本發(fā)明屬于基因工程和生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：賴氨酸是一種及其重要的氨基酸，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、保健及醫(yī)藥領(lǐng)域。目前，賴氨酸的工業(yè)生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵法進行，工業(yè)常用的菌種包括谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌。在賴氨酸的生物合成過程中，二氨基庚二酸脫氫酶催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化反應(yīng)生成內(nèi)消旋的2,6-二氨基庚二酸，后者在二氨基庚二酸脫羧酶的作用下生成賴氨酸。因此，二氨基庚二酸脫氫酶是賴氨酸合成的關(guān)鍵酶，通過在谷氨酸棒桿菌(中國專利CN200980103315.6)或者大腸桿菌中(中國專利CN200880100226.1)過表達來源于谷氨酸棒桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶可以顯著的提高賴氨酸的產(chǎn)量。目前所有已知的二氨基庚二酸脫氫酶是輔酶NADPH-特異性的，即該酶僅能利用NADPH為底物，而不能利用NADH作為底物。但是在細胞內(nèi)，NADH的濃度遠遠大于NADPH，因此如果能夠找到或者構(gòu)建一種NADH-依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶，其有可能更高效的促進2,6-二氨基庚二酸的合成，提高賴氨酸的產(chǎn)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶，其來源于Pseudothermotogathermarum，其含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列或SEQIDNo.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸而不影響其生物活性的氨基酸序列。經(jīng)密碼子優(yōu)化改造，本發(fā)明提供了編碼上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶的基因，其核苷酸序列含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或SEQIDNo.2所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸。本發(fā)明提供了含有上述基因的生物材料，所述生物材料為載體、重組菌、細胞系或表達盒。優(yōu)選地，所述重組菌為重組谷氨酸棒桿菌或重組大腸桿菌。在本發(fā)明的實施例中，在大腸桿菌中表達本發(fā)明上述來源于Pseudothermotogathermarum的二氨基庚二酸脫氫酶的基因，檢測其催化活性和對輔酶NADH、NADPH的特異性，發(fā)現(xiàn)以NADH為底物其催化酶活達到116.9U/mg；能夠同時利用NADH、NADPH；在本發(fā)明的另一個實施例中，在谷氨酸棒桿菌中過表達本發(fā)明的二氨基庚二酸脫氫酶基因，發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量達到22.2g/L，顯著高于過表達NADPH依賴性二氨基庚二酸脫氫酶的谷氨酸棒桿菌；在大腸桿菌中過表達不同來源的二氨基庚二酸脫氫酶基因，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明二氨基庚二酸脫氫酶對賴氨酸產(chǎn)量有明顯的提高作用。因此，本發(fā)明提供了上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在制備內(nèi)消旋的2,6-二氨基庚二酸中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在制備賴氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在提高賴氨酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在制備藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的NADH依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶對催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化具有很高的活性，其能同時利用NADH和NADPH作為輔因子，且其對NADH的利用效率要遠高于NADPH，通過在谷氨酸棒桿菌或者大腸桿菌中過表達本發(fā)明所提供的二氨基庚二酸脫氫酶基因可以顯著的提高賴氨酸的產(chǎn)量，且其效果要優(yōu)于NADPH-依賴性的二氨基庚二酸脫氫酶。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1NADH-依賴型的二氨基庚二酸脫氫酶的表達及其催化性能驗證。本發(fā)明通過大量的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，來源于Pseudothermotogathermarum的二氨基庚二酸脫氫酶具有可能的NADH結(jié)合位點，其氨基酸序列分別如SEQIDNO.1所示?；赟EQIDNO.1的氨基酸序列，本發(fā)明設(shè)計了相應(yīng)的密碼子優(yōu)化的二氨基庚二酸脫氫酶基因，如SEQIDNO.2序列所示。將序列SEQIDNO.2合成后直接插入到pET-28a的NdeI和EcoRI雙酶切位點，所獲得的質(zhì)粒命名為pET-PTddh。以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因組為模板，以引物ddh-F(AAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCttaGACGTCGCGTGCGATCAG)和ddh-R(CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGatgACCAACATCCGCGTAGC)為引物進行PCR，獲得CGddh基因約1.0kb并進行PCR產(chǎn)物純化。將表達質(zhì)粒pET-28a利用NdeI和EcoRI雙酶切，再利用GibsonAssembly試劑盒(NEB)將CGddh片段連接到pET-28a上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pET-CGddh。