本發(fā)明屬于植物分子育種和生物技術領域，具體涉及磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐鹽性和鹽脅迫下作物產(chǎn)量增長中的應用。

背景技術：

隨著氣候和環(huán)境的變化、人口的不斷增加，全球的糧食安全問題令人擔憂。近年來，干旱的頻繁發(fā)生、干旱和鹽漬化耕地面積的不斷擴大，使作物生產(chǎn)的環(huán)境脅迫問題日趨嚴重。土地的鹽漬化則是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的主要問題之一。全球有1/5的耕地屬于鹽漬化(Yamaguc hi等，Developing salt-tolerant crop plants:challenges and opportunities.Trends Plant Sci.2005,10:615-620.)，我國有1/3的農(nóng)田鹽分過高導致農(nóng)作物減產(chǎn)，且干旱的發(fā)生、化肥的過度施用導致鹽漬化土地面積不斷蔓延擴大；氣候變暖、海平面上升使更多的沿海耕地被淹沒和鹽堿化。因此，干旱和鹽脅迫成了限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一。我國人口眾多，如何高效合理利用有限的土地和水資源、促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展乃是當務之急。針對當前問題，主要采取兩條措施：一是通過工程措施灌溉和土壤改良；二是通過生物技術培育抗旱、耐鹽作物新品種。前者耗資大、難以大規(guī)模進行，后者是一種經(jīng)濟有效的措施。然而，要解決這一問題，單靠常規(guī)育種已遇到了瓶頸，潛力相當有限，我們必須探索植物抗旱耐鹽機理，挖掘關鍵基因，通過基因工程打破常規(guī)雜交無法超越的障礙，培育耐鹽、抗旱作物新品種。

植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常遇到干旱、鹽害脅迫，并在長期的進化過程中自身逐步建立了一整套包括信號感受、傳導、生理生化以及形態(tài)發(fā)育的機制適應環(huán)境，最大限度減少傷害(Vinocur等，Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress achieveme nts and limitation.Curr Opin Biotechnol.2005,16:123-132)。目前，人類對植物鹽和干旱脅迫機理進行了大量的研究，發(fā)掘了一批耐鹽脅迫、抗旱的基因并應用于基因工程改良作物。根據(jù)其作用的機理，這些基因歸類起來可分為兩類：一類是編碼效應分子，主要包括：1)滲透保護劑如脯氨酸、甜菜堿等(Yoshiba等，Regulation of levels of proline as an osmol yte in plants under water stress.Plant Cell Physiol.1997,38:1095-10102)；2)維護細胞內(nèi)離子平衡的蛋白質(zhì)如Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運蛋白(Apse等，Salt tolerance conferred by overexpress ion of a vacuolar Na⁺/H⁺antiport in Arabidopsis.Science.1999,285:1256-1258)；3)抗氧化酶如POD、SOD、CAT(Miller等，Reactive oxygen signaling and abiotic stress.Physiol Plant.2008,133(3):481-9)；4)保護細胞的功能蛋白如LEA蛋白、水通道蛋白等(Chakrabortee等，Hydrophilic protein associated with desiccation tolerance exhibits broad protein stabili zation function.Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104:18073-18078)。另一類是調(diào)控因子包括：1)轉(zhuǎn)錄因子DREB、CBF、NAC、SKIP等(Liu等，Two transcription factors,DREB1and DREB2,with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively,in Arabidopsis.Plant Cell.1998,10:1391-1406；Denby等，Engineering drought and salinity tolerance in plants:lessons from genome-wide expression profiling in Arabidopsis.Trends Biotechnol.2005,23:547-552；Hou等，A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance.Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106:6410-6415)；2)感受和傳導逆境信號的SOS、鈣神經(jīng)元及蛋白激酶等(Kiegerl等，SIMKK,a mitogen-activated protein kinase(MAPK)kinase,is a specific activator of the salt stress-induced MAPK,SIMK.Plant Cell.2000,12:2247-2258；Zhu,Salt and drought stress signal transduction in plants.Annu Rev Plant Biol.2002,53:247-273)。上述基因的發(fā)現(xiàn)和鑒定令人鼓舞。然而，鹽脅迫和干旱是受多基因控制的數(shù)量性狀(Denby等，Eng ineering drought and salinity tolerance in plants:lessons from genome-wide expression pro filing in Arabidopsis.Trends Biotechnol.2005,23:547-552；Sahi等，Salt stress response in rice:genetics,molecular biology,and comparative genomics.Funct Integr Genomics.2006,6:263-284)，受多條信號或代謝途徑調(diào)控，且各條通路存在互作關系，其分子機理相當復雜，抗旱和耐鹽育種更具挑戰(zhàn)性。因此，我們需分析植物應對逆境脅迫所涉及的信號網(wǎng)絡和關鍵節(jié)點，從中找出具有耐鹽、抗旱、高產(chǎn)的多效因子。

