，灰飛虱羧酸酯酶基因中的基因LSCE12是導(dǎo)致灰飛虱具有抗藥性的關(guān)鍵基因，一方面，通過(guò)檢測(cè)基因LSCE12和/或其編碼的多肽，可檢測(cè)灰飛虱的抗藥性，另一方面，通過(guò)以基因LSCE12為模板最終體外合成dsRNA，并進(jìn)行喂食RNAi，可有效降低灰飛虱的抗藥性，實(shí)現(xiàn)對(duì)灰飛虱的抗藥性治理。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中灰飛虱LSCE12基因CDS全長(zhǎng)電泳圖，圖中，1-2泳道為灰飛虱PCR電泳結(jié)果；M為T(mén)rans2K Plus Marker。

圖2是實(shí)施例2中灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因半定量電泳圖。

圖3是實(shí)施例3中灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因熒光定量分析。

圖4是實(shí)施例4中灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因相對(duì)拷貝分析。

圖5是實(shí)施例5中灰飛虱的含有T7啟動(dòng)子的抗藥性基因LSCE12序列。

圖6是實(shí)施例5中灰飛虱的含有T7啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因GFP序列。

圖7是實(shí)施例5中灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12體外合成的dsRNA(即圖中的dsLSCE12，下同)、以及綠色熒光蛋白基因GFP體外合成的dsGFP的電泳圖。

圖8是實(shí)施例6中喂食灰飛虱dsRNA后其基因表達(dá)量變化圖。

圖9是實(shí)施例6中灰飛虱抗藥性基因LSCE12沉默后溴氰菊酯抗性的毒理分析圖。

圖10至圖12分別為灰飛虱羧酸酯酶基因家族引物的核苷酸序列。

具體實(shí)施方式

一、本發(fā)明的主要研究過(guò)程：

本發(fā)明利用深圳華大基因研究院測(cè)序得到的灰飛虱羧酸酯酶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)NCBI-nr數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)，得到轉(zhuǎn)錄組注釋信息。利用RT-PCR技術(shù)對(duì)羧酸酯酶基因家族進(jìn)行分子克隆和鑒定，在PCR擴(kuò)增步驟中，羧酸酯酶基因家族引物的核苷酸序列如圖10至圖12所示。

本發(fā)明利用RT-PCR方法，克隆鑒定灰飛虱的羧酸酯酶基因(CE)。56條灰飛虱羧酸酯酶基因注釋的轉(zhuǎn)錄本從灰飛虱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到，這些轉(zhuǎn)錄本與NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)具有相似性，并且暫時(shí)性地命名為L(zhǎng)SCE1-LSCE56(簡(jiǎn)寫(xiě)為CE1-CE56)。

其中39條序列證實(shí)在灰飛虱中確實(shí)表達(dá)。使用NCBI BLASTX程序分析顯示，39條CE的序列與其他的昆蟲(chóng)種有高度的相似性。在這些鑒定的CE基因家族中，CE5，CE13，CE16，CE17，CE29，CE34，CE41，CE44和CE51能夠被重新組裝為高度單一的轉(zhuǎn)錄本?；贜CBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST程序，這些CE基因能夠匹配到15種昆蟲(chóng)的蛋白上。

本發(fā)明以溴氰菊酯抗藥性灰飛虱、敏感性灰飛虱為研究材料，分別提取兩者的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)克隆得到的羧酸酯酶基因(CE)的序列，通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行篩選，羧酸酯酶基因家族引物的核苷酸序列如圖10至圖12所示，確定溴氰菊酯抗性品系中CE基因表達(dá)量上調(diào)的基因?；谇悬c(diǎn)≥2倍的改變和P<0.05的分析方法，結(jié)果顯示在溴氰菊酯的抗性品系中LSCE12表達(dá)水平上調(diào)，其他基因的表達(dá)量在抗敏品系中相似或相同。

本發(fā)明根據(jù)溴氰菊酯抗藥性灰飛虱、敏感性灰飛虱為研究材料，分別提取兩者的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量PCR技術(shù)證實(shí)半定量RT-PCR的分析結(jié)果，同時(shí)為證實(shí)LSCE12表達(dá)上調(diào)的原因，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)LSCE12的拷貝數(shù)進(jìn)行分析。分別設(shè)β-actin和鈉離子通道(para)作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，重復(fù)3次試驗(yàn)，反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線檢驗(yàn)，并按照2^-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，在熒光定量PCR擴(kuò)增中，LSCE12引物的核苷酸序列為：

