本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體說(shuō)是提供一種熱穩(wěn)定性高、抑制率高的葡萄糖6磷酸脫氫酶(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)突變體，該突變酶可以作為診斷試劑盒的重要原料。
背景技術(shù)：
：在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，小分子激素以及治療藥物的檢測(cè)的方法主要有RIA，Elisa，化學(xué)發(fā)光，質(zhì)譜，均相酶免技術(shù)等。其中RIA技術(shù)由于有放射性污染，目前已經(jīng)被淘汰；Elisa技術(shù)是較RIA技術(shù)更為先進(jìn)，沒(méi)有放射性污染，然而整個(gè)過(guò)程為非均相模式，需要多次洗板，一輪檢測(cè)需要至少2小時(shí)以上，出報(bào)告時(shí)間太長(zhǎng)；化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有靈敏度高的特點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間只需十幾分鐘，但是該方法儀器及試劑的成本均較高，往往只有大醫(yī)院才具備開(kāi)展該項(xiàng)目的實(shí)力，而且容易給患者增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；質(zhì)譜法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高，一次可以檢測(cè)不止一種小分子，但是樣本前處理麻煩，自動(dòng)化處理系統(tǒng)尚未推廣，且所需質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，初始投資大，國(guó)內(nèi)開(kāi)展的醫(yī)院并不多，且多用于研究，臨床應(yīng)用更少；均相酶免技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是反應(yīng)是在均一的液體中進(jìn)行，不需要分離，可在普通的生化儀上進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間10分鐘左右即可出報(bào)告，該方法容易在各層級(jí)的醫(yī)院中推廣。目前，均相酶免技術(shù)主要分為兩類，一種是，克隆酶供體免疫分析(CDEIA)(美國(guó)專利：US4708929)，DNA重組技術(shù)可分別合成某種功能酶(如β-D半乳糖苷酶)分子的兩個(gè)片段.大片段稱為酶受體(EA)，小分子稱作酶供體(ED)，兩者單獨(dú)均無(wú)酶活性，一定條件下結(jié)合形成四聚體方具酶活性?？寺∶腹w免疫測(cè)定的反應(yīng)模式為競(jìng)爭(zhēng)法，測(cè)定原理為:標(biāo)本中的抗原和酶供體(ED)標(biāo)記的抗原與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成兩種抗原抗體復(fù)合物。ED標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合后由于空間位阻，不再能與酶受體(EA)結(jié)合，而游離的ED標(biāo)記的抗原上的ED可和EA結(jié)合，形成具有活性的酶，加入底物測(cè)定酶活性，酶活力的大小與標(biāo)本中抗原含量成比例。另一種為：酶增強(qiáng)免疫測(cè)定技術(shù)(EMIT)(美國(guó)專利：US3875011)，其基本原理是半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受到影響而活性被抑制。反應(yīng)后酶活力大小與標(biāo)本中的半抗原量呈一定的比例，從酶活力的測(cè)定結(jié)果就可推算出標(biāo)本中半抗原的量。兩種均相酶免技術(shù)都可以在生化儀上應(yīng)用，相比較而言，EMIT技術(shù)所開(kāi)發(fā)出來(lái)的試劑穩(wěn)定性優(yōu)于CDEIA，這是因?yàn)?，EMIT技術(shù)所用的酶——葡萄糖6磷酸脫氫酶的穩(wěn)定性優(yōu)于CDEIA技術(shù)所用的酶——β-D半乳糖苷酶的ED、EA片段。所以前者的所開(kāi)發(fā)試劑可以是液體的，而后者往往做成干粉形式。即便如此，基于EMIT技術(shù)的試劑盒往往其穩(wěn)定性也不夠理想，液體試劑的有效期并不長(zhǎng)，這與被標(biāo)記后的葡萄糖6磷酸脫氫酶的穩(wěn)定性有關(guān)。正是由于葡萄糖6磷酸脫氫酶的穩(wěn)定性欠佳，加上小分子標(biāo)記的影響，使得標(biāo)記物的穩(wěn)定性更差，從而導(dǎo)致試劑盒的有效期縮短。