生物膜富含信號分子，是感知和傳導外界信號的起始點，也是細胞與外界進行物質(zhì)和能量交換的位點及防疫外界侵染和逆境傷害的屏障。磷脂酶PLD催化膜磷脂產(chǎn)生信號分子磷脂酸。本發(fā)明涉及植物中一種獨特的磷脂酶PLDζ1在植物耐鹽性中的正調(diào)控作用，其基因超表達可明顯提高作物如水稻的耐鹽性，為作物耐鹽性育種提供了新基因和育種新種質(zhì)材料。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供了磷脂酶PLDζ1基因在增強作物耐鹽性和鹽脅迫條件下生物產(chǎn)量中的應用。通過克隆水稻PLDζ1全長CDS以及在水稻中超表達PLDζ1可明顯提高植株的耐鹽性，PLDζ1超表達植株在鹽脅迫下葉片組織受阻程度明顯低于對照野生型，植株細胞活力強于野生型。所述的磷脂酶PLDζ1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO.2所示。此外，水稻PLDζ1的缺失表達導致植株耐鹽性明顯低于對照野生型，鹽脅迫條件下pldζ1缺失突變體植株生長、存活率、株高和生物產(chǎn)量等方面明顯低于對照野生型，進一步表明PLDζ1在植物耐鹽性中的正調(diào)控作用。

本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)PLDζ1編碼一種具有活性的磷脂酶D，催化磷脂酰膽堿產(chǎn)生磷脂酸PA，且PLDζ1活性對植株脂質(zhì)代謝具有顯著影響，其缺失突變導致植株體內(nèi)磷脂酸含量顯著降低，其它脂質(zhì)含量也發(fā)生改變。表明通過分子遺傳操作改變PLDζ1的表達量可有效調(diào)控膜脂代謝及信號，進而影響植物響應鹽脅迫信號。PLDζ1可調(diào)控鈉離子轉(zhuǎn)運相關基因的表達，調(diào)控植株體內(nèi)鈉離子轉(zhuǎn)運及鈉/鉀離子的穩(wěn)態(tài)平衡，進而增強植株的耐鹽性和植株生長。

此外，本發(fā)明創(chuàng)建了含不同表達量的PLDζ1植物材料，包括PLDζ1超表達和缺失突變體。特別是超表達植物材料可用于作物遺傳改良，是培養(yǎng)耐鹽作物的新種質(zhì)材料，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻適用于鹽堿土壤種植。PLDζ1正調(diào)控植株的耐鹽性，使其在改良作物耐鹽性的應用方面更加切實可行。

本發(fā)明的積極效果

1.水稻PLDζ1的缺失導致植株耐鹽性明顯低于對照野生型，包括植株生長、存活率、株高和生物產(chǎn)量等方面明顯低于野生型。

2.超表達PLDζ1可明顯提高植株的生長、種子結(jié)實率，特別是在鹽脅迫下，超表達PLDζ1植株的存活率明顯高于對照野生型，鹽脅迫下超表達葉片丙二醛含量及質(zhì)膜透性顯著低于對照野生型，其存活率和株高明顯高于對照野生型。

3.在鹽脅迫條件下，PLDζ1在調(diào)控鈉離子轉(zhuǎn)運中具有重要作用，PLDζ1的缺失導致植株體內(nèi)鈉離子含量明顯高于野生型，表明PLDζ1通過調(diào)控鈉、鉀離子平衡而增強植株的耐鹽性。

4.PLDζ1編碼有活性的磷脂酶D,可催化磷脂酰膽堿PC產(chǎn)生信號分子磷脂酸PA,其活性不依賴于鈣離子，但需要PIP₂作為激活因子，且在pH 7條件下活性最高，其生化特性與動物PLD類似。PLDζ1缺失導致植株體內(nèi)磷脂酸PA含量明顯低于野生型，表明PLDζ1對植株體內(nèi)脂質(zhì)代謝具有調(diào)控作用。

5.本研究發(fā)現(xiàn)PLDζ1的缺失突變導致鈉離子轉(zhuǎn)運相關基因如NHX 1、SOS1和SOS3的下調(diào)表達，從而使體內(nèi)鈉離子外排受阻，植株體內(nèi)累積更多的鈉離子，并且PLDζ1缺失卻導致鈉離子內(nèi)排相關基因HKT1的顯著上調(diào)表達，從而增強植株從環(huán)境中吸收和轉(zhuǎn)運鈉離子。這些結(jié)果表明PLDζ1與鈉離子吸收和轉(zhuǎn)運的調(diào)控有關。

6.PLDζ1的活性對細胞膜脂組分產(chǎn)生明顯效應，其缺失導致鹽脅迫下的細胞膜脂代謝發(fā)生顯著變化，并且超表達PLDζ1可顯著增強植株的耐鹽性，這種特性使PLDζ1基因的應用更加行之有效。