引物L(fēng)SCE12-F:5′-GAAATTGGAGCGTTCTAGCACTG-3′

引物L(fēng)SCE12-R:5′-AGGATGGATGGTATCACTGAAGAC-3′

熒光定量PCR的方法結(jié)果顯示，LSCE12的表達(dá)水平在溴氰菊酯的抗性品系中是敏感品系的11.10+倍。相對(duì)于敏感品系，LSCE12在基因組水平上基因拷貝數(shù)沒(méi)有變化，可以認(rèn)為L(zhǎng)SCE12為單拷貝，可見(jiàn)LSCE12是由基因轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)而非基因組水平上拷貝擴(kuò)增引起，過(guò)表達(dá)的LSCE12可能由調(diào)控區(qū)域的突變引起。

綜上可知，通過(guò)羧酸酯酶基因鑒定克隆和基因表達(dá)分析，表明過(guò)表達(dá)的抗藥性基因LSCE12參與灰飛虱對(duì)溴氰菊酯的抗性形成，使得抗藥性基因LSCE12及其編碼的多肽在灰飛虱的抗藥性分子檢測(cè)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

RNA干擾是通過(guò)專(zhuān)一性的外源和內(nèi)源的雙鏈RNA沉默基因的現(xiàn)象。因此，可以利用RNAi的技術(shù)沉默靶基因，成為害蟲(chóng)防治策略的主流手段。

本發(fā)明根據(jù)灰飛虱的抗藥性基因LSCE12和綠色熒光蛋白基因GFP分別設(shè)計(jì)dsRNA引物和dsGFP引物(注：本試驗(yàn)所用灰飛虱的體內(nèi)存在綠色熒光蛋白基因GFP)，之后，提取灰飛虱溴氰菊酯抗性品系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，以灰飛虱cDNA為模板，用加過(guò)T7序列的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，合成dsRNA模板和dsGFP模板。在PCR擴(kuò)增中，用于合成dsRNA模板的引物為引物dsLSCE12-F和引物dsLSCE12-R，用于合成dsGFP模板的引物為引物dsGFP-F和引物dsGFP-R；

其中，引物dsLSCE12-F的核苷酸序列為：

dsLSCE12-F：5′-TTTACTCCAACCGAGGACCGT-3′，即SEQ ID NO.5，在其5′端加T7啟動(dòng)子序列；

引物dsLSCE12-R的核苷酸序列為：

dsLSCE12-R：5′-TTCAGCAGAACCACGCAGACT-3′，即SEQ ID NO.6，在其5′端加T7啟動(dòng)子序列；

引物dsGFP-F的核苷酸序列為：

dsGFP-F：5′-AAGTTCAGCGTGTCCG-3′，即SEQ ID NO.8，在其5′端加T7啟動(dòng)子序列；

引物dsGFP-R的核苷酸序列為：

dsGFP-R：5′-GAACGGCATCAAGGTG-3′，即SEQ ID NO.9，在其5′端加T7啟動(dòng)子序列；

T7啟動(dòng)子序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，即SEQ ID NO.7。

利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)回收試劑盒對(duì)dsRNA模板和dsGFP模板進(jìn)行純化。使用T7RiboMAX^TM Express RNAi System(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)試劑盒利用純化產(chǎn)物合成dsRNA和dsGFP。

人工液體飼料混合dsRNA和dsGFP連續(xù)喂食灰飛虱5齡若蟲(chóng)至成蟲(chóng)，其中，處理組喂食含dsRNA的飼料，其各基因dsRNA的濃度均為0.25μg/μl；對(duì)照組喂食不含dsRNA的飼料。每組喂食3管，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

采用點(diǎn)滴法對(duì)干擾后抗性灰飛虱成蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定，同時(shí)取處理組的灰飛虱成蟲(chóng)，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)LSCE12表達(dá)量的變化。