同時(shí)，使用EMIT技術(shù)的一個(gè)重要特點(diǎn)是葡萄糖6磷酸脫氫酶的活性中心必須能夠被抗體所抑制，且應(yīng)該有足夠的抑制效率，已到達(dá)一定的靈敏度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種具有熱穩(wěn)定性高、抑制率高的葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，該突變酶能夠作為多種小分子檢測(cè)試劑盒的原料，使所得試劑盒具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度。由于來(lái)自于Leuconostocmesenteroides的葡萄糖6磷酸脫氫酶(其氨基酸序列1即SEQID.No.1所示序列，其核苷酸序列為序列2即SEQID.No.2所示序列)具有較高的比酶活和較低Km值的特點(diǎn)(非-專利文件1：LeeW.T.LeeWT,FlynnTG,LyonsC,LevyHR."Cloningofthegeneandaminoacidsequenceforglucose6-phosphatedehydrogenasefromLeuconostocmesenteroides."J.Biol.Chem.266:13028-13034(1991))，因此該酶具有較高的應(yīng)用前景，將其選為原始序列，利用基因工程技術(shù)來(lái)進(jìn)行改造，以期提高其穩(wěn)定性。具體而言是利用隨機(jī)突變的方法，提高葡萄糖6磷酸脫氫酶的穩(wěn)定性，方法如下：(1)以葡萄糖6磷酸脫氫酶的序列為模版，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，建立突變文庫(kù)；(2)將所述突變文庫(kù)轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并利用96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)表達(dá)；(3)將細(xì)菌進(jìn)行原位裂解，并利用測(cè)活試劑，篩選出熱穩(wěn)定性高的葡萄糖6磷酸脫氫酶；本發(fā)明以核苷酸序列2為模板，設(shè)計(jì)SEQID.No.3所示序列即引物序列35’-ATGGTTTCTGAAATCAAAACCC-3’和SEQID.No.4所示序列即引物序列45’-ACCTTTGAAAACCCAAGCGTC-3’；進(jìn)行易錯(cuò)PCR，通過(guò)合理控制PCR反應(yīng)體系中錳離子的濃度，將突變頻率控制在1～2個(gè)核苷酸突變/1Kb核苷酸。將所獲得的含突變核苷酸的片段純化后，以含核苷酸序列2的pET-22b質(zhì)粒(載體)為模板進(jìn)行全質(zhì)粒PCR(WHOP-PCR)(非-專利文件2:Miyazaki,K.(2003).CreatingrandommutagenesislibrariesbymegaprimerPCRofwholeplasmid(MEGAWHOP).DirectedEvolutionLibraryCreation,Springer:23-28)，所得產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶DpnI進(jìn)行酶切消化，去除模板質(zhì)粒。之后，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗生素的LB固體平板上，所得克隆約為8000個(gè)，故該隨機(jī)突變所獲得的庫(kù)容量約為8000個(gè)。將所得克隆用涂布棒混勻后，收集于離心管中，抽質(zhì)粒，所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(ED3宿主菌或稱為宿主細(xì)胞)，以備下一步篩選用。接著，將上述轉(zhuǎn)化子接種于96孔板中，所用培養(yǎng)基為150ulLB/每孔，含氨芐抗生素，該孔板作為保留板。次日按照相同順序轉(zhuǎn)接至另一塊96孔板中，所用培養(yǎng)基為150ulLB/每孔，同時(shí)添加氨芐抗生素和IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于37℃下培養(yǎng)6小時(shí)，3800rpm離心收菌，去掉培養(yǎng)基，該孔板作為分析板。在分析板中加入150ul裂解液(100mMTris，pH8.0；0.4mg/ml脫氧膽酸鈉；0.8mg/mlCTAB；20mMKCl；80mMMgSO4)。于室溫下裂解半小時(shí)后，3800rpm離心15分鐘，取50ul裂解液于一塊新的96孔板中。另取50ul裂解液于96孔PCR板中，置于96孔PCR儀中，在50℃下加熱處理15分鐘，轉(zhuǎn)移至另一塊96孔板中。在上述兩塊中分別加入100ul的反應(yīng)液(Tris，100mM，pH7.4；葡萄糖溶液，100mM；NADP，5mM；ATP，5mM；MgCl2，5mM；己糖激酶，10KU/L；BSA，0.05mg/ml)。通過(guò)30分鐘的顯色，利用酶標(biāo)儀記錄其340nm處吸光值。