附圖說明

圖1.PLDζ1超表達增強植株耐鹽性示意圖。

A.PLDζ1超表達植株在鹽脅迫下的表型；B-C.處于分蘗期的PLDζ1超表達植株和對照野生型經(jīng)過0、75mM NaCl處理30天后葉片丙二醛(MDA)含量(B)和葉片質(zhì)膜透性(C)。數(shù)值表示平均值±標準差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

圖2.PLDζ1的缺失突變導致植株對鹽脅迫敏感性增強的示意圖。

處于分蘗期的pldζ1突變體及野生型經(jīng)過0、50、150mM NaCl處理21天后的表型。

圖3.PLDζ1的缺失導致植物在鹽脅迫下株高及生物產(chǎn)量下降、細胞膜受損程度比對照野生型嚴重示意圖。

A.處于分蘗期的pldζ1突變體及野生型經(jīng)過0、50、150mM NaCl處理21天后的株高測定。數(shù)值表示平均值±標準差(n＝6)；B-D.處于分蘗期的pldζ1突變體及野生型經(jīng)過0、200mM NaCl處理15天后地上部鮮重(B)、丙二醛MDA含量(C)和質(zhì)膜透性(D)的測定結(jié)果。數(shù)值表示平均值±標準差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

圖4.鹽脅迫下PLDζ1對植株體內(nèi)Na⁺和K⁺含量的影響示意圖。

A、B.處于分蘗期的pldζ1突變體及野生型經(jīng)過0、150mM NaCl處理14天后的鈉離子測定結(jié)果；C、D.處于分蘗期的pldζ1突變體及野生型經(jīng)過0、150mM NaCl處理14天后的鉀離子的測定結(jié)果。數(shù)值表示平均值±標準差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

圖5.PLDζ1催化磷脂酰膽堿PC產(chǎn)生磷脂酸PA示意圖。

PIP₂可顯著促進PLDζ1的催化活性，且在中性pH 7值條件下PLDζ1活性最高。

圖6.突變體pldζ1及野生型葉片Na⁺轉(zhuǎn)運相關基因在鹽脅迫下的表達量差異示意圖。

對分蘗期的pldζ1突變體及野生型用0、150mM NaCl處理6小時后，分析與Na⁺轉(zhuǎn)運相關基因表達量的結(jié)果。數(shù)值表示平均值±標準差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

具體實施方式

本發(fā)明實施例所用的水稻磷脂酶PLDζ1基因在公共核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陸號為XM_015784967。

本發(fā)明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規(guī)方案；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實施例1：

PLDζ1基因克隆及其超表達增強植物耐鹽性

1.PLDζ1基因全長cDNA的克隆和植物超表達載體構(gòu)建：

從粳稻Dongjin葉片中提取總RNA,以mRNA為模板經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR合成第一鏈cDNA，然后以cDNA為模板，使用PLDζ1序列特異性引物PLDζ1FZ：5’-GGGGTACCATGCAAGAATATCTGAACC-3’和PLDζ1RZ：5’-CGGGATCCATGGAAAACTTGTGGAG-3’進行PCR擴增，擴增得到的目的片段包括SEQ ID NO.1所示序列。擴增的目標片段插入到植物超表達載體pU1301D1(經(jīng)pCAMBIA1301改造，Hajdukiewicz等，The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol.Biol.1994,25：989-994)的酶切位點Kpn I和BamH I之間，獲得pU1301D1:PLDζ1重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切和測序驗證PLDζ1序列正確后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株。

2.遺傳轉(zhuǎn)化和PLDζ1超表達水稻植株的創(chuàng)建：

采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術，將含pU1301D1:PLDζ1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染粳稻Dongjin愈傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)、篩選、芽分化誘導和促根培養(yǎng)，具體步驟如下：

1)水稻愈傷組織的誘導：

將水稻種子去殼，用75％乙醇滅菌1min，再用0.05％的氯化汞溶液滅菌處理20min，經(jīng)雙蒸水洗5次后播種于誘導培養(yǎng)基，置黑暗中26℃培養(yǎng)約4周獲得愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織。愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配方包括N6培養(yǎng)基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L煙酸、1mg/L VB6、1mg/L VB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2.5mg/L 2,4-D、0.3g/L脯氨酸、0.6g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L瓊脂糖,pH 5.9。而繼代培養(yǎng)基中的2,4-D濃度為2mg/L、脯氨酸濃度為0.5g/L，其它組分與誘導培養(yǎng)基相同。

2)農(nóng)桿菌侵染愈傷組織：

用含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌，在28℃下培養(yǎng)2天，挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)，在28℃下?lián)u蕩(200rpm)培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀等于0.8。將胚性愈傷組織置于菌液中，在28℃下孵育30min，吸干菌液，將愈傷組織放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中干燥，然后移至共培養(yǎng)基于20℃下共培養(yǎng)2天。共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方包括1/2N6培養(yǎng)基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L煙酸、1mg/L VB6、1mg/L VB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2,4-D 3mg/L、0.8g/L水解酪蛋白、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂糖,pH 5.6。

