本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自然界中已知的以異戊二烯為骨架的萜類化合物超過65000種，包括單萜、倍半萜、二萜，多萜等。萜類化合物在細(xì)胞中具有很多元化的生理功能，比如植物中促進(jìn)光吸收的類胡蘿卜素，維持細(xì)胞脂膜流動性的類固醇類化合物。隨著全球石油資源的枯竭，石油副產(chǎn)物得到的異戊二烯成本越來越高。自然界中的異戊二烯在是以氣體形式從植物葉片釋放出來，無法直接從自然界中收集利用。異戊二烯為結(jié)構(gòu)單位的萜類化合物具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，獲得途徑有以下幾種：天然產(chǎn)物提取、化學(xué)合成、酶法合成等。比如青蒿素、紫杉醇和人參皂苷可分別從青蒿、紅豆杉和丹參中提取。但是植物生長緩慢，化合物含量較低?；瘜W(xué)合成法合成萜類化合物，由于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，需要繁多的氧化還原步驟以及保護(hù)和去保護(hù)步驟，成本高產(chǎn)品得率低。以上兩種方法因其得率太低無法滿足市場需求。隨著細(xì)胞代謝工程的發(fā)展，以工程菌株為對象，運(yùn)用遺傳操作技術(shù)對代謝途徑進(jìn)行改造，生產(chǎn)各種有工業(yè)、醫(yī)藥價(jià)值的化合物，是實(shí)現(xiàn)低成本綠色制造的有效途徑。大腸桿菌的遺傳背景清晰，傳代快，易培養(yǎng)，操作手段成熟，是實(shí)現(xiàn)異戊二烯類化合物生物制造的理想細(xì)胞工廠。萜類化合物都是從基本的五碳化合物二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)和異戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)兩個(gè)化合物為前體得到的。五碳化合物的生物合成有兩條途徑：甲羥戊酸(the mevalonate pathway,MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway，MEP)途徑。MEP途徑的理論轉(zhuǎn)化率(30.2％)高于MVA途徑的理論轉(zhuǎn)化率(25.2％)。大腸桿菌為生產(chǎn)菌株本身具有MEP途徑避免引入過多的外源酶影響菌體生長MEP途徑以糖的中間代謝物丙酮酸和3-磷酸甘油醛為前體，依次在在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-deoxy-D-xylulose-5-phpsphate synthase,DXS)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXP reductoisomerase,DXR)、4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol synthase，ispD)、4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸合成酶(4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase,ispE)、2-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環(huán)二磷酸合成酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synhase,ispF)的催化下得到2-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環(huán)二磷酸，在(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate synthase,ispG)的作用下轉(zhuǎn)化成(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate,HMBPP)；最后一步是HMBPP還原酶(HMBPP reductase,ispH)催化還原底物脫羥基生成IPP和DMAPP。研究顯示替換不同來源的ispG基因能夠促進(jìn)IPP和DMAPP及下游萜類化合物的積累，是MEP代謝途徑中最重要的遺傳操作靶位點(diǎn)。因此如何獲得酶活性質(zhì)優(yōu)良的(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶以及優(yōu)化得到該酶最優(yōu)表達(dá)量兩大要素對異戊二烯及萜類化合物的生產(chǎn)有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶及其編碼基因和應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有的異戊二烯為骨架的萜類化合物方法存在的氧化還原步驟繁瑣，成本高，產(chǎn)品得率低的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶，所述(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶為：

由SEQ ID NO：2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

將SEQ ID NO：2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶活性的由SEQ ID NO：2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)而衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶的編碼基因，所述編碼基因的序列為SEQ ID NO：1。

進(jìn)一步，所述編碼基因還包括：

序列SEQ ID NO：1的DNA分子雜交且編碼(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶蛋白的DNA分子；

與DNA分子具有90％以上的同源性且編碼(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶蛋白的DNA分子。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有所述編碼基因的全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列SEQ ID NO：3，另一條引物序列SEQ ID NO：4。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有所述編碼基因的表達(dá)盒。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為在載體pSB1s的多克隆位點(diǎn)插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

