本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種癌癥靶向基因-溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

重組包括不同方法：1、利用限制性切酶將不同DNA切開，再用連接酶把不同DNA片段聯(lián)接起來，稱為DNA重組；2.、利用DNA片段兩端DNA含有相同(或叫同源)DNA序列，進行同源重組，即利用DNA片段兩端的DNA片段的順序相同，將一個DNA片段替換到另一個DNA片段。

在當今癌癥治療領(lǐng)域中，由劉新垣院士創(chuàng)建了OV-gene治療策略，即癌癥的靶向基因-病毒治療策略(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy，CTGVT)，也就是說將抗癌基因加入到溶瘤病毒載體(Oncolytic Virus，OV)中。將癌癥的溶瘤病毒治療與癌癥的基因治療相結(jié)合的方法是治療癌癥的一個革命性的學(xué)說，可以達到全殲移植性腫瘤的作用，其中重點在于將非復(fù)制型病毒載體(Ad)更換成可復(fù)制型的溶瘤病毒載體(Oncolytic Virus，OV)。Ad無靶向性，無復(fù)制能力，故抗癌作用很弱，而OV能在癌細胞中復(fù)制數(shù)萬倍，它所攜帶的抗癌基因也隨之復(fù)制數(shù)萬倍，故抗癌能力大增，其結(jié)果是OV-gene的抗癌效果遠遠超過OV或Ad-gene。用OV載體取代Ad載體，在癌癥治療中是非常重要的革命性改進。然而，過去構(gòu)建一個癌癥靶向基因-溶瘤病毒需在細胞中進行同源重組，要花時數(shù)月，且錯誤很多，野生型多，需空斑純化，時間最長可達半年，甚至到最后還純化不到所需溶瘤病毒，以失敗告終，大大妨礙科學(xué)工作。

腺病毒在正常細胞和癌細胞中都能復(fù)制，不能針對癌細胞進行選擇性復(fù)制。通過對腺病毒進行更換啟動子、突變等修飾操作，獲得溶瘤腺病毒，其 能夠特異性地在癌細胞中復(fù)制，而不對正常細胞產(chǎn)生影響。溶瘤腺病毒構(gòu)建過程中最困難的一步，是包含有人工修飾的腺病毒片段的穿梭的小質(zhì)粒與腺病毒大質(zhì)粒進行同源重組的步驟，傳統(tǒng)的這一步驟在細胞中進行，其效率低，花費時間長。由Quantum Biotechnology基因公司創(chuàng)造了AdEasy^TM方法，將這一同源重組的構(gòu)建過程從細胞改到細菌(大腸桿菌BJ5183)中進行，因后者含重組酶很高，故效率高，成功率高，但AdEasy只能用于構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒的同源重組用于基因治療(Ad-gene)，目前仍未有高效的、能夠應(yīng)用于可復(fù)制的溶瘤腺病毒的同源重組的系統(tǒng)的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種使用在細菌中進行同源重組取代在細胞中進行同源重組的方法，以獲得溶瘤病毒攜帶抗癌基因的質(zhì)粒和病毒(即癌癥的靶向基因-病毒治療，Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy，CTGVT)。CTGVT乃將抗癌基因加入到溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)構(gòu)建而成，故亦即OV-gene治療。所述方法包括四個步驟。具體地說，第一步構(gòu)建穿梭質(zhì)粒(pSW-X)，第二步利用在細菌中進行同源重組，在AdEasy-1上加入E3區(qū)，構(gòu)建大質(zhì)粒pBHG581，第三步將pSW-X與大質(zhì)粒pBGH581在BJ5183細菌中進行同源重組，獲得pCTGVT(pOV-gene)，然后進一步用PacI線性化，在HEK293細胞中包裝，獲得所需溶瘤腺病毒。

因此本發(fā)明的第一個目的在于提供一種癌癥靶向基因-溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第二個目的在于提供根據(jù)上述構(gòu)建方法制備獲得各種不同改進的癌癥靶向基因-溶瘤腺病毒。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，一種癌癥靶向基因-溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法，所述方法包括在細菌中進行同源重組取代在細胞中進行同源重組，以獲得溶瘤腺病毒攜帶抗癌基因的質(zhì)粒和病毒。

