本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及植酸酶突變體YeAPPA-L162V及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豆類、谷類等作物動物飼料的主要原料，其中的磷主要以植酸形式存在。植酸不但不能被單胃動物所利用，而且還能夠與金屬陽離子、氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉等形成復(fù)合物從而抑制營養(yǎng)的吸收、影響動物的生產(chǎn)性能，沒有被動物消化吸收的植酸磷排到土壤和水體當(dāng)中會造成環(huán)境污染。在飼料里添加植酸酶能降解植酸生成無機(jī)磷和磷酸肌醇，從而提高氨基酸、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時還可以降低植酸所帶來的環(huán)境污染。因此植酸酶受到世界學(xué)術(shù)界和商業(yè)界的廣泛關(guān)注。

植酸酶作為飼料添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)價值，而目前所生產(chǎn)銷售的植酸酶不能完全滿足工業(yè)需求，大多具有熱穩(wěn)定性差、催化效率低和pH作用范圍窄等缺點?？蒲泄ぷ髡叨嗄陙碇铝τ诨蚬こ毯偷鞍踪|(zhì)工程研究，希望能改造或合成出綜合性質(zhì)比天然植酸酶更加優(yōu)良的新型植酸酶。定點突變技術(shù)可以改造植酸酶結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，明確特定氨基酸殘基在影響植酸酶酶學(xué)性質(zhì)方面的重要功能，深化植酸酶催化機(jī)理的認(rèn)識，并可獲得性質(zhì)改良的新酶，對分子設(shè)計具有重要的指導(dǎo)意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶。

本發(fā)明另一目的是提供編碼上述催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶基因。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶基因的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶基因的重組菌株。

本發(fā)明的另一目的是提供上述催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶基因的應(yīng)用。

本發(fā)明對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)來源植酸酶YeAPPA基因進(jìn)行定點突變，該植酸酶YeAPPA的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，該成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列編碼的。

SEQ ID NO.1

MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGSVYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKLDSAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVSLLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.

SEQ ID NO.2

Atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

本發(fā)明采用定點突變的方法，獲得了催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的突變體，命名為YeAPPA-L162V，即YeAPPA的第162位的亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

因此根據(jù)本發(fā)明的催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶突變體YeAPPA-L162V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示

SEQ ID NO.3

MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGSVYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKVDSAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVSLLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.

本發(fā)明還提供了編碼上述催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶突變體YeAPPA-L162V的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4

Atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaagtggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

將上述編碼催化效率提高且熱穩(wěn)定性改良的植酸酶突變體YeAPPA-L162V的閱讀框插入到所述載體的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。本發(fā)明優(yōu)選的載體為pET-22b(+)，使該核苷酸序列位于T7啟動子的下游并受其調(diào)控，得到突變體的重組原核表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明優(yōu)選的宿主菌為BL21(DE3)。相比于野生型，本發(fā)明的植酸酶突變體YeAPPA-L162V的催化效率明顯提高，熱穩(wěn)定和酸穩(wěn)定性及蛋白酶抗性明顯改良，有利于發(fā)展高效綠色飼料酶工業(yè)。

附圖說明

圖1為改造前后的植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)比較；

圖2為改造前后的植酸酶的蛋白酶抗性比較。

具體實施方式

實驗材料

1、菌株及載體：原核表達(dá)載體pET-22b(+)購自美國Novagen公司。質(zhì)粒擴(kuò)增及原核表達(dá)宿主菌是大腸桿菌Trans1-t1和BL21(DE3)細(xì)胞，均購自中國天根公司。

2、酶類及其它生化試劑：DNA純化試劑盒購自日本TaKaRa。Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自中國天根。植酸鈉和胃蛋白酶(p0685)購自美國Sigma。

實施例1：突變基因的獲得

用Overlap PCR方法通過兩輪PCR反應(yīng)在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌來源植酸酶YeAPPA的基因序列(SEQ IDNO.2)中引入突變，獲得突變基因YeAPPA-L162V。PCR模板是pEASY-T3-YeAPPA重組質(zhì)粒。擴(kuò)增突變基因完整編碼序列的上下游引物分別帶有EcoR I和Not I識別序列，分別為YeAPPA Forward:5’-CGCGAATTCGCACCGCTTGCAGCACAATCTAC-3’和YeAPPA Reverse:5’-GATGCGGCCGCTTAAATATGGCAGGCTGGCTCG-3’。在特定位置引入突變的上下游引物分別為YeAPPA L162V Forward:5’-GTCTGTAAAGTGGACTCAGCGAAAACTC-3’和YeAPPA L162V Reverse:5’-GAGTTTTCGCTGAGTCCACTTTACAGAC-3’。所需突變基因連接到pEASY-T3載體上并經(jīng)公司測序驗證。

實施例2：突變酶YeAPPA-L162V與野生酶YeAPPA在細(xì)菌中表達(dá)與純化

野生型和突變型植酸酶除去信號肽序列，克隆到表達(dá)載體pET-22b(+)的EcoRI和NotI位點之間，并在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中受2mM的IPTG(異丙基-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)。粗酶液經(jīng)鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱和二乙基氨基乙基(DEAE)柱進(jìn)行純化，純化酶用10％SDS-PAGE電泳分離分析其表觀分子量。野生酶與突變酶全長441個氨基酸，N端23個氨基酸為信號肽序列，成熟蛋白理論分子量為48.6kDa。除去信號肽的編碼區(qū)序列經(jīng)原核表達(dá)和純化，在SDS-PAGE電泳上檢測均為一條約46kDa的特異性條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例3：突變酶與野生酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