進(jìn)一步，所述重組菌為所述編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述編碼基因的密碼子優(yōu)化方法，所述密碼子優(yōu)化方法在用于該蛋白表達(dá)的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述編碼基因在制備萜類化合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶及其編碼基因和應(yīng)用，以集胞藻總DNA為模板，用PCR擴(kuò)增獲得一個(gè)編碼(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶的新基因SynispG。將SynispG基因克隆到原核表達(dá)載體pSB1s質(zhì)粒上，在大腸桿菌中進(jìn)行(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶(SynIspG)的高效表達(dá)，并且通過稀有密碼子優(yōu)化的手段對蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行優(yōu)化。獲得的進(jìn)化的重組(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶蛋白可以催化(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯生成二甲基烯丙基焦磷酸和異戊烯焦磷酸，與大腸桿菌的ispG比較，增強(qiáng)表達(dá)SynIspG蛋白的細(xì)胞產(chǎn)鏈孢紅素的產(chǎn)量提高1.7倍。提高M(jìn)EP的上下游基因dxs和idi，使細(xì)胞通量增強(qiáng)的情況下，蛋白表達(dá)量優(yōu)化后的SynIspG使細(xì)胞產(chǎn)鏈孢紅素的產(chǎn)量提高1.9倍。說明SynispG基因所編碼的IspG蛋白具有更高的酶活性，具有較高的應(yīng)用前景及開發(fā)價(jià)值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的SynispG的PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的重組質(zhì)粒上SynispG的PCR鑒定結(jié)果示意圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的工程菌的蛋白表達(dá)SDS-PAGE圖譜示意圖；

圖中：pSB1s-SynispG-036/PXI，pSB1s-XI-036/PXI，pSB1s-SynispG-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG6a-036/PXI。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的基因工程菌pSB1s-EcispG036/PXI(1)和pSB1s-SynispG036/PXI(2)的鏈孢紅素產(chǎn)物的特征吸收峰442nm峰值分析示意圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的基因工程菌pSB1s-XI-036/PXI(1),pSB1s-XI-SynispG-036/PXI(2)，pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI(3)，pSB1s-XI-SynispG6a-036/PXI(4)和的鏈孢紅素產(chǎn)物的特征吸收峰442nm峰值分析示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1、(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯合酶的制備及功能驗(yàn)證

一、SynispG基因的PCR擴(kuò)增

集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)基因組(本實(shí)驗(yàn)室保存)總DNA作為模板，以6803ispG-sbfI-F和6803ispG-AscI-R為引物，以6803ispG-sbfI-F-3A和6803ispG-AscI-R為引物，以6803ispG-sbfI-F-6A和6803ispG-AscI-R為引物，以6803ispG-BspHI-F和6803ispG-SacI-R為引物，高保真TransStartFastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄為AP221)PCR擴(kuò)增三段SynispG基因，分別為SynispG-1，SynispG-3a，SynispG-6a和SynispG。引物序列如下：

6803ispG-sbfI-F：

Catacctgcaggatggtaaccgcttccctg

6803ispG-sbfI-F-3A：

Catacctgcaggatgaaagtaaccgcttccctg

6803ispG-sbfI-F-6A：

Catacctgcaggatgaaaaaagtaaccgcttccctg

6803ispG-AscI-R：

CataggcgcgccttaagggtcaacccaacggccatC

6803ispG-BspHI-F：

Catatcatggtaaccgcttccctgccgac

6803ispG-SacI-R：

CataGAGCTCttaagggtcaacccaacggc

PCR程序?yàn)椋?/p>

PCR擴(kuò)增出1212bp左右的片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示(圖1中，泳道M為DNA Marker，泳道1-3道均為SynispG-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4-6道均為SynispG-3a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，7-9道均為SynispG-6a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，10-12道均為SynispG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，回收后經(jīng)過SbfI/AscI雙酶切后連接到克隆載體上，篩選鑒定陽性克隆，并進(jìn)行序列測定；測序結(jié)果表明，克隆得到的DNA序列如序列表中序列SEQ ID NO：1所示，序列表中的序列SEQ ID NO：1由1212個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID NO：2由402個(gè)氨基酸殘基組成。將該基因命名為SynispG，將其編碼的蛋白命名為SynIspG。

克隆得到的DNA序列如序列表中序列SEQ ID NO：3所示，序列表中的序列SEQ ID NO：3由1215個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID NO：4由403個(gè)氨基酸殘基組成。將該基因命名為SynispG-3a，將其編碼的蛋白命名為SynIspG-2。

克隆得到的DNA序列如序列表中序列SEQ ID NO：5所示，序列表中的序列SEQ ID NO：5由1218個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列SEQ ID NO：6所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID NO：6由404個(gè)氨基酸殘基組成。將該基因命名為SynispG-6a，將其編碼的蛋白命名為SynIspG-3。