根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括以下步驟：

(A)穿梭質(zhì)粒pSW-X的構(gòu)建：在pXC2中，將五型腺病毒基因組上的正常E1A或E1B改為能提高五型腺病毒癌癥靶向性的mE1A或mE1B(m代表mustated E1A或E1B，包括在改造E1A或E1B或更換其啟動子或在其中加基因)，用XhoI和MfeI酶切，然后與XhoI和MfeI切開的pShuttle相結(jié)合，構(gòu)建獲得pSW-X；

(B)腺病毒大質(zhì)粒pBGH581的構(gòu)建：將含腺病毒E3區(qū)的pBHGE3用HindIII酶切，然后與經(jīng)SpeI或SrfI線性化的pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，獲得腺病毒大質(zhì)粒pBHG581；

(C)pOV-gene的構(gòu)建：將步驟(A)中所述pSW-X用PmeI線性化后，與步驟(B)中所述pBHG581共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，獲得pOV-gene。

(D)將步驟(C)中所述pOV-gene經(jīng)PacI線性化，轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中包裝，獲得癌癥靶向基因-溶瘤腺病毒。

根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，根據(jù)上述構(gòu)建方法制備獲得的溶瘤腺病毒攜帶抗癌基因的質(zhì)粒和病毒。

有益效果：

本發(fā)明主要是不同產(chǎn)品的構(gòu)建方法，即構(gòu)建帶有抗癌基因、有靶向性又能復(fù)制的CTGVT或OV-gene，其中抗癌基因是現(xiàn)有的，主要就是要構(gòu)建有靶向性、能復(fù)制的CTGVT(OV-gene)，關(guān)鍵點是將過去的在HEK293細胞同源重組改為在BJ5183細菌中進行同源重組，過去在細胞中進行同源重組，效率低，錯誤率高，完成一個OV-gene的構(gòu)建需要幾個月，而細菌BJ5183含很高的重組酶，故重組效率高，含野生型腺病毒少或無(野生型Ad必需除去)，采用本發(fā)明方法構(gòu)建一個CTGVT(OV-gene)一般不到1個月即可完成，效率高，準確率高，解決了科學(xué)工作者的一個難題，使溶瘤病毒的構(gòu)建工作進度可大大地加快而準確地完成。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實施例1的pSW-X質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖2為本發(fā)明的實施例1的pBHG581通用型質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖3為本發(fā)明的實施例1的OV-gene的構(gòu)建示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例2的構(gòu)建示意圖。

圖5為本發(fā)明實施例3的構(gòu)建示意圖。

圖6為本發(fā)明實施例3的構(gòu)建示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1、

本發(fā)明的癌癥靶向基因-溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法的原理說明如下：

步驟一、pSW-X穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖1所示，在pXC2(市售)中，根據(jù)已知的現(xiàn)有技術(shù)，將五型腺病毒基因組上的正常E1A或E1B改為能提高五型腺病毒癌癥靶向性的mE1A或mE1B(m代表mustated E1A或E1B，即改造的E1A或E1B或替換其啟動子，也包括在mE1A或mE1B中加上基因)，用XhoI和MfeI酶切，然后與XhoI和MfeI切開的pShuttle(購自Agilent Technologies公司，6586bp)相結(jié)合，構(gòu)建獲得pSW-X(約9512bp)。

步驟二、pBHG58通用型腺病毒大質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖2所示，將含腺病毒E3區(qū)的pBHGE3(37436bp)用HindIII酶切，然后與經(jīng)SpeI或SrfI線性化的pAdEasy-1(購自Agilent Technologies公司，33442bp，只含小部分E3區(qū))共轉(zhuǎn)到大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，獲得可通用的腺病毒大質(zhì)粒pBHG581(即在pAdEasy中加入E3，即pAdEasy-E3)。在pBHGE3中含有很多HindⅢ，但只有HindⅢ兩旁內(nèi)有同源順序者，才能與AdEasy-1上SpeI與SrfI兩旁的DNA進行同源順序重組。

步驟三、pOV-gene的構(gòu)建

如圖3所示，將步驟一中構(gòu)建的pSW-X用PmeI線性化后，與步驟二中 構(gòu)建的通用型大質(zhì)粒pBHG581共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中進行重組，獲得pOV-gene，其帶有pSW-X中的抗癌基因及靶向的溶瘤腺病毒。將pOV-gene經(jīng)PacI線性化，切除Ori和Kana基因后，轉(zhuǎn)染到HEK293細胞(購自美國ATCC)中包裝，可獲得各種CTGVT(OV)策略改造的腺病毒抗癌藥物。