本發(fā)明研究中，用抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12的dsRNA和dsGFP喂食灰飛虱的五齡若蟲(chóng)直至成蟲(chóng)，以喂食無(wú)dsRNA的營(yíng)養(yǎng)液為CK，對(duì)喂食干擾后的灰飛虱成蟲(chóng)進(jìn)行毒理分析。在研究過(guò)程中，由于綠色熒光蛋白基因GFP在灰飛虱體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，可以作為RNA干擾脫靶效應(yīng)的報(bào)告基因。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)沉默溴氰菊酯抗性相關(guān)的LSCE12基因后，可以顯著地提高灰飛虱對(duì)溴氰菊酯的敏感性，因此LSCE12基因是溴氰菊酯抗性的關(guān)鍵作用基因。通過(guò)合成LSCE12基因的dsRNA進(jìn)行喂食RNAi可以降低靶基因的表達(dá)量，增加灰飛虱對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性，因此LSCE12基因雙鏈RNA的合成在灰飛虱抗性治理方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本發(fā)明通過(guò)對(duì)灰飛虱轉(zhuǎn)錄組的分析，獲得了灰飛虱羧酸酯酶家族基因(CE)，利用RT-PCR技術(shù)克隆鑒定CE家族基因，獲得灰飛虱羧酸酯酶家族基因序列。通過(guò)半定量RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)灰飛虱溴氰菊酯抗性品系和敏感品系進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)LSCE12基因表達(dá)上調(diào)，利用RACE技術(shù)獲得LSCE12全長(zhǎng)基因，然后以LSCE12基因片段為模板合成相應(yīng)dsRNA，并利用喂食目的片段dsRNA的方法分析LSCE12基因在RNAi沉默后灰飛虱中LSCE12mRNA的表達(dá)水平，并對(duì)抗性灰飛虱成蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定。以上研究結(jié)果表明，LSCE12基因的分離克隆，對(duì)于灰飛虱高靈敏度的抗性分子檢測(cè)和灰飛虱的抗性治理具有重要作用。

此外，發(fā)明人注意到，現(xiàn)有技術(shù)利用RNAi技術(shù)抗蟲(chóng)的思路主要有兩種：第一種是找到害蟲(chóng)的致死基因，然后據(jù)此設(shè)計(jì)合成dsRNA，并通過(guò)喂食直接導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡、或直接導(dǎo)致害蟲(chóng)不能正常發(fā)育和繁殖；第二種是找到害蟲(chóng)的致死基因，然后據(jù)此設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，使農(nóng)作物具備能直接導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡的能力。然而，在當(dāng)前的實(shí)際情況下，社會(huì)公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍帶有很深的誤解，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物很難被直接接受；同時(shí)，能通過(guò)喂食直接導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡、或直接導(dǎo)致害蟲(chóng)不能正常發(fā)育和繁殖的dsRNA，容易被社會(huì)公眾誤認(rèn)為該dsRNA本身帶有致死毒性、或發(fā)育/繁殖毒性，使這種dsRNA也不容易被接受。與之相比，本發(fā)明利用RNAi技術(shù)，采用dsRNA降低灰飛虱抗藥性，使灰飛虱更容易被殺蟲(chóng)劑殺滅，可有效避免社會(huì)公眾產(chǎn)生類(lèi)似的誤解，這無(wú)疑會(huì)使后續(xù)的推廣工作更加順利。

二、本發(fā)明的具體實(shí)施例：

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但是本發(fā)明不僅限于這些例子。

本發(fā)明所用的溴氰菊酯抗性品系2009年采自江蘇建湖縣，用溴氰菊酯連續(xù)篩選30代獲得；敏感品系2009年采自江蘇建湖縣，在未接觸任何殺蟲(chóng)劑情況下室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)獲得。

本發(fā)明所涉及的試劑均為市購(gòu)。

下述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1.LSCE12基因的克隆和序列分析

本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建灰飛虱轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序的方法獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上獲得LSCE12基因片段。

(1)灰飛虱總RNA提取。

以敏感品系灰飛虱為研究材料，選取灰飛虱卵、1-5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)使用TRIzol總RNA提取試劑盒(上海英駿生物技術(shù)有限公司)對(duì)其進(jìn)行混合提取，操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的灰飛虱總RNA使用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，用Nanodrop1000核酸蛋白定量?jī)x對(duì)RNA的濃度以及吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)RNA的質(zhì)量和完整性，然后放入超低溫冰箱中在-80℃條件下凍存。