3)轉(zhuǎn)化植株的獲得：

將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)出，經(jīng)無菌水漂洗5次，再用含有400ppm羧芐青霉素的滅菌水浸泡愈傷30min。然后吸干放在濾紙上，將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(含50mg/L潮霉素)，在28℃暗培養(yǎng)20d后，繼代一次。將新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，于28℃下光照培養(yǎng)2～3周后，每2周更新培養(yǎng)基，待愈傷組織長出小苗后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，然后煉苗、移栽。篩選培養(yǎng)基配方包括N₆培養(yǎng)基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L煙酸、1mg/L VB6、1mg/L VB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2.5mg/L 2,4-D、0.6g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂糖、1mg/L潮霉素和200ppm羧芐青霉素，pH 6.0。芽分化培養(yǎng)基則為MS培養(yǎng)基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L煙酸、1mg/L VB6、1mg/LVB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2mg/L 6-BA、2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.2mg/L IAA、1g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L瓊脂糖,pH 6.0。

4)轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定和Real-time PCR表達量分析：

提取再生植株葉片DNA，利用PLDζ1特異性序列引物PLDζ1FZ：5’-GGGGTACCATGCAAGAATATCTGAACC-3’和PLDζ1RZ：5’-CGGGATCCATGGAAAACTTGTGGAG-3’對葉片DNA進行PCR檢測，以WT(野生型粳稻Dongjin)的DNA為負對照，檢測再生植株是否導入PLDζ1基因。結(jié)果有9個獨立株系可擴增出預期大小一致的目標片段，而對照野生型WT則沒有擴增到目標片段，說明PLDζ1全長CDS序列已成功倒入水稻植株中。此外，提取轉(zhuǎn)化植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過實時定量Real-time PCR分析了上述獲得的轉(zhuǎn)化植株系。結(jié)果表明多數(shù)轉(zhuǎn)化株系的表達量均顯著高于對照野生型。獲得PLDζ1超表達水稻轉(zhuǎn)基因植株，用于以下實施例。

實施例2：

PLDζ1超表達增強植物的耐鹽性

隨機抽取實施例1創(chuàng)建的PLDζ1超表達水稻轉(zhuǎn)化植株的兩個PLDζ1-OE獨立株系OE-14和OE-15進行詳細分析，以同樣經(jīng)過組培過程的非轉(zhuǎn)化再生植株(野生型，WT)作為對照，在分蘗期對其進行不同濃度的NaCl溶液(0、50、75mM)處理一個月。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常條件下，PLDζ1超表達植株與對應野生型在株高、葉片質(zhì)膜透性及丙二醛含量等方面均沒有顯著性差異，但在鹽脅迫條件下，PLDζ1超表達植株存活率顯著高于野生型，其葉片質(zhì)膜透性與丙二醛含量顯著低于非轉(zhuǎn)化的野生型(圖1)。在75mM NaCl處理一個月后，超表達OE14和OE15植株葉片丙二醛含量分別僅為對照野生型的39％和58％，葉片質(zhì)膜透性分別僅為野生型38％和73％(圖1)。表明在鹽脅迫下超表達植株葉片受損程度顯著低于對照野生型。并且在150mM NaCl脅迫下超表達植株可收獲到成熟飽滿的種子，而對照野生型植株則未能獲得種子。說明水稻PLDζ1過量表達可增強植株的耐鹽性且能提高其種子產(chǎn)量。PLDζ1在鹽脅迫反應中具有正調(diào)控植株的耐鹽性。

實施例3：

PLDζ1缺失突變體分離、鑒定及其基因功能鑒定

1.突變體pldζ1的分離鑒定與表型觀察：

為進一步驗證分析PLDζ1基因功能，本發(fā)明分離獲得了T-DNA插入PLDζ1不同位點的兩個獨立突變體株系，分別命名為pldζ1-1和pldζ1-2，其中pldζ1-1的T-DNA插入位于PLDζ1的3’-UTR區(qū)域中，而pldζ1-2的T-DNA插入位于PLDζ1第三個內(nèi)含子中。通過半定量RT-PCR分析了T-DNA的插入對PLDζ1表達的影響，結(jié)果顯示pldζ1-1純合突變體中PLDζ1有少量表達，但明顯低于野生型，而pldζ1-2純合突變體中未能檢測到PLDζ1mRNA,屬于完全缺失突變體。