實施例2、溶瘤腺病毒Ad.RGD-hTERT-E1A(D24)-E1B(D55)-Gene的構(gòu)建(即帶RGD的CTGVT(OV-gene))。

2.1、背景介紹

5型腺病毒感染腫瘤細胞時通常是與細胞表面柯薩奇與腺病毒受體(CAR)結(jié)合(Bergelson，J.M.，Cunningham，J.A.，Droguett，G.，KurtJones，E.A.，Krithivas，A.，Hong，J.S.，Horwitz，M.S.，Crowell，R.L.，和Finberg，R.W.，1997，Isolation of a common receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses 2and 5，Science 275，1320-1323)，再經(jīng)由整合素結(jié)合到質(zhì)膜上內(nèi)化進入細胞(Wickham，T.J.，Mathias，P.，Cheresh，D.A.，和Nemerow，G.R.，1993，Integrins alpha v beta 3and alpha v beta 5promote adenovirus internalization but not virus attachment，Cell 73，309-319)。

部分癌癥干細胞表面CAR表達量顯著降低，影響腺病毒感染效率，導(dǎo)致傳統(tǒng)的癌癥基因治療策略的效果大為下降。利用pAdEasy-1質(zhì)粒體系在細菌(大腸桿菌BJ5183)中重組的方法，能夠便捷地獲得外殼纖維蛋白(Fiber)區(qū)修飾后的溶瘤腺病毒，例如插入一段含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)基序的短肽編碼序列，直接識別整合素并與之結(jié)合，從而增強其感染能力，提高其治療效果。

本實施例的構(gòu)建線路如圖4所示。

2.2、在纖維蛋白區(qū)插入編碼含有RGD基序短肽序列

pAdEasy-1經(jīng)EcoRI酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳并回收長度為9617bp的小片段。使用DNA連接酶令該小片段自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并以氨芐霉素篩選，獲得含有纖維蛋白區(qū)域的新質(zhì)粒，命名為pfiber。

設(shè)計引物在pfiber加上RGD，構(gòu)建pfiber-RGD。引物如下：

RGD-正向-1：5’-GCTTGAGGTTAACCTAAGCACT-3’(SEQ ID NO：1)；

RGD-反向-1：5’-AGTTGTGTCGCAGAAGCAATCTCCAC-3’(SEQ ID NO：2)；

RGD-正向-2：5’-GGAAACAGGATGTGATTGTCGTGGAG-3’(SEQ ID NO：3)；

RGD-反向-2：5’-AAATGACTTGAAATTTTCTGCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

以pfiber小質(zhì)粒為反應(yīng)的模板，分別以上述兩對引物進行PCR反應(yīng)并電泳回收兩種PCR產(chǎn)物。以這兩種PCR產(chǎn)物混合作為模板，并以RGD-正向-1與RGD-反向-2為引物進行PCR反應(yīng)并電泳回收產(chǎn)物，通過氨芐霉素篩選獲得含有RGD基序短肽編碼序列的新質(zhì)粒，命名為pfiber-RGD。

2.3、pAdEasy-1-RGD質(zhì)粒的構(gòu)建

以SrfI和PacI酶切pAdEasy-1質(zhì)粒，同時以EcoRI酶切pfiber-RGD質(zhì)粒，電泳回收上述兩種DNA片段，共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183中，利用同源序列區(qū)域(SrfI與EcoRI之間片段，PacI與EcoRI之間片段為同源臂)重組，并以氨芐霉素篩選獲得新質(zhì)粒，命名為pAdEasy-1-RGD。

2.4、pAdEasy-RGD-hTERT-D24-D55-Gene質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pAdEasy-1-RGD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株，獲得攜帶該質(zhì)粒的BJ5183新菌株并使用氯化銣法將其制備為感受態(tài)細胞。

按本申請圖1所述的方法，在市售獲得的pShuttle上加hTERT-D24-D55-gene(即mE1A或mE1B，實為Ad-hTERT-E1A(D24)-E1B(D55)-Gene，其中，D24即缺失E1A的24bp，但D55則為缺失E1B的55KDa gene)，構(gòu)建pShuttle-hTERT-D24-D55-gene。