二、含有SynispG的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述得到的SynispG-1，SynispG-3a，SynispG-6a PCR擴(kuò)增片段用SbfI和AscI酶切，回收目的片段；同時(shí)用SbfI和AscI酶切載體pSB1s(pSB1s載體為本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建，其特性為pSC101origin,araBAD promoter,Str^R.質(zhì)粒上有大腸桿菌的dxs、idi基因)回收載體大片段；將上述得到的SynispGPCR擴(kuò)增片段用BspHI和SacI酶切，回收目的片段；同時(shí)用NcoI和SacI酶切載體pSB1s(pSB1s載體為本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建，其特性為pSC101origin,araBAD promoter,Str^R.)回收載體大片段；將回收的目的片段與回收的載體大片段16℃連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒用CaCl₂法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自Takara，產(chǎn)品目錄號為D9057A)。單菌落振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒用進(jìn)行PCR鑒定，使用idi-TAA-F和和pBAD-R序列為引物、使用6803ispG-BspHI-F和pBAD-R序列為引物，用高保真TransStartFastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄為AP221)PCR擴(kuò)增基因。引物序列如下：

idi-TAA-F：gaaaacgattatctgcatttac

pBAD-R：aattctgttttatcagaccgcttct

PCR程序?yàn)椋?/p>

PCR擴(kuò)增出1312-1212bp左右的片段，鑒定結(jié)果如圖4所示(圖4中，泳道M為DNA Marker，泳道1-2道均為SynispG-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3-4道均為SynispG-3a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道5-6道均為SynispG-6a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以上條帶理論大小1312bp，泳道7-8道均為SynispG的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以上條帶理論大小112bp)，從圖中可見，獲得了1312bp或1212左右的PCR條帶，大小正確。對上述四個(gè)單克隆的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，克隆得到的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，序列表中的SEQ ID NO：1由1212個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)。將重組載體命名為pSB1s-XI-SynispG?？寺〉玫降腄NA序列如序列表中的SEQ ID NO：3所示，序列表中的SEQ ID NO：3由1215個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中SEQ ID NO：4所示的蛋白質(zhì)。將重組載體命名為pSB1s-XI-SynispG-3a。克隆得到的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO：5所示，序列表中的SEQ ID NO：5由1218個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中SEQ ID NO：6所示的蛋白質(zhì)。將重組載體命名為pSB1s-XI-SynispG-6a?？寺〉玫降腄NA序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，序列表中的SEQ ID NO：1由1212個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)。將重組載體命名為pSB1s-SynispG。

三、重組表達(dá)SynIspG蛋白的基因工程菌的構(gòu)建及SynIspG蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pSB1s-XI-SynispG、pSB1s-XI-SynispG-3a、pSB1s-XI-SynispG-6a和pSB1s-SynispG用氯化鈣法轉(zhuǎn)化含有pLY036報(bào)告質(zhì)粒(p15A origin,tac promoter,Cm^R,Anabaena sp.crtEB,RhodobactersphaeroidescrtI,E.coli idi，可將前體IPP&DMAPP轉(zhuǎn)化為鏈孢紅素)的大腸桿菌PXI(BW25113pgiP_T5-idiP_T5dxs實(shí)驗(yàn)室保存菌株)，得到基因工程菌pSB1s-XI-SynispG-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG6a-036/PXI和pSB1s-SynispG-036/PXI。鏈霉素和氯霉素雙抗性篩選培養(yǎng)，挑取單菌落37℃振蕩培養(yǎng)過夜以獲得飽和培養(yǎng)，1％接種于含鏈霉素(50g/ml)和氯霉素(17g/ml)雙抗性的ZYM-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含終濃度0.2％的阿拉伯糖)中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)后，離心收集菌體，制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3(圖3中，泳道M為Page Ruler；泳道1為pSB1s-SynispG036/PXI的全細(xì)胞；泳道2為pSB1s-XI036/PXI的全細(xì)胞；泳道3為pSB1s-XI-SynispG-036/PXI的全細(xì)胞；泳道4為pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI的全細(xì)胞；泳道5為pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI的全細(xì)胞。)所示，從圖中可見，SynIspG在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，大小約44kDa。同時(shí)以轉(zhuǎn)入載體pSB1s-XI的大腸桿菌pSB1s-XI036/PXI以及重組表達(dá)synIspG的工程菌pSB1s-SynispG 036/PXI作為對照，結(jié)果對照菌pSB1s-XI036/PXI中沒有得到目的蛋白，pSB1s-SynispG 036/PXI中有大小約為44kD的SynIspG的表達(dá)蛋白。