將上述2個質(zhì)粒利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，在含50mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得重組菌，分別命名為BL21/pET-PTddh和BL21/pET-CGddh。將BL21/pET-CGddh、BL21/pET-PTddh在含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達到0.6(37℃，150rpm)，添加0.5mM的IPTG并繼續(xù)培養(yǎng)12h以誘導(dǎo)蛋白的表達。將菌體離心分離，并用100ml100mM的Tris-HCl(pH8.0)洗滌兩次，最后將菌體重懸于5ml的100mM的甘氨酸-NaOH緩沖液(pH10.5)。將所述重懸液利用超聲進行破碎，并離心獲得上清液(12000rpm，30分鐘)。利用蛋白純化試劑盒HisTrap(GE)分離純化二氨基庚二酸脫氫脫水酶。利用上述純化的二氨基庚二酸脫氫酶進行酶動力學(xué)分析。二氨基庚二酸脫氫酶的活性是通過反應(yīng)產(chǎn)生的NAD(P)H在340nm的吸光值進行測定，反應(yīng)體系包括：100mM的甘氨酸-NaOH(pH10.5)，2mM的輔酶NAD或者NADP，4mM的內(nèi)消旋-二氨基庚二酸鹽，100μg的酶。反應(yīng)在30℃反應(yīng)5min，測定其在340nm下的吸光值變化。酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1μM的NAD(P)H所需要的酶量(U)。實驗結(jié)果如表1所示。表1不同來源的二氨基庚二酸脫氫酶的酶活對比(單位U/mg)。CorynebacteriumglutamicumPseudothermotogathermarum以NADH為底物0.9116.9以NADPH為底物94.219.7由表1可以看出，兩種不同來源的二氨基庚二酸脫氫酶都能夠催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化，但其輔酶特異性不同。來自谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的二氨基庚二酸脫氫酶是一個嚴格的NADPH-依賴型的二氨基庚二酸脫氫酶，基本不能利用NADH。來源于Pseudothermotogathermarum的二氨基庚二酸脫氫酶能夠同時利用NADH和NADPH，且利用NADH的催化活力大于NADPH的催化活力。實施例2利用NADH-依賴型的二氨基庚二酸脫氫酶提高谷氨酸棒桿菌賴氨酸的產(chǎn)量將pET-PTddh和pET-CGddh分別用NdeI和EcoRI進行雙酶切后連接到質(zhì)粒pEC-K18(從Addgene購買)上，所獲得的質(zhì)粒命名為pEC-PTddh和pEC-CGddh。將這兩個質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌LC298中(電轉(zhuǎn)條件為電壓1.8KV，1mm電轉(zhuǎn)杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得重組菌，分別命名為LC/pEC-PTddh和LC/pEC-CGddh。將谷氨酸棒桿菌LC298以及上述兩株重組菌株分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72(30℃，200rpm)，檢測賴氨酸的產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(g/L)：葡萄糖100g，玉米漿10g，尿素4.5g，硫酸銨45g，磷酸二氫鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵10mg，四水硫酸錳10mg，β-丙氨酸5mg，煙酸5mg，硫胺素-鹽酸5mg，生物素0.3mg，碳酸鈣30g。發(fā)酵結(jié)果，谷氨酸棒桿菌LC298的賴氨酸的產(chǎn)量為16.2/L，重組菌LC/pEC-CGddh的賴氨酸產(chǎn)量為18.4g/L，重組菌LC/pEC-PTddh的賴氨酸產(chǎn)量為22.2g/L，說明過表達來源Pseudothermotogathermarum的NADH-依賴型二氨基庚二酸脫氫酶可以顯著提高賴氨酸的產(chǎn)量，且其效果優(yōu)于來源于Corynebacteriumglutamicum的NADPH-依賴型二氨基庚二酸脫氫酶。實施例3利用NADH-依賴型的二氨基庚二酸脫氫酶提高大腸桿菌賴氨酸的產(chǎn)量分別以pET-PTddh、pET-CGddh為模板，用引物S1-F(CCTGCAGGTCGACTCTAGAGGCTCGAGTGCGGCCGCAA)和S1-R(CAGCTATGACCATGATTACGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGG)為引物進行PCR，獲得約1.0kbPCR產(chǎn)物并進行純化。將pSTV28(TAKARA)EcoRI和BamHI進行雙酶切后利用，用GibsonAssembly試劑盒(NEB)將上述片段分別連接到pSTV28上，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pSTV-PTddh和pSTV-CGddh。將這兩個質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EC224中(電轉(zhuǎn)條件為電壓1.8KV，1mm電轉(zhuǎn)杯)，含50mg/L的氯霉素LB平板上篩選獲得重組菌，分別命名為EC/pSTV-PTddh和EC/pSTV-CGddh。將大腸桿菌EC224以及兩株重組菌株分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72(32℃，200rpm)，檢測賴氨酸的產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為(g/L)：葡萄糖100g，酵母粉10g，硫酸銨42g，磷酸二氫鉀15g，七水硫酸鎂1.0g，七水硫酸亞鐵10mg，四水硫酸錳10mg，碳酸鈣30g。發(fā)酵結(jié)果，大腸桿菌EC224的賴氨酸的產(chǎn)量為22.4/L，重組菌EC/pSTV-CGddh的賴氨酸產(chǎn)量為24.8g/L，重組菌EC/pSTV-PTddh的賴氨酸產(chǎn)量為27.5g/L，說明過表達來源Pseudothermotogathermarum的NADH-依賴型二氨基庚二酸脫氫酶可以顯著提高賴氨酸的產(chǎn)量，且其效果優(yōu)于來源于Corynebacteriumglutamicum的NADPH-依賴型二氨基庚二酸脫氫酶。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3