(2)cDNA模板的制備。

以灰飛虱總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript^TM RT reagent Kit(寶生物工程大連有限公司)合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件為：500ng總RNA，2μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)，補(bǔ)足到10μl RNase Free ddH₂O。PCR儀中完成cDNA合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)引物的設(shè)計(jì)。

本發(fā)明以轉(zhuǎn)錄組中LSCE12基因片段序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物為

LSCE12-F：5′-GAGGAAACATGGGACTTCTGGAC-3′；

LSCE12-R：5′-TGTGGGAAAAGTATGGTGATTGGT-3′。

引物L(fēng)SCE12-F和LSCE12-R由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(4)PCR擴(kuò)增、回收純化及測(cè)序。

以灰飛虱的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl 10×PCR Buffer，2.5μl MgCl₂，2μl dNTPs，1μl cDNA，1μl LSCE12-F(10μmol/L)，1μl LSCE12-R(10μmol/L)，0.25μl Taq DNA Polymerase，14.75μl ddH₂O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)純化目的DNA片段，然后將純化好的DNA片段利用pEASY-T3 Clothing Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接轉(zhuǎn)化，挑斑后搖菌，將菌液送南京金斯瑞公司進(jìn)行序列測(cè)定。

(5)測(cè)序結(jié)果分析。

用基因探索者軟件分析所測(cè)得的序列，并通過(guò)NCBI的BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)分析，用GeneDoc進(jìn)行比較分析。

(6)LSCE12全長(zhǎng)基因克隆。

以灰飛虱總RNA為模板，使用Clontech^TM Smarter反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，按照操作步驟進(jìn)行5′(3′)-race cDNA第一鏈的合成，在PCR儀完成RNA變性反應(yīng)，條件為72℃3min，42℃2min。PCR儀中完成cDNA合成：42℃90min，70℃10min，用Tricine-EDTA Buffer稀釋后總體積約100μl。

(7)全長(zhǎng)引物設(shè)計(jì)。

LSCE12基因的5′和3′端引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的5′端引物為

5LSCE12GSP：5′-GGAAGGAATGAGTCGACAACTGGCAATG-3′；

設(shè)計(jì)的3′端引物為

3LSCE12GSP：5′-CCTCTTCGAACCCGAACTCGATGTCATG-3′；

LSCE12基因CDS擴(kuò)增引物分別為：

LSCE12-CDSFP：5′-GGACTTGAAACCAACCTCT-3′；

LSCE12-CDSRP：5′-CAGCCTACAAACACCATTAT-3′。

(8)PCR擴(kuò)增。

LSCE12基因全長(zhǎng)克隆以灰飛虱的5′(3′)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl 10×LA buffer，2.5μl MgCl₂，4μl dNTPs，1μl cDNA，2.5μl UPM，1μl GSP(10μmol/L)，0.25μl LA Taq DNA Polymerase，12.25μl ddH₂O。擴(kuò)增程序：94℃3min，94℃30s，72℃3min 5個(gè)循環(huán)，94℃30s，70℃30s，72℃3min 5個(gè)循環(huán)，94℃30s，68℃30s，72℃3min 25個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持。所得PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)。

LSCE12基因CDS克隆以灰飛虱的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl 10×PCR Buffer，2.5μl MgCl₂，4μl dNTPs，1μl cDNA，1μl LSCE12-CDSFP(10μmol/L)，1μl LSCE12-CDSRP(10μmol/L)，0.25μl LA Taq DNA Polymerase，12.75μl ddH₂O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s，55℃40s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，12℃保持。

回收純化、測(cè)序及測(cè)序結(jié)果分析同本實(shí)施例中(4)和(5)的相關(guān)步驟。

灰飛虱LSCE12基因CDS全長(zhǎng)電泳圖如圖1所示。1-2泳道為灰飛虱PCR電泳結(jié)果；M為T(mén)rans2K Plus Marker。

實(shí)施例2.灰飛虱溴氰菊酯抗性品系和敏感品系中LSCE12基因的半定量分析

選取成蟲(chóng)期的溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱材料，利用半定量RT-PCR分析這些材料中LSCE12基因的表達(dá)水平，從而可以快速獲得LSCE12基因表達(dá)水平與溴氰菊酯抗藥性的關(guān)系。