分析表明PLDζ1受到鹽脅迫所誘導，預示PLDζ1可能參與鹽脅迫反應過程。本研究利用獲得的突變體pldζ1-1和pldζ1-2材料進行鹽脅迫處理分析。將同時期收獲的突變體及對應的野生型種子播種于土壤(有機土：蛭石＝1:1)中，然后將長勢一致的3-4葉期幼苗移植到盆栽土壤(稻田土:有機土＝1:1)。待植株長到分蘗初期時開始鹽脅迫處理，經(jīng)過施加不同濃度的NaCl溶液(0、50、150mM)處理三周后觀察表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常條件下，突變體pldζ1-1和pldζ1-2與野生型的長勢沒有明顯差別，而在鹽脅迫處理下，pldζ1-1和pldζ1-2突變體植株生長明顯弱于其對應的野生型，其株高顯著低于野生型，且隨著鹽濃度的增加，突變體長得越差，與野生型的株高差異越大(圖2，圖3中A)。為分析PLDζ1的缺失突變對植株耐鹽性的影響，對處于分蘗期的植株用200mM NaCl處理15天，然后測定植株地上部分鮮重、葉片質(zhì)膜透性與丙二醛含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常條件下的pldζ1-1和pldζ1-2突變體與野生型在植株鮮重、質(zhì)膜透性及丙二醛含量方面均沒有顯著性差異。但在鹽脅迫條件下，突變體的株高和地上部鮮重均顯著低于野生型，并且突變體的質(zhì)膜透性與丙二醛含量顯著高于野生型，為野生型的兩倍(圖3)。

2.水稻PLDζ1對鹽脅迫下植物體內(nèi)Na⁺和K⁺含量的影響：

為了檢測水稻PLDζ1是否影響了鹽脅迫下植株對Na⁺和K⁺的吸收，本研究測定了鹽脅迫下pldζ1突變體與對應野生型體內(nèi)的Na⁺和K⁺含量。在分蘗期施用150mM NaCl溶液兩周，取pldζ1突變體與野生型植株根部、葉鞘、葉片組織，分別通過原子吸收分光光度計測定樣品Na⁺和K⁺含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，pldζ1突變體和野生型根部及葉片組織的Na⁺含量沒有明顯的差別(圖4A，B)。在鹽脅迫下，兩個pldζ1突變體的根部、葉鞘和葉片組織的Na⁺含量均顯著高于相應的野生型(圖4A，B)。突變體葉鞘鉀離子K⁺含量則顯著低于對應的野生型(圖4C,D)。說明PLDζ1缺失導致植株體內(nèi)鈉離子積累的增強，影響了葉組織的Na⁺/K⁺離子平衡，水稻PLDζ1的缺失突變導致植物對鹽敏感。

實施例4：

PLDζ1原核蛋白表達、酶生化特性

水稻PLDζ1是否編碼磷脂酶D尚未清楚，其生化特性也有待進一步分析。為此，本發(fā)明構(gòu)建了PLDζ1的原核表達載體pET28a(Novagen公司)，其酶切位點為BamH I和SacI，使用引物為PLDζ1FQ(5’-GGATCCATGCAAGAATATCTGAACC-3’)和PLDζ1RQ(5’-GAGCTCATGGAAAACTTGTGGAGAC-3’)。利用表達的PLDζ1重組蛋白進行酶活性分析，以含pET28a空載體菌株誘導出的蛋白做負對照。以磷脂酰膽堿PC(普通PC:熒光PC＝8:2)作為底物，結(jié)果表明水稻PLDζ1可催化磷脂酰膽堿產(chǎn)生磷酸酯酸PA，而含空載體的蛋白則在相同條件下未能檢測到明顯的PA信號。本發(fā)明還進一步分析了磷脂酰肌醇衍生物PIP₂對PLDζ1活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻PLDζ1的催化活性依賴于PIP₂，并且在pH 7的條件下，PLDζ1活性最高(圖5)。這些結(jié)果表明水稻PLDζ1基因編碼了磷脂酶D,主要催化PC產(chǎn)生PA。

實施例5：

PLDζ1對水稻脂質(zhì)代謝及其鈉離子轉(zhuǎn)運相關基因表達量的影響

1.PLDζ1對水稻脂質(zhì)代謝的影響：

為分析PLDζ1對脂質(zhì)代謝的影響，本發(fā)明利用種植于有機土壤(營養(yǎng)土:蛭石＝1:1)處于分蘗期的pldζ1突變體和對應野生型材料，提取正常生長及鹽脅迫(50mM NaCl)處理四天的葉片脂質(zhì)，通過高通量質(zhì)譜技術測定植株體內(nèi)的脂質(zhì)含量。結(jié)果顯示正常條件下的pldζ1突變體內(nèi)的磷脂酸(PA)、雙半乳糖二脂酰甘油(DGDG)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰甘油(PG)含量均顯著低于野生型，而單半乳糖脂二脂酰甘油(MGDG)和磷脂酰絲氨酸(PS)含量都顯著高于野生型。在鹽脅迫條件下，突變體pldζ1內(nèi)的單半乳糖脂二脂酰甘油(MGDG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的含量及摩爾百分比含量、磷脂酰絲氨酸(PS)和雙半乳糖二?；视?DGDG)的含量都顯著高于野生型，而磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰膽堿(PC)含量均顯著低于對應野生型。這說明PLDζ1參與正常及鹽脅迫條件下脂質(zhì)代謝的調(diào)控。

