本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，具體涉及原核表達體系一種能提高菊酯類降解酶表達量的方法。

背景技術：

原核表達系統(tǒng)，是目前應用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一，常用的有大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)等，其中又以大腸桿菌表達系統(tǒng)最為常見。大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物而且所需的成本相對比較低廉，已經應用于菊酯類降解酶的表達。BLR(DE3)是一種蛋白酶缺陷型B型菌株，為A.Roca(University of Wisconsin)構建的BL21recA衍生菌，能穩(wěn)定某些帶有重復序列的目的基因。

菊酯類農藥是一類廣泛使用的殺蟲劑，已經廣泛應用到現代農業(yè)中，由于它們的廣泛應用對生態(tài)環(huán)境產生了一定影響，農藥殘留這個環(huán)境問題近年來受到關注，利用生物降解方法能解決農藥污染問題，成為環(huán)境科學的研究熱點。國內已有中山大學等學者對其降解酶的篩選和降解酶基因的克隆做了一系列研究。如CN 201010547206.8重組了est825，構建了重組表達的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-est825用于制備降解酶。黃皓等人在CN 201210412214.0中使用乳糖發(fā)酵，提高了降解酶的產量，然上述酶粉產量仍然較低。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對現有技術不足，開發(fā)了一種提高菊酯類降解酶表達量的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種提高菊酯類降解酶表達量的方法，包括以下步驟：

1)制備生產菌種大腸桿菌E.coli BLR(DE3)/pET-28a-est825；

est825的序列可以參照專利CN 201210412214.0，基因工程構建宿主細胞的操作可以參照專利CN 201010547206.8。

2)進行種子培養(yǎng)；

3)進行發(fā)酵培養(yǎng)：當補料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD_600nm值達到120-140時，一次性添加乳糖+異丙基硫代半乳糖(IPTG)的混合誘導溶液(摩爾濃度比為7:3)，使發(fā)酵液中上述混合誘導的濃度為9-13g/L，降至溫度至30-35℃開始誘導，誘導過程中繼續(xù)流加甘油和酵母粉的混合補料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為1-2g/L，誘導的時間持續(xù)6-7h；

在一些實施方式中，發(fā)酵的底物培養(yǎng)基可以是NZCYM培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；在另一些實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.8，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：甘油5-8g/L，蛋白胨3-10g/L，酵母粉3-8g/L，(NH4)₂SO4 5-10g/L，MgSO4·7H₂O 1-3g/L，KH₂PO4 3.4-6.85g/L，K₂HPO₄·12H₂O 5.68-11.35g/L，微量元素液1-2mL/L，卡那霉素50-100mg/L。

4)發(fā)酵結束后，在4-8℃的溫度下離心收集菌體，將菌體用含有0.005mol/L苯甲基磺酰氟的pH6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液配制成質量濃度15％-20％的菌懸液，將菌懸液在4-8℃的溫度下20KHz超聲破碎，破碎液離心制得上清液，凍干即得酶粉。

菊酯類生物降解酶的研究還相對較少，經過本發(fā)明人的大量研究，宿主細胞的選擇上，對于表達此生物降解酶，比使用BL21(DE3)相同情況下表達量高出20％以上；使用合適比例的乳糖和乳糖類似物的混合溶液進行誘導和破碎溶液中添加少量的苯甲基磺酰氟能有利于獲得更高的酶粉生產量。通過本發(fā)明的制備方法，能得到不低于200g/L的高活性菊酯類降解酶的酶粉量。

具體實施方式

以下所述的是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明所保護的不限于以下優(yōu)選實施方式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發(fā)明創(chuàng)造構思的基礎上，做出的若干變形和改進，都屬于本發(fā)明的保護范圍。

下面實施例的甘油、菌體濃度和酶活的測定方法參照專利CN 201210412214.0。

實施例1

1.以重組大腸桿菌E.coli BLR(DE3)/pET-28a-est825作為生產菌種，用甘油管將生產菌種在-86℃的溫度下保存。

2.種子培養(yǎng)：將甘油管中的生產菌種按1.5％的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉速為220r/min、溫度為37℃、培養(yǎng)條件在恒溫搖床中培養(yǎng)10h；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的pH為7.0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基為含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基。