(1)灰飛虱總RNA提取。

以成蟲(chóng)期的溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱為材料，使用SV Total RNA提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)依照操作步驟提取總RNA，提取的灰飛虱總RNA使用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，用Nanodrop100核酸蛋白定量?jī)x對(duì)RNA的濃度以及吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)RNA的質(zhì)量和完整性，然后放入超低溫冰箱中在-80℃條件下凍存。

(2)cDNA模板的制備。

以灰飛虱總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript^TM RT reagent Kit(寶生物工程大連有限公司)合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件為：500ng總RNA，2μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)，補(bǔ)足到10μl RNase Free ddH₂O。PCR儀中完成cDNA合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)半定量RT-PCR。

利用實(shí)施例1中LSCE12基因片段鑒定引物L(fēng)SCE12-F和LSCE12-R，以溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。內(nèi)參基因選用β-actin(353bp)，上游引物序列是5′-AGTGCCCATCTACGAAGGTT-3′，下游引物序列是5′-CAGTATCCATGAGACCACCTACA-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl：2.5μl 10×PCR Buffer，2.5μl MgCl₂，2μl dNTPs，1μl cDNA，1μl LSCE12-F(10μmol/L)，1μl LSCE12-R(10μmol/L)，0.25μl Taq DNA Polymerase，14.75μl ddH₂O。PCR反應(yīng)條件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，進(jìn)行25-30個(gè)循環(huán)；72℃10min；12℃保持。所得PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)。半定量RT-PCR分析執(zhí)行三次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行三次操作重復(fù)。

灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因半定量電泳圖如圖2所示，R為抗性品系，S為敏感品系。結(jié)果顯示在溴氰菊酯的抗性品系中LSCE12表達(dá)水平上調(diào)。

實(shí)施例3.灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因熒光定量分析

選取成蟲(chóng)期的溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱為材料，利用熒光定量PCR分析這些材料中LSCE12基因的表達(dá)水平，從而可以證實(shí)LSCE12基因表達(dá)水平與溴氰菊酯抗藥性的關(guān)系。

(1)熒光定量PCR。

利用實(shí)施例2中的溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。LSCE12基因和內(nèi)參β-actin的引物使用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)，LSCE12基因引物為前文所述的引物L(fēng)SCE12-F和引物L(fēng)SCE12-R，內(nèi)參β-actin的引物序列是：

5′-TCCGAGACATCAAGGTGAAACTG-3′

和5′-TGCTTCCATACCCAAGAAAGACG-3′。

實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR)試驗(yàn)操作在ABI 7300實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，其反應(yīng)體系及程序參照Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(2)本實(shí)驗(yàn)將采用2^-△△CT方法比較LSCE12基因在溴氰菊酯品系和敏感品系中的表達(dá)量差異，計(jì)算公式為：

ΔΔCt＝(Ct_{目標(biāo)基因}-Ct_持家基因)_{實(shí)驗(yàn)組}-(Ct_{目標(biāo)基因}-Ct_持家基因)_{對(duì)照組}。

每個(gè)品系設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件完成(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。數(shù)據(jù)以mean±SE表示，mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯氏新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)比較目標(biāo)基因在各品系中的表達(dá)量的差異。

灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因熒光定量分析結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，LSCE12的表達(dá)水平在溴氰菊酯的抗性品系中是敏感品系的11.10+倍。

實(shí)施例4.灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因相對(duì)拷貝分析

選取成蟲(chóng)期的溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱為材料，利用熒光定量PCR分析這些材料中LSCE12基因的相對(duì)拷貝數(shù)，初步證實(shí)LSCE12基因表達(dá)上調(diào)的原因。

(1)基因組DNA提取。

以成蟲(chóng)期的溴氰菊酯抗藥性和敏感性灰飛虱為材料，按CTAB法提取基因組DNA，提取的灰飛虱基因組DNA使用濃度為1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)其大小和質(zhì)量。然后放入冰箱中在-20℃條件下凍存。