2.PLDζ1對鈉離子轉(zhuǎn)運相關基因表達的影響：

本研究通過實時定量Real-time PCR分析鈉離子轉(zhuǎn)運相關基因的表達量。對生長于水培液、處于分蘗期的pldζ1-1突變體和野生型進行150mM NaCl脅迫處理，然后提取處理0、6h的水稻葉片總RNA，進行相關基因表達的定量分析。在正常條件下，向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運Na⁺離子的HKT1基因、向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運Na⁺離子的NHX1基因、SOS信號轉(zhuǎn)導途徑中相關的SOS3基因表達水平在突變體和野生型之間均沒有明顯差異，而在鹽脅迫下HKT1表達量受到抑制，且pldζ1-1突變體中的表達量顯著高于野生型(圖6)，這說明PLDζ1及其產(chǎn)物PA可抑制HKT1的表達，從而阻止胞外Na⁺的進入；而NHX1表達水平在鹽脅迫下的結(jié)果則與HKT1基因相反，顯著受鹽脅迫所誘導，且突變體中的NHX1表達量顯著低于野生型，表明PLDζ1可促進NHX1表達，增強Na⁺進入液泡中；而SOS1、SOS3基因在鹽處理條件下，野生型中的表達量顯著高于突變體，所以PLDζ1可促進其表達，從而增強Na⁺排除到體外。這些結(jié)果表明PLDζ1可參與調(diào)控鈉離子轉(zhuǎn)運相關基因表達的調(diào)控，進而調(diào)控植株免受過高濃度鈉離子的傷害。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學

<120> 磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐鹽性中的應用

<130> 磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐鹽性中的應用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2805

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atgcaagaat atctgaacca ttttttgggg aacttggaca ttgtcaactc accggaggtt 60