純化的野生型和突變植酸酶在不同pH(1-12)和不同溫度(30-80℃)下反應(yīng)30min，根據(jù)酶活性來檢測其最適pH和最適溫度。所用的緩沖液包括0.1mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH1-3)，0.1mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH3-6)，0.1mol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH6-8)和0.1mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8-12)。純化酶液在pH1-9下37℃處理1h，研究酶的pH穩(wěn)定性。在一定溫度下將純化酶液分別處理0，2，5，10，20，30，60min后測定其熱穩(wěn)定性。植酸酶活性使用硫酸亞鐵鉬藍(lán)法測定。以1.5mmol/L植酸鈉為底物，在37℃下反應(yīng)30min，用10％三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，并用顯色液(1％四水合鉬酸銨，3.2％濃硫酸，7.32硫酸亞鐵)進(jìn)行顯色。測定700納米下的吸光度值，計算產(chǎn)生無機(jī)磷酸鹽的量。一個植酸酶活性單位定義為在測定條件下，每分鐘釋放1微摩爾的磷酸鹽所需的酶量。

對突變酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定并與野生酶進(jìn)行了比較(圖1)。突變酶的最適pH為5，與野生酶相似。在相同的條件下，突變酶具有更好的酸穩(wěn)定性，在pH 2.0處理1h后還剩余65.8％酶活。而野生酶在pH 2.0處理1h后只剩余18.4％酶活。突變酶的最適溫度為45℃，類似于野生酶。突變酶比野生酶具有更好的熱穩(wěn)定性，在60℃處理30min后還剩余約10.9％。而野生酶在60℃下處理30min后基本失去活性。

實施例4：突變酶與野生酶的動力學(xué)常數(shù)比較

以0.0625mmol/L植酸鈉為底物，在野生酶YeAPPA及其突變體YeAPPA-L162V的最適pH和37℃下反應(yīng)1、3、5、7、10、15min時加入1mL 10％TCA終止反應(yīng)，測定酶活性，計算出酶活性與時間的比值，測定Km和Vmax的反應(yīng)時間。用不同濃度的植酸鈉(0.0625、0.1、0.125、0.2、0.25、0.5、1.0和1.5mmol/L)為底物，在最適條件下測定酶活，用米氏方程雙倒數(shù)法求Km值及Vmax，再根據(jù)酶的理論分子量求出kcat值。YeAPPA-L162V的動力學(xué)常數(shù)Km，Vmax，Kcat和Kcat/Km分別為0.19mM，9.49U mg^-1，7.26S^-1和38.44S-1mM^-1(表1)。這些結(jié)果表明YeAPPA第162位氨基酸殘基對催化效率具有非常大的影響。

表1野生型YeAPPA和突變酶YeAPPA-L162V的動力學(xué)分析

實施例5：突變酶與野生酶的蛋白酶抗性比較

野生型和突變酶分別用不同濃度的胃蛋白酶(0.25M甘氨酸鹽酸，pH 2)和胰蛋白酶(0.25M Tris-HCl，pH 7)在37℃下處理2h。蛋白酶和植酸酶的比例在1/1000到1/20范圍之間。測定突變酶的蛋白酶抗性并與野生酶進(jìn)行了比較(圖2)。在相同的條件下，突變酶具有更好的胃蛋白酶抗性，用1/1000至1/20的胃蛋白酶在37℃處理2h處理后，可保持8.9％以上的酶活性。而野生酶在1/1000的胃蛋白酶處理時完全失活。突變酶的胰蛋白酶抗性與野生型酶相似，用1/1000和1/500的胰蛋白酶在37℃處理2h時，酶活性基本不變，當(dāng)胰蛋白酶濃度提高至1/20時，可保持54.6％的酶活性。說明植酸酶YeAPPA的第162位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸提高了胃蛋白酶抗性，而不影響其胰蛋白酶抗性。

實施例6：不同金屬離子及化學(xué)試劑對本發(fā)明所述的突變酶與野生酶的酶活的影響

在酶促反應(yīng)體系中加入相應(yīng)的金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑，研究其對突變酶與野生酶酶活的影響，各種物質(zhì)的終濃度為1mmol/L，在最適pH、37℃條件下測定。以沒有加金屬離子和化學(xué)試劑的反應(yīng)為對照。各種金屬離子和化學(xué)試劑對突變酶與野生酶的活性有不同的影響(表2)。Ca2+激活突變酶的活性，Pd²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Hg²⁺、SDS強(qiáng)烈抑制突變酶的活性，其它化學(xué)物質(zhì)對突變酶的活性幾乎沒有影響。植酸酶YeAPPA的第162位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸降低了Hg²⁺，F(xiàn)e³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺與Ag⁺對植酸酶活性的抑制作用。

表2化學(xué)試劑對改造前后的植酸酶的酶活的影響