(2)熒光定量PCR。

熒光定量PCR使用灰飛虱的para基因作為內(nèi)參，灰飛虱的para基因是單拷貝的基因?；蚩截悢?shù)的定量PCR的擴(kuò)增效率與基因轉(zhuǎn)錄水平的定量PCR是一致的。para基因引物序列分別是：5′-TATCCGTGCTGCGTTCGTTC-3′和5′-AATGTCAGGTTGCCGAGAGC-3′。熒光定量PCR試驗(yàn)操作、反應(yīng)體系、程序及數(shù)據(jù)分析依據(jù)實(shí)施例3的相關(guān)步驟進(jìn)行。

灰飛虱溴氰菊酯抗性和敏感品系中LSCE12基因相對(duì)拷貝分析結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，相對(duì)于敏感品系，抗性品系的LSCE12在基因組水平上基因拷貝數(shù)沒(méi)有變化。

實(shí)施例5.體外合成灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12的dsRNA和綠色熒光蛋白基因GFP的dsGFP

(1)以灰飛虱溴氰菊酯抗性品系為研究材料，灰飛虱總RNA提取和cDNA模板的制備依據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行操作。

(2)引物設(shè)計(jì)。

引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，抗藥性基因LSCE12的dsRNA和綠色熒光蛋白GFP的dsGFP的引物的核苷酸序列為：

dsLSCE12-F：5′-TTTACTCCAACCGAGGACCGT-3′；

dsLSCE12-R：5′-TTCAGCAGAACCACGCAGACT-3′；

dsGFP-F：5′-AAGTTCAGCGTGTCCG-3′；

dsGFP-R：5′-GAACGGCATCAAGGTG-3′。

以上上下游引物序列均在5′端加T7啟動(dòng)子序列，T7啟動(dòng)子序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′。

(3)合成dsRNA模板和dsGFP模板。

以灰飛虱cDNA為模板，用加過(guò)T7序列的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系總體積為50μl：5μl 10×PCR Buffer，4μl MgCl₂，4μl dNTPs，2μl cDNA，1μl Primer F(10μmol/L)，1μl Primer R(10μmol/L)，0.25μl Taq DNA Polymerase，32.75μl ddH₂O。

為達(dá)到dsRNA合成需要，上述PCR體系需增加10～20倍。

PCR反應(yīng)條件:94℃3min，94℃30s，68℃30s，72℃1min 10個(gè)循環(huán)，94℃30s，72℃1min 28個(gè)循環(huán)，72℃10min，12℃保持。

(4)dsRNA模板和dsGFP模板的回收純化。

選擇Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)回收試劑盒對(duì)PCR電泳產(chǎn)物進(jìn)行純化，操作步驟依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。回收產(chǎn)物4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)dsRNA和dsGFP的體外合成。

使用T7RiboMAX^TM Express RNAi System試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)合成dsRNA和dsGFP，操作方法依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后加入2～5倍反應(yīng)體系的無(wú)核酸酶水溶解產(chǎn)物，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

灰飛虱的含有T7啟動(dòng)子的抗藥性基因LSCE12序列如圖5所示；含有T7啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因GFP序列如圖6所示?？顾幮曰騆SCE12體外合成的dsRNA、以及綠色熒光蛋白基因GFP體外合成的dsGFP的電泳圖如圖7所示。

實(shí)施例6.灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12RNAi效應(yīng)檢測(cè)

參照褐飛虱液體飼料配方及飼養(yǎng)方法(Fu等，2001)，稍加改進(jìn)后進(jìn)行飼喂。具體步驟如下：

S1.取兩端開(kāi)口的玻璃管(12×3cm)，一端用細(xì)紗布封好，用吸蟲(chóng)器吸取2齡初若蟲(chóng)小心轉(zhuǎn)入玻璃管，每管20頭左右，用細(xì)紗布封口；

S2.在超凈臺(tái)中，輕輕拍打玻璃管使蟲(chóng)子集中到玻璃管一端，然后取下另一端的紗布，將準(zhǔn)備好的封口膜拉成正方形，貼紙面朝外蓋住玻璃管口；

S3.用移液槍吸取50μl飼料及相應(yīng)濃度的dsRNA，滴在膜中央輕微吸打混合，再取一片新的封口膜，貼紙面朝下蓋在滴有液體飼料的封口膜上，將飼料封于兩層膜間；