通過(guò)計(jì)算兩者吸光度的比值，判斷熱處理后的粗酶液的殘留酶活比例。對(duì)于熱穩(wěn)定性提高了的突變株，其理論上的酶活殘留比例將較野生型高。本發(fā)明通過(guò)對(duì)8000多個(gè)突變株的篩選后，總共篩選獲得了3個(gè)熱穩(wěn)定性有所提高的突變株。經(jīng)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)突變株的突變序列分別為：突變株A：131G→T，突變株B：131G→T，956G→T，突變株C：1045G→T；相應(yīng)的氨基酸突變分別為：突變株A：44G→V，突變株B：44G→V，319G→V，突變株C：349D→Y；通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)突變株總共有三個(gè)位點(diǎn)的突變，即44G→V，319G→V，349D→Y突變，因此，為了了解每個(gè)突變位點(diǎn)的影響，額外構(gòu)建了第四個(gè)突變株D：319G→V。再分別對(duì)四個(gè)突變株進(jìn)行表達(dá)純化以及酶學(xué)性質(zhì)驗(yàn)證。最終發(fā)現(xiàn)，單位點(diǎn)突變株A、C、D對(duì)熱穩(wěn)定性的提高非常有限，即T50較野生型均提高小于0.5℃，其中突變株C還使得比酶活損失約50％，雙位點(diǎn)突變株的T50較野生型提高約3.5℃，明顯較44位點(diǎn)和319位點(diǎn)單獨(dú)突變的和要高，這推測(cè)可能是由于一定的協(xié)同作用使得穩(wěn)定性有較大幅地提高。鑒于此，選擇突變株B：44G→V，319G→V作為后續(xù)模版。考慮到該酶可用于均相酶免技術(shù)，因此考慮合適的小分子偶聯(lián)位點(diǎn)也十分重要，一個(gè)好的酶應(yīng)當(dāng)是具有較高的比酶活，且在偶聯(lián)了小分子后其比酶活、穩(wěn)定性等均不會(huì)有太大的損失，更重要的是，當(dāng)相應(yīng)的小分子抗體與小分子-酶偶聯(lián)物結(jié)合后，能夠較大程度地抑制酶活，這樣才能使所開(kāi)發(fā)的試劑盒有較高的靈敏度。通過(guò)分析葡萄糖6磷酸脫氫酶的序列，該酶沒(méi)有含半光氨酸，因此可以考慮在該酶內(nèi)突變引入半胱氨酸，通過(guò)巰基可以定向偶聯(lián)小分子，在通過(guò)分析該酶的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)位于216位的絲氨酸處于底物結(jié)合位點(diǎn)附近，且絲氨酸與半胱氨酸結(jié)構(gòu)類似，可以考慮為突變位點(diǎn)。因此分別在野生型及突變株B的基礎(chǔ)上引入突變216S-C，獲得突變株E和F。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)新獲得的突變株進(jìn)行表達(dá)純化，以及相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其比酶活與野生型相差無(wú)幾。為了驗(yàn)證所獲得的突變株是否有抑制率，擬利用生物素、親和素系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證，眾所周知，生物素與親和素能夠特異性結(jié)合，且其具有非常高的親和力，應(yīng)用十分廣泛，其中生物素的分子量約243，相當(dāng)于小分子，而親和素的分子量約為240KD，由4個(gè)60KD的單體組成，相當(dāng)于抗體。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)突變株E具有50％左右的抑制率，而出人意料地，突變株F具有60％左右的抑制率，且穩(wěn)定性較高，因此突變株F具有較好的應(yīng)用前景。綜上可以獲得，本發(fā)明的一種葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，其為將具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列中的44位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸、319位的甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸獲得的葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，與突變前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列葡萄糖6磷酸脫氫酶相比，具有更高的熱穩(wěn)定性。