tgcaaatttt tggaggtatc atgtttgtca tttttaccgg aatatgggcc taagctaaag 120

gaagattatg tatctgttgg acacttgcca aaaattcaga aggaccataa agaaaactgt 180

tgttcatgtg ggttgtttag ctgttgcaaa agcagctggc aaaaggtttg ggttgtcctg 240

aagccaggat tcttagcttt actcaaagat ccttttgatc caaagctttt agatgtcctt 300

atctttgatg cactgccaca tatggatata agtggagagg gccaaatatc tctagcaaaa 360

gagatcaagg aacgaaaccc gttgcatttc ggactccagg tgtcttctgg tggccagact 420

ttaaagttac gaacaagaag ttcttctaaa gtgaaagact gggttagtgc aataaatgct 480

gctcgacaaa ctccagaggg ctggtgttac cctcatcgtt ttggttcatt tgctccacca 540

aggggtctca tgccagatgg gagtatggta cagtggttta tagacggaga agctgcattt 600

caggcaattg cttcctccat tgagcaagca aaatcagaga tatttattac tggctggtgg 660

ctctgcccag aattgtttct ccgacgccct ttccaacatc atgggtcatc taggcttgat 720

gctctactgg aagctagagc taagcagggt gtacagatct acattctttt gtacaaggaa 780

gttgctcttg cattgaaaat caacagcttg tacagtaaac aaaagctact taacattcat 840

gagaatgtaa aagttctgcg atatcctgat catttctcaa gcggtgtata cttatggtca 900

caccatgaga aaattgtgat agtagataat caagtatgct atcttggagg tcttgatctg 960

tgctttggtc gctacgataa ttctgcgcac aaactttcag atgttcctcc tgtgatatgg 1020

ccagggaaag actactataa ccccagggaa tctgagccaa attcctggga ggacacaatg 1080

aaagatgagc tggaccgaac gaaatatcct cgcatgcctt ggcatgatgt tcagtgtgct 1140

ctctacggtc caccttgtcg ggatgttgca aggcattttg ttcagcgctg gaattatgca 1200

aagaggaaca aagctcccaa tgagcaagga attcccttgc tgatgcctca tcaccacatg 1260

gtaattccac attacaaggg cataggccaa gaaattaata gtgaggctga tggtaaacaa 1320

aatcatgaca aggattgtga tgttaaaaaa ccagtctctg tggactcacg ggagtcttgt 1380

caggacattc cattgctttt acctcaagag cttgaaccac cggcattgcc caatggagat 1440

ttaagagtga acgatttaga cgccaaccac tctgatcacc tacacaaaac aagcttcaat 1500

cagcctttgc tcaaccggaa ggcaaagttg gattcttccc gacaggattt gcccatgaga 1560

ggtttcgtag acaatataag ttcccttgag tcatcatcta ttaggcattt tgattcttcc 1620

aaagaagaaa agtatcacat ggataagaac tggtgggaga tgcaagaaag aggagatcaa 1680

gttgcttcag tacttgatat agggcaagtt ggtccaaggg caacttgtca ttgtcaggta 1740

attagaagtg ttggtcaatg gtcagctgga accactcaaa tcgaaggaag catccacaat 1800

gcctattttt ctcttattga aaaggcagaa cattttgtat atatcgagaa tcaatttttc 1860

atatcaggcc tttcaggaga tgaaacgata aaaaatcgtg tattggaagc attatacagg 1920

cgcatacttc gggcagagag agaaaaaaag cgcttcaaag ccatcataat aatacctctg 1980

ttacctggtt ttcagggagg cattgatgat ggcggagctg catctgtgag agcaattatg 2040

cattggcaat accggactat ctgtagaggc cctaattcta tacttcagaa tctatatgat 2100

gttattggtc caaaagcaca tgattatatc tcattttatg gtcttagagc acatggtaga 2160

ctatgcgaag gaggtccctt ggtcactaat cagatttatg tccacagtaa gttgatgata 2220

attgatgacc gcatcacatt gattggatca gctaacataa atgatagaag cttgcttgga 2280

tcaagagatt ctgagattgc cgtggtcatt gaagataaag aagttgttag ttccaaaatg 2340

aatggaaaac cttgggaagc tgggaagttt tctctaagcc tacgtctctc tctctgggca 2400

gagcaccttg gccttcatcg aggagaggtc agccatatta tggaccctat cgatgactca 2460

actttcaaaa atatctggat ggccactgct aagacaaata ccatgattta ccaagatgtc 2520

ttctcatgtg tacctaatga tcttatccat tcaagggccc aatttcggca gagctttgct 2580

cactgcaggg ataaaatcgg tcacaataca atcgatttgg gggttgccca agagaagctg 2640

gaaacctacc aggacggcga tctcaagggt acggacccta tagaaagatt gcagatgatc 2700

aaaggtcacc ttgtttcttt cccgttggat ttcatgtccc aagaggactt gagaccatat 2760

ttcagtgaaa gtgaatatta tacgtctcca caagttttcc attag 2805

<210> 2

<211> 934

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 2

Met Gln Glu Tyr Leu Asn His Phe Leu Gly Asn Leu Asp Ile Val Asn

1 5 10 15

Ser Pro Glu Val Cys Lys Phe Leu Glu Val Ser Cys Leu Ser Phe Leu

20 25 30

Pro Glu Tyr Gly Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Val Ser Val Gly His

35 40 45

Leu Pro Lys Ile Gln Lys Asp His Lys Glu Asn Cys Cys Ser Cys Gly

50 55 60

Leu Phe Ser Cys Cys Lys Ser Ser Trp Gln Lys Val Trp Val Val Leu

65 70 75 80

Lys Pro Gly Phe Leu Ala Leu Leu Lys Asp Pro Phe Asp Pro Lys Leu

85 90 95

Leu Asp Val Leu Ile Phe Asp Ala Leu Pro His Met Asp Ile Ser Gly

100 105 110

Glu Gly Gln Ile Ser Leu Ala Lys Glu Ile Lys Glu Arg Asn Pro Leu

115 120 125

His Phe Gly Leu Gln Val Ser Ser Gly Gly Gln Thr Leu Lys Leu Arg

130 135 140

Thr Arg Ser Ser Ser Lys Val Lys Asp Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala

145 150 155 160

Ala Arg Gln Thr Pro Glu Gly Trp Cys Tyr Pro His Arg Phe Gly Ser

165 170 175

Phe Ala Pro Pro Arg Gly Leu Met Pro Asp Gly Ser Met Val Gln Trp

180 185 190

Phe Ile Asp Gly Glu Ala Ala Phe Gln Ala Ile Ala Ser Ser Ile Glu

195 200 205

Gln Ala Lys Ser Glu Ile Phe Ile Thr Gly Trp Trp Leu Cys Pro Glu

210 215 220

Leu Phe Leu Arg Arg Pro Phe Gln His His Gly Ser Ser Arg Leu Asp

225 230 235 240

Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ala Lys Gln Gly Val Gln Ile Tyr Ile Leu