含有鏈霉素和氯霉素雙抗性的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200L D+100L E+1mL F(以下均為質(zhì)量百分比濃度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25MNa₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；

D.1M MgSO₄；

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM；

F.20％阿拉伯糖。

四、重組表達(dá)RsIspH蛋白的基因工程菌的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pSB1s-XI-SynispG、pSB1s-XI-SynispG-3a和pSB1s-XI-SynispG-6a用氯化鈣法轉(zhuǎn)化含有pLY036報(bào)告質(zhì)粒(p15A origin,tac promoter,Cm^R,Anabaena sp.crtEB,RhodobactersphaeroidescrtI,E.coli idi，可將前體IPP&DMAPP轉(zhuǎn)化為鏈孢紅素)的大腸桿菌PXI(BW25113pgiP_T5-idiP_T5-dxs，實(shí)驗(yàn)室保存菌株)，得到基因工程菌pSB1s-XI-SynispG-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI和pSB1s-XI-SynispG6a-036/PXI。鏈霉素和氯霉素雙抗性篩選培養(yǎng)，挑取單菌落37℃振蕩培養(yǎng)過夜以獲得飽和培養(yǎng)，1％接種于含鏈霉素(50g/ml)和氯霉素(17g/ml)雙抗性的ZYM-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含終濃度0.2％的阿拉伯糖)中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)后，離心收集菌體。

含有鏈霉素和氯霉素雙抗性的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200L D+100L E+1mL(以下均為質(zhì)量百分比濃度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25MNa₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；

D.1M MgSO₄；

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM；

F.20％阿拉伯糖。

五、SynIspG蛋白的酶活性與大腸桿菌EcIspG蛋白的酶活性比較，以及不同稀有密碼子對異戊二烯類化合物產(chǎn)量的影響。

對SynIspG蛋白的酶活性與大腸桿菌EcIspG蛋白的酶活性進(jìn)行比較，將過夜培養(yǎng)的工程菌株pSB1s-EcIspG/PXI和pSB1s-SynIspG036/PXI按1％接種量接種于含5ml ZYM-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)后，取出1mL培養(yǎng)液留待測試。在剩余的4mL培養(yǎng)液中加入500L的40％葡萄糖和500L的10×PBS進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。分別測定轉(zhuǎn)化0小時(shí)和24小時(shí)的OD₆₀₀，并取含1×10⁸cfu細(xì)胞的培養(yǎng)液離心收集菌體，用雙蒸水洗滌一次，于菌體中加入1ml丙酮，冰上萃取2h，12000rpm/min離心10min，取上清液得到待測樣品，進(jìn)行掃描340-550波長掃描，讀取特征吸收峰442nm的峰值。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。比較結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出pSB1s-SynIspG/PXI的鏈孢紅素產(chǎn)量為pSB1s-EcIspG/PXI的1.7倍，也即SynIspG蛋白具有較EcIspG更強(qiáng)的酶活性。

對不同稀有密碼子對異戊二烯類化合物產(chǎn)量的影響進(jìn)行比較。將過夜培養(yǎng)的工程菌株pSB1s-XI-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG-036/PXI，pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI和pSB1s-XI-SynispG6a-036/PXI按1％接種量接種于含5ml ZYM-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)后，取出1mL培養(yǎng)液留待測試。在剩余的4mL培養(yǎng)液中加入500L的40％葡萄糖和500L的10×PBS進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。分別測定轉(zhuǎn)化0小時(shí)和24小時(shí)的OD₆₀₀，并取含0.5×10⁸cfu細(xì)胞的培養(yǎng)液離心收集菌體，用雙蒸水洗滌一次，于菌體中加入1ml丙酮，于冰上萃取2h，12000rpm/min離心10min，取上清液得到待測樣品，進(jìn)行掃描340-550波長掃描，讀取特征吸收峰442nm的峰值。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。比較結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出pSB1s-XI-SynispG3a-036/PXI的鏈孢紅素產(chǎn)量為pSB1s-XI-036/PXI的1.9倍，也即該優(yōu)化密碼子基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的產(chǎn)異戊二烯類化合物的能力。

10×PBS(pH7.4)的配方如下：磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄)：14.4g；磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)：2.4g；氯化鈉(NaCl)：80g；氯化鉀(KCl)：2g。溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。