更進(jìn)一步的，本發(fā)明的一種葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，其為將具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列中的44位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸、319位的甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸、以及216位的絲氨酸突變?yōu)榘牍獍彼岖@得的葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，與突變前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列葡萄糖6磷酸脫氫酶相比，具有更高的熱穩(wěn)定性及抑制率。本發(fā)明還提供一種編碼上述葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體的基因。本發(fā)明所提供的葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，具有比酶活高、熱穩(wěn)定性好、抑制率高等特點(diǎn)，適合應(yīng)用于基于均相酶免試劑盒的開(kāi)發(fā)。這里值得說(shuō)明的是，本發(fā)明還提供一種包含上述葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體的基因的重組載體，本發(fā)明所使用的載體為pET-22b；本發(fā)明還提供一種包含上述重組載體的宿主細(xì)胞，本發(fā)明的宿主菌(宿主細(xì)胞)為BL21(DE3)。根據(jù)一般常識(shí)，任何簡(jiǎn)單的進(jìn)行載體更換，如pET-20b，pET-28b，pET-32a，pQE30，pTrc99a等，或者進(jìn)行宿主菌更換，如Rosetta，Origami，M15等，都應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為具有相同的技術(shù)效果，都將被認(rèn)為落入權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。任何在突變酶的N端或C端添加純化標(biāo)簽，已經(jīng)信號(hào)肽的行為，也應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為落入權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。作為一般地，可以利用已經(jīng)公知的酶的表達(dá)純化技術(shù)來(lái)進(jìn)行果糖氨基酸氧化酶的制備。例如，接種相應(yīng)的突變株菌種，待OD600生長(zhǎng)至0.5～1時(shí)，進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，此時(shí)為了有利于其表達(dá)，可以選擇低溫誘導(dǎo)，如25℃，20℃，16℃等，根據(jù)誘導(dǎo)溫度及表達(dá)情況，確定最適的誘導(dǎo)時(shí)間，以獲得最佳的表達(dá)量。表達(dá)之后可以利用常規(guī)方法進(jìn)行離心，超聲破碎，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)量等。至于純化時(shí)，可以利用重組酶所帶的標(biāo)簽選擇相應(yīng)的方法。例如，若重組質(zhì)粒含有His-tag，可以利用鎳柱進(jìn)行親和純化。術(shù)語(yǔ)解釋：抑制率：抗體與小分子-酶偶聯(lián)物結(jié)合后，對(duì)酶活的抑制比例，抑制率越高，越有利于基于競(jìng)爭(zhēng)法的試劑盒的靈敏度。T50:是指在該溫度下孵育30min后，所殘留的酶活為原來(lái)50％時(shí)的溫度，用于評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性，溫度越高穩(wěn)定性越好，反之亦然。小分子：是指分子量在100～2000之間，優(yōu)選200～1000之間的小分子化合物，包括但不限于臨床上檢測(cè)常用的激素和藥物等。偶聯(lián)：某一化合物通過(guò)共價(jià)鍵與酶上的氨基、羧基、巰基等相連。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1突變文庫(kù)的構(gòu)建1、對(duì)于序列2所示的序列，利用全基因合成的方法進(jìn)行合成(去除終止密碼子)，并克隆至pET-22b載體上，所用酶切位點(diǎn)為NdeI和XhoI。以此得到的質(zhì)粒pET-G6PD為以下易錯(cuò)PCR和WHOP-PCR的模板。2、易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系及條件表1反應(yīng)體系為100ul：名稱體積(ul)dNTPMixture(各2.5mM)8dTTP(100mM)0.8dCTP(100mM)0.810*PCRBuffer10上游引物(5mM)，序列320下游引物(5mM)，序列420MnCl2(5mM)10Mg2+(25mM)14Taq酶(5U/ul)1模板(10ng/ul)5水12反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃2min；30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。