以PmeI酶切含有治療基因表達框的穿梭質(zhì)粒pSW-X(pShuttle-hTERT-D24-D55-Gene)，并用去磷酸酶處理后，轉(zhuǎn)化上述含有pAdEasy-1-RGD質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細胞，以卡那霉素篩選鑒定從而獲得質(zhì) 粒pAdEasy-RGD-hTERT-D24-D55-Gene。

以PacI酶切質(zhì)粒pAdEasy-RGD-hTERT-D24-D55-Gene，去除原核表達元件Ori和Kana等并暴露反向末端重復(fù)序列(ITR)，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Effectene)將該片段轉(zhuǎn)染入人胚胎腎細胞HEK-293中產(chǎn)生重組溶瘤腺病毒顆粒Ad.RGD-hTERT-E1A(D24)-E1B(D55)-Gene。收集并擴增后，提取重組腺病毒DNA，進行PCR及測序分析，確定正確的病毒株，大量擴增后，使用氯化銫梯度離心純化病毒，-80℃保存待用。

實施例3、構(gòu)建OV5/11-gene(OV5/11表示由腺病毒5/11嵌合型鞭毛5/11型構(gòu)成的溶瘤病毒)。

3.1、背景介紹

目標：將溶瘤腺病毒的鞭毛由5型改為5/11嵌合型。

說明：5型腺病毒(Ad5)的受體為CAR，在腫瘤細胞中CAR受體含量較少，但Ad11的受體CD46含量較多，而決定腺病毒的靶向性為其鞭毛，故將Ad5的鞭毛改為Ad11型的融合鞭毛Ad5/11，就可大大提高其在腫瘤中的靶向性和抗癌效率。

本實施例的構(gòu)建線路如圖5和圖6所示。

3.2、Onco^Ad(5/11)-gene的構(gòu)建

3.2.1、嵌合型fiber5/11的構(gòu)建：

pAdEasy-1經(jīng)EcoRI酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳并回收長度為9617bp的小片段，使用Ligation High連接酶使小片段自連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)Trans-T并以氨芐霉素進行篩選，獲得含有5型腺病毒鞭毛區(qū)的新質(zhì)粒，命名為pfiber。采用常規(guī)的overlapPCR將fiber5的桿狀區(qū)域shaft區(qū)和頂端球狀蛋白區(qū)域knob區(qū)(133bp-1746bp)替換為fiber11型序列(133bp-975bp)。構(gòu)建基座區(qū)為5型而其鞭毛區(qū)域為11型的嵌合型fiber5/11，構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pfiber5/11(圖5)。

3.2.2、pAdEasy-fiber5/11質(zhì)粒的構(gòu)建：

用SrfI和PacI酶切pAdEasy-1質(zhì)粒，同時用EcoR1酶切pfiber5/11質(zhì)粒，電泳回收上述兩種DNA片段，共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中，利用同源序列區(qū)域(Srfl與EcoRI之間的片段為同源左臂，PacI與EcoRI之間的片段為同源右臂)進行同源重組，并以氨芐霉素篩選獲得含有5/11嵌合型fiber的pAdEasy，命名為pAdEasy-fiber5/11(圖5)。

3.2.3、pOV5/11-gene的構(gòu)建即pAdEasy-fiber5/11與pSW-X的結(jié)合：

用RbCl法制備含有pAdEasy-fiber5/11的感受態(tài)，然后再轉(zhuǎn)化用PmeI酶切線性化的pSW-X，在BJ5183中重組，以卡那霉素進行篩選鑒定從而獲得質(zhì)粒pAdEasy-fiber5/11-mE1A-mE1B-gene即pOV5/11-gene(圖6)。

3.2.4、OV5/11-gene病毒的構(gòu)建：

以PacI酶切質(zhì)粒pAdEasy-fiber5/11-mE1A-mE1B-gene，去除原核表達原件Ori和Kana等并暴露反向末端重復(fù)序列ITR，使用Effectene轉(zhuǎn)染試劑將該線性化的質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入HEK-293中產(chǎn)生重組溶瘤腺病毒顆粒Ad5F/11.mE1A-mE1B-gene。收集并擴增后，提取重組腺病毒基因組，進行PCR鑒定和測序分析，確定正確的病毒株，大量擴增后使用氯化銫梯度離心純化病毒，-80℃保存待用。