245 250 255

Leu Tyr Lys Glu Val Ala Leu Ala Leu Lys Ile Asn Ser Leu Tyr Ser

260 265 270

Lys Gln Lys Leu Leu Asn Ile His Glu Asn Val Lys Val Leu Arg Tyr

275 280 285

Pro Asp His Phe Ser Ser Gly Val Tyr Leu Trp Ser His His Glu Lys

290 295 300

Ile Val Ile Val Asp Asn Gln Val Cys Tyr Leu Gly Gly Leu Asp Leu

305 310 315 320

Cys Phe Gly Arg Tyr Asp Asn Ser Ala His Lys Leu Ser Asp Val Pro

325 330 335

Pro Val Ile Trp Pro Gly Lys Asp Tyr Tyr Asn Pro Arg Glu Ser Glu

340 345 350

Pro Asn Ser Trp Glu Asp Thr Met Lys Asp Glu Leu Asp Arg Thr Lys

355 360 365

Tyr Pro Arg Met Pro Trp His Asp Val Gln Cys Ala Leu Tyr Gly Pro

370 375 380

Pro Cys Arg Asp Val Ala Arg His Phe Val Gln Arg Trp Asn Tyr Ala

385 390 395 400

Lys Arg Asn Lys Ala Pro Asn Glu Gln Gly Ile Pro Leu Leu Met Pro

405 410 415

His His His Met Val Ile Pro His Tyr Lys Gly Ile Gly Gln Glu Ile

420 425 430

Asn Ser Glu Ala Asp Gly Lys Gln Asn His Asp Lys Asp Cys Asp Val

435 440 445

Lys Lys Pro Val Ser Val Asp Ser Arg Glu Ser Cys Gln Asp Ile Pro

450 455 460

Leu Leu Leu Pro Gln Glu Leu Glu Pro Pro Ala Leu Pro Asn Gly Asp

465 470 475 480

Leu Arg Val Asn Asp Leu Asp Ala Asn His Ser Asp His Leu His Lys

485 490 495

Thr Ser Phe Asn Gln Pro Leu Leu Asn Arg Lys Ala Lys Leu Asp Ser

500 505 510

Ser Arg Gln Asp Leu Pro Met Arg Gly Phe Val Asp Asn Ile Ser Ser

515 520 525

Leu Glu Ser Ser Ser Ile Arg His Phe Asp Ser Ser Lys Glu Glu Lys

530 535 540

Tyr His Met Asp Lys Asn Trp Trp Glu Met Gln Glu Arg Gly Asp Gln

545 550 555 560

Val Ala Ser Val Leu Asp Ile Gly Gln Val Gly Pro Arg Ala Thr Cys

565 570 575

His Cys Gln Val Ile Arg Ser Val Gly Gln Trp Ser Ala Gly Thr Thr

580 585 590

Gln Ile Glu Gly Ser Ile His Asn Ala Tyr Phe Ser Leu Ile Glu Lys

595 600 605

Ala Glu His Phe Val Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Phe Ile Ser Gly Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Thr Ile Lys Asn Arg Val Leu Glu Ala Leu Tyr Arg

625 630 635 640

Arg Ile Leu Arg Ala Glu Arg Glu Lys Lys Arg Phe Lys Ala Ile Ile

645 650 655

Ile Ile Pro Leu Leu Pro Gly Phe Gln Gly Gly Ile Asp Asp Gly Gly

660 665 670

Ala Ala Ser Val Arg Ala Ile Met His Trp Gln Tyr Arg Thr Ile Cys

675 680 685

Arg Gly Pro Asn Ser Ile Leu Gln Asn Leu Tyr Asp Val Ile Gly Pro

690 695 700

Lys Ala His Asp Tyr Ile Ser Phe Tyr Gly Leu Arg Ala His Gly Arg

705 710 715 720

Leu Cys Glu Gly Gly Pro Leu Val Thr Asn Gln Ile Tyr Val His Ser

725 730 735

Lys Leu Met Ile Ile Asp Asp Arg Ile Thr Leu Ile Gly Ser Ala Asn

740 745 750

Ile Asn Asp Arg Ser Leu Leu Gly Ser Arg Asp Ser Glu Ile Ala Val

755 760 765

Val Ile Glu Asp Lys Glu Val Val Ser Ser Lys Met Asn Gly Lys Pro

770 775 780

Trp Glu Ala Gly Lys Phe Ser Leu Ser Leu Arg Leu Ser Leu Trp Ala

785 790 795 800

Glu His Leu Gly Leu His Arg Gly Glu Val Ser His Ile Met Asp Pro

805 810 815

Ile Asp Asp Ser Thr Phe Lys Asn Ile Trp Met Ala Thr Ala Lys Thr

820 825 830

Asn Thr Met Ile Tyr Gln Asp Val Phe Ser Cys Val Pro Asn Asp Leu

835 840 845

Ile His Ser Arg Ala Gln Phe Arg Gln Ser Phe Ala His Cys Arg Asp

850 855 860

Lys Ile Gly His Asn Thr Ile Asp Leu Gly Val Ala Gln Glu Lys Leu

865 870 875 880

Glu Thr Tyr Gln Asp Gly Asp Leu Lys Gly Thr Asp Pro Ile Glu Arg

885 890 895

Leu Gln Met Ile Lys Gly His Leu Val Ser Phe Pro Leu Asp Phe Met

900 905 910

Ser Gln Glu Asp Leu Arg Pro Tyr Phe Ser Glu Ser Glu Tyr Tyr Thr

915 920 925

Ser Pro Gln Val Phe His

930