上述的MnCl2用量可以適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，以便獲得合適的突變頻率，即1～2核苷酸突變/1Kb核苷酸。3、WHOP-PCR反應(yīng)體系及條件將易錯(cuò)PCR獲得的片段，大小約1.4Kb進(jìn)行膠回收后，用作下一輪WHOP-PCR的引物。表2WHOP-PCR反應(yīng)體系，50ul：WHOP-PCR反應(yīng)條件：98℃30sec；98℃10sec；60℃10sec；72℃2.5min；24個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。4、酶切及轉(zhuǎn)化在50ul的WHOP-PCR的產(chǎn)物加入1ul的DpnI進(jìn)行酶切，于37℃下反應(yīng)2小時(shí)，以徹底除去模板DNA。將上述酶切后的產(chǎn)物分5管轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，次日得到總共8000個(gè)單克隆以上的庫(kù)容量。實(shí)施例2突變文庫(kù)的篩選1、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、表達(dá)將所得克隆用涂布棒混勻后，收集于離心管中，抽質(zhì)粒，所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(ED3)，以備下一步篩選用。接著，將上述轉(zhuǎn)化子接種于96孔板中，其中最后一個(gè)孔接種野生型菌株以作為對(duì)照，所用培養(yǎng)基為150ulLB/每孔，含氨芐抗生素，該孔板作為保留板。次日按照相同順序轉(zhuǎn)接至另一塊96孔板中，所用培養(yǎng)基為150ulLB/每孔，同時(shí)添加氨芐抗生素和IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于37℃下培養(yǎng)6小時(shí)，3800rpm離心收菌，去掉培養(yǎng)基，該孔板作為分析板。2、篩選在分析板中加入150ul裂解液(100mMTris，pH8.0；0.4mg/ml脫氧膽酸鈉；0.8mg/mlCTAB；20mMKCl；80mMMgSO4)。于室溫下裂解半小時(shí)后，3800rpm離心15分鐘，取50ul裂解液于一塊新的96孔板中。另取50ul裂解液于96孔PCR板中，置于96孔PCR儀中，在50℃下加熱處理15分鐘，轉(zhuǎn)移至另一塊96孔板中。在上述兩塊中分別加入100ul的反應(yīng)液(Tris，100mM，pH7.4；葡萄糖溶液，100mM；NADP，5mM；ATP，5mM；MgCl2，5mM；己糖激酶，10KU/L；BSA，0.05mg/ml)。通過(guò)30分鐘的顯色，利用酶標(biāo)儀記錄其吸光值。通過(guò)計(jì)算兩者吸光度的比值，判斷熱處理后的粗酶液的殘留酶活比例。對(duì)于熱穩(wěn)定性提高了的突變株，其理論上的酶活殘留比例將較野生型高。本發(fā)明通過(guò)對(duì)8000多個(gè)突變株的篩選后，總共篩選獲得了3個(gè)熱穩(wěn)定性有所提高的突變株。經(jīng)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)突變株的突變序列分別為：突變株A：131G→T，突變株B：131G→T，956G→T，突變株C：1045G→T；相應(yīng)的氨基酸突變分別為：突變株A：44G→V，突變株B：44G→V，319G→V，突變株C：349D→Y；通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)突變株總共有三個(gè)位點(diǎn)的突變，即44G→V，319G→V，349D→Y突變，因此，為了了解每個(gè)突變位點(diǎn)的影響，額外構(gòu)建了第四個(gè)突變株D：319G→V。將所獲得的突變株A，B，C，D分別轉(zhuǎn)化至BL21(ED3)中，并接種于LB培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達(dá)，所獲得的菌體用于純化，其方法為常規(guī)方法，如由于表達(dá)時(shí)帶有6*His標(biāo)簽，利用鎳柱即可純化。實(shí)施例3葡萄糖6磷酸脫氫酶的酶活測(cè)定及熱穩(wěn)定性分析經(jīng)純化后的葡萄糖6磷酸脫氫酶，在100mMTris，pH8.0的緩沖液中稀釋成約0.1ug/ml。取50ul該葡萄糖6磷酸脫氫酶于96孔PCR中，于40～50℃范圍內(nèi)選擇8個(gè)梯度熱處理30min，4℃保存。