S4.添加飼料后將玻璃管平放到養(yǎng)蟲(chóng)架上，玻璃管上蓋一層黑布，只露出喂食飼料端，利用趨光性吸引灰飛虱到飼料端取食；

S5.每24h換一次新鮮飼料，并統(tǒng)計(jì)灰飛虱的死亡率。實(shí)驗(yàn)室溫度為27℃±1℃、相對(duì)濕度70-80％、24小時(shí)連續(xù)光照。處理組喂食含dsRNA的飼料，其各基因dsRNA的濃度均為0.25μg/μl；對(duì)照組喂食不含dsRNA的飼料。每組喂食3管，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(1)灰飛虱飼料配方如下表所示：

(2)溴氰菊酯生物測(cè)定。

選取5齡的灰飛虱連續(xù)喂食含有dsRNA的液體人工飼料至成蟲(chóng)，采用點(diǎn)滴法對(duì)干擾過(guò)后抗性灰飛虱成蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定。每個(gè)濃度使用30頭成蟲(chóng)測(cè)試，重復(fù)三次。溴氰菊酯品系與對(duì)照組采用48ng/頭，24ng/頭和12ng/頭三個(gè)濃度進(jìn)行毒理分析。處理后24h檢查死亡率。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法為Duncan test(P<0.05)，字母不同代表有顯著差異。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 13.0。

(3)實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)。

根據(jù)已知灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12和綠色熒光蛋白基因GFP的序列，運(yùn)用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)PCR引物，以β-actin和GAPDH為內(nèi)參基因。

實(shí)時(shí)定量PCR上下游引物設(shè)計(jì)如下：

LSCE12q-F：5′-GTTATCCGCTCACAATTCCACAC-3′；

LSCE12q-R：5′-CAATACGCAACCGCCTCTCC-3′；

GFP-F：5′-TTATCCGCTCACAATTCCACAC-3′；

GFP-R：5′-ATACGCAAACCGCCTCTCC-3′；

β-actinq-F：5′-TCCGAGACATCAAGGTGAAACTG-3′；

β-actinq-R：5′-TGCTTCCATACCCAAGAAAGACG-3′；

GA3PDHq-F：5′-GTGTGCCAGTGCCCAATGTATC-3′；

GA3PDHq-R：5′-ATGCCCTTCAGTGGTCCTTCG-3′。

(4)實(shí)時(shí)定量PCR。

灰飛虱總RNA提取和cDNA模板的制備，依據(jù)實(shí)施例2的相關(guān)步驟進(jìn)行。熒光定量PCR試驗(yàn)操作、反應(yīng)體系、程序及數(shù)據(jù)分析依據(jù)實(shí)施例3的相關(guān)步驟進(jìn)行。

喂食灰飛虱dsRNA后其基因表達(dá)量變化結(jié)果如圖8所示。

灰飛虱抗藥性羧酸酯酶基因LSCE12沉默后溴氰菊酯抗性的毒理分析結(jié)果如圖9所示，分別為48ng/頭濃度、24ng/頭濃度、12ng/頭濃度處理溴氰菊酯抗性品系。

結(jié)果表明，

對(duì)于灰飛虱的溴氰菊酯抗性品系：

48ng/頭溴氰菊酯濃度處理干擾后灰飛虱的溴氰菊酯抗性品系結(jié)果顯示，喂食dsGFP和無(wú)dsRNA的營(yíng)養(yǎng)液的灰飛虱，毒理死亡率分別為70.45％和75.34％，喂食LSCE12基因的dsRNA的灰飛虱死亡率為90.12％。

24ng/頭溴氰菊酯濃度處理干擾后灰飛虱的溴氰菊酯抗性品系結(jié)果顯示，喂食dsGFP和無(wú)dsRNA的營(yíng)養(yǎng)液的灰飛虱，毒理死亡率分別為53.21％和55.34％，而喂食LSCE12基因的dsRNA的灰飛虱死亡率為80.12％。

12ng/頭溴氰菊酯濃度處理干擾后灰飛虱的溴氰菊酯抗性品系結(jié)果顯示，喂食dsGFP和無(wú)dsRNA的營(yíng)養(yǎng)液的灰飛虱，毒理死亡率分別為30.21％和32.76％，而喂食LSCE12基因的dsRNA的灰飛虱死亡率為40.12％。

以上結(jié)果表明，沉默溴氰菊酯抗性相關(guān)的LSCE12基因后，可以顯著地提高灰飛虱對(duì)溴氰菊酯的敏感性。

除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。