3.發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以4％的接種量接入裝有5.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中經行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為26h，維持溶氧值在20％，通氣量為3vvm，攪拌轉速1000r/min，發(fā)酵溫度37℃，使用25％的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的pH為6.8；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.8，本實驗發(fā)酵培養(yǎng)基包含：甘油5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 3g/L，KH₂PO₄ 3.4g/L，K₂HPO₄·12H₂O 11.35g/L，微量元素液1mL/L，卡那霉素50mg/L。上述微量元素液包括：CaCl₂ 2.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.5g/L，Na₂-EDTA 18.0g/L，FeSO₄·7H₂O 10.0g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O0.2g/L，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1g/L。

4.補料發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)4h后，流加甘油和酵母粉的混合補料液，控制菌體的比生長速率為0.1-0.2h^-1，補料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時間為7h；所述甘油和酵母粉的混合補料液包括以下組分：甘油500g/L，酵母粉100g/L，卡那霉素50mg/L；

5.進行發(fā)酵培養(yǎng)：當補料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD_600nm值達到130左右時，一次性添加乳糖+IPTG的混合誘導溶液(摩爾濃度比為7:3)，使發(fā)酵液中上述混合誘導的濃度為9/L，降至溫度至30℃開始誘導，誘導過程中繼續(xù)流加甘油和酵母粉的混合補料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為1g/L，誘導的時間持續(xù)7h。

6.后處理：發(fā)酵結束后，在4-8℃的溫度下離心收集菌體，將菌體用含有0.005mol/L苯甲基磺酰氟的pH6.5的磷酸鹽緩沖液配制成質量濃度20％的菌懸液，將菌懸液在4℃的溫度下、20KHz超聲破碎，破碎液離心制得上清液，凍干即得酶粉，酶粉產量為267g/L。酶活為70000U/g。

實施例2

1.以重組大腸桿菌E.coli BLR(DE3)/pET-28a-est825作為生產菌種，用甘油管將生產菌種在-86℃的溫度下保存。

2.種子培養(yǎng)：將甘油管中的生產菌種按1.5％的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉速為220r/min、溫度為37℃、培養(yǎng)條件在恒溫搖床中培養(yǎng)10h；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的pH為7.0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基為含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基。

3.發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以4％的接種量接入裝有5.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中經行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為26h，維持溶氧值在20％，通氣量為3vvm，攪拌轉速1000r/min，發(fā)酵溫度37℃，使用25％的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的pH為6.8；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.8，本實驗發(fā)酵培養(yǎng)基包含：甘油8g/L，蛋白胨3g/L，酵母粉3g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄ 6.85g/L，K₂HPO₄·12H₂O 5.68g/L，微量元素液1mL/L，卡那霉素50mg/L。上述微量元素液包括：CaCl₂ 2.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.5g/L，Na₂-EDTA 18.0g/L，FeSO₄·7H₂O 10.0g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O0.2g/L，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1g/L；

4.補料發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)4h后，流加甘油和酵母粉的混合補料液，控制菌體的比生長速率為0.1-0.2h^-1，補料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時間為9h；所述甘油和酵母粉的混合補料液包括以下組分：甘油500g/L，酵母粉100g/L，卡那霉素50mg/L；

5.進行發(fā)酵培養(yǎng)：當補料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD_600nm值達到130左右時，一次性添加乳糖+IPTG的混合誘導溶液(摩爾濃度比為7:3)，使發(fā)酵液中上述混合誘導的濃度為9/L，降至溫度至30℃開始誘導，誘導過程中繼續(xù)流加甘油和酵母粉的混合補料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為1g/L，誘導的時間持續(xù)7h。

6.后處理：發(fā)酵結束后，在4-8℃的溫度下離心收集菌體，將菌體用含有0.005mol/L苯甲基磺酰氟的pH6.5的磷酸鹽緩沖液配制成質量濃度20％的菌懸液，將菌懸液在4℃的溫度下、20KHz超聲破碎，破碎液離心制得上清液，凍干即得酶粉，酶粉產量為315g/L。酶活為72000U/g。

上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細說明，但實施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。