將經(jīng)熱處理過(guò)的50ul葡萄糖6磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)移至96孔板上，同時(shí)取未加熱過(guò)的葡萄糖6磷酸脫氫酶50ul于同一塊96孔板上。于37℃保溫10min。加入事先已孵育至37℃的反應(yīng)液(Tris，100mM，pH7.4；葡萄糖溶液，100mM；NADP，5mM；ATP，5mM；MgCl2，5mM；己糖激酶，10KU/L；BSA，0.05mg/ml)，于37℃下反應(yīng)30min。利用酶標(biāo)儀記錄其在340nm處的吸光度。將熱處理過(guò)的葡萄糖6磷酸脫氫酶的吸光值除以未熱處理過(guò)的葡萄糖6磷酸脫氫酶的吸光值，所得數(shù)值即為在該溫度下的殘留酶活比例，根據(jù)不同溫度下的殘留酶活比例，計(jì)算T50，如表3所示。表3隨機(jī)突變獲得的突變株的熱穩(wěn)定性分析實(shí)施例4216位半胱氨酸的點(diǎn)突變的引入第一輪PCR分別以野生型及突變株B為模板，分別用含有點(diǎn)突變的引物序列3(5’-ATGGTTTCTGAAATCAAAACCC-3’)、序列5即SEQID.No.5(5’-TCTTTGTCGGTGAAACATTCCGGTTTTTCC-3’)作為上游引物擴(kuò)增，獲得含有點(diǎn)突變的目的片段。PCR體系為50ul：表4PCR體系PCR反應(yīng)條件為：98℃30sec；98℃10sec；60℃10sec；72℃30sec；30個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。所得目的兩個(gè)目的片段經(jīng)純化后，分別用于下一輪WHOP-PCR的引物，其模版分別為野生型和突變株A，其具體反應(yīng)體系見(jiàn)表5表5WHOP-PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件為：98℃30sec；98℃10sec；60℃10sec；72℃2.5min；24個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。在50ul的WHOP-PCR的產(chǎn)物中加入1ul的DpnI進(jìn)行酶切，于37℃下反應(yīng)2小時(shí)，以徹底除去模板DNA。然后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)突變株E：216S→C，突變株F：216S→C，44G→V，319G→V，均與理論序列相符。將所獲得的突變株E、F分別接種于LB培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達(dá)，所獲得的菌體用于純化，其方法為常規(guī)方法，如由于表達(dá)時(shí)帶有6*His標(biāo)簽，利用鎳柱即可純化。對(duì)突變株E、F進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，具體先表6所示。表6突變株E、F的熱穩(wěn)定性分析實(shí)施例5抑制率實(shí)驗(yàn)將純化好的突變株E、F加入1mMTCEP處理30min以上，再脫鹽至50mMPB，pH8.0的緩沖液中，備用。將小分子BMCC-Biotin(Thermo,貨號(hào)21900)用DMSO溶解至2mg/ml，備用。按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)：表7:偶聯(lián)反應(yīng)體系將反應(yīng)1和反應(yīng)2置于室溫反應(yīng)至少30min。再將其透析至25mMTris，pH7.4的緩沖液中，并將其稀釋至酶活1000～2000U/L范圍內(nèi)備用。按照下表進(jìn)行抑制率實(shí)驗(yàn)。表8:抑制率實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系由表8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，利用生物素親和素系統(tǒng)驗(yàn)證突變株E和突變株F時(shí)，均有一定的抑制率，其中，突變株E有50％左右的抑制率，突變株F則更高，將近60％的抑制率，這種抑制率的提高可能與另外兩個(gè)突變位點(diǎn)有關(guān)，其使得結(jié)構(gòu)更加緊密，親和素結(jié)合后遮蔽活性中心的程度更高。這種更高的抑制率有利于試劑盒的靈敏度的提高。經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)分析可知，突變株F具有較高的熱穩(wěn)定性，相比野生型的T50提高了約3℃～4℃，且其比沒(méi)有并沒(méi)有明顯的下降，更重要的是其具有較高的抑制率。因此，基于本發(fā)明所提供的葡萄糖6磷酸脫氫酶突變體，可應(yīng)用于均相酶免技術(shù)，開(kāi)發(fā)出具有高靈敏度，高穩(wěn)定性的試劑盒。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3