本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領域，具體為一種運用生物酶催化法高效制備、純化環(huán)二核苷酸cGAMP的方法。
背景技術(shù)：
細菌和病毒的核酸會引發(fā)宿主免疫反應，宿主通過對病原體產(chǎn)生的核酸感應啟動免疫反應。最近的研究表明環(huán)GMP-AMP 合成酶（cGAS）是一種關鍵的細胞質(zhì)DNA 感測器。cGAS 由雙鏈DNA 激活，催化合成一種非經(jīng)典的環(huán)二核苷酸2’,3’-cGAMP。cGAMP 作為第二信使通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體蛋白STING 結(jié)合促進對干擾素β和其他細胞因子的感應。關于STING 調(diào)節(jié)信號傳導的模型表明受體的結(jié)合會引發(fā)STING 的構(gòu)象變化，導致信號復合物中蛋白激酶TBK1 的召集和激活。轉(zhuǎn)錄因子IRF3 也隨之進入信號復合物并被TBK1 磷酸化，磷酸化的IRF3 形成低聚體并轉(zhuǎn)運至細胞核中，啟動干擾素β的表達。干擾素β能夠調(diào)控超過兩百種干擾素刺激基因的表達，它們能夠下調(diào)蛋白質(zhì)的合成、促進細胞生長停滯和誘導細胞凋亡，從而形成一種抗病毒的狀態(tài)來控制病毒的傳播。
在STING介導信號傳導的模型中的研究表明，cGAMP的結(jié)合會導致STING發(fā)生變構(gòu)效應，從而導致信號復合物中蛋白激酶TBK1的富集和激活，進而導致轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)控因子3（IRF3）的磷酸化，磷酸化的IRF3會發(fā)生寡聚并轉(zhuǎn)運進入細胞核中，其在細胞核內(nèi)能夠誘導β干擾素（IFN-β）的表達，而IFN-β對200多種干擾素誘導細胞因子基因的表達具有調(diào)節(jié)作用，從而通過下調(diào)腫瘤細胞內(nèi)蛋白的表達、使得腫瘤細胞生長停滯和誘導腫瘤細胞凋亡來體現(xiàn)其抗腫瘤的功能。IFN-β已經(jīng)被FDA批準應用于白血病、多發(fā)性硬化癥等的臨床治療，而cGAMP作為STING的激活劑，增強人體先天性免疫，誘導I-型干擾素的上調(diào)表達，進而激活T細胞。因此，cGAMP具有應用于抗腫瘤臨床治療的巨大潛質(zhì)。最近的兩項研究表明依賴于STING通路的胞質(zhì)DNA傳感能夠調(diào)節(jié)先天性免疫對于免疫原性腫瘤細胞的識別功能，并且能夠通過激活I型干擾素依賴的免疫效應成為放射性治療的輔助療法。樹突狀細胞是體內(nèi)最主要的呈遞腫瘤相關抗原的一類抗原呈遞細胞，當樹突狀細胞暴露于危險或炎癥信號時，它們對這項任務具有高度敏感性，能夠引起CD8+ T細胞的交叉激活反應。I型干擾素（包含干擾素α和干擾素β）作為一類眾所周知的免疫激活因子家族，能夠?qū)渫粻罴毎T導的交叉免疫產(chǎn)生最有效的活化作用。近期的體內(nèi)和體外研究都表明I型干擾素誘導的針對腫瘤特異性抗原的樹突狀細胞交叉免疫反應是腫瘤免疫監(jiān)控的一種關鍵的機制，并且能夠促進CD8+ T細胞的腫瘤殺傷作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
1、高效規(guī)?；苽渲亟M環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶（cGAS）的方法。
2、 運用重組的環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶cGAS催化,大規(guī)模制備環(huán)二核苷酸cGAMP。
3、環(huán)二核苷酸cGAMP規(guī)?；咝Х蛛x純化方法。
具體實施方式
高效規(guī)?；苽渲亟M環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶（cGAS）
（1）人源環(huán)二核苷酸cGAMP合成酶cGAS基因美國ATCC公司購買，通過基因工程手段將其成功克隆至購于Novagen公司的pET-28(a)載體內(nèi)，cGAS基因N-末端帶有SMT3融合標簽，SMT3標簽蛋白上含有6個組氨酸Ni-NTA柱親和標簽?；驕y序結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了人源環(huán)二核苷酸cGAMP合成酶cGAS基因表達質(zhì)粒。
（2）接種：以大腸桿菌 BL21 (DE3)為宿主菌（購于Novagen公司），轉(zhuǎn)化、挑斑于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。用于接種的搖瓶培養(yǎng)液使用濃度為 25 g/L 的 LB 培養(yǎng)液。搖瓶置于全控溫搖床，240 rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。種子的 OD600 測定值在 2－4 之間。接種量為工作體積的 2%-5%。
（3）發(fā)酵罐培養(yǎng) E. coli表達蛋白：
使用 New Brunswick Scientific BioFlo? 310 臺式發(fā)酵罐培養(yǎng) E. coli流加培養(yǎng)用的14 L 罐體及 Rushton 攪拌槳。通過位于系統(tǒng)控制器上的15英寸工業(yè)級彩色觸摸顯示屏，能控制調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、pH、溶氧、泡沫 / 液位、三個蠕動泵及通氣等。標配一個熱質(zhì)量氣體流量計（TMFC）能提供供氣控制。初始培養(yǎng)基成分為：磷酸二氫鉀（KH2PO4，3.5 g/L）， 磷酸氫二鉀（K2HPO4，5.0 g/L），硫酸銨（(NH4)2SO4，5.0 g/L）， 酵母抽提物 (5.0 g/L)，消泡劑 (Breox Foam Control Agent FMT 30，1.00 ml/L)。高溫滅菌冷卻后，添加：七水硫酸鎂（25% 溶液，最終濃度為 4 ml/L），葡萄糖，（10g/L, 通常加入 50% 的溶液），K-12 微量金屬（最終濃度為 1 ml/L），硫胺（加入量根據(jù)儲備液濃度決定，最終濃度為 2.2 mg/L），二水氯化鈣（加入量根據(jù)儲備液濃度決定，最終濃度為 0.15g/L）?！綤-12 微量金屬溶液，包括 : 氯化鈉（NaCl，5 g/L），七水硫酸鋅（ZnSO4-7H2O，1 g/L），四水氯化錳（MnCl2-4H2O，4 g/L），六水氯化鐵（FeCl3-6H2O，4.75 g/L），五水硫酸銅（CuSO2-5H2O，0.4 g/L），硼酸（H3BO3，0.575 g/L），二水鉬酸鈉（NaMoO4-2H2O，0.5 g/L），6N 硫酸（H2SO4，~ 12.5 ml/L）?！?/p>
控制參數(shù)設定值：發(fā)酵運行時間為 22 小時，控制溫度為37°C, pH 為 7.0, DO 為 30%。初始攪拌轉(zhuǎn)速為 200rpm，其后由 DO 關聯(lián)控制轉(zhuǎn)速。初始培養(yǎng) 5 小時后，開始進行流加培養(yǎng)，發(fā)酵 5 小時后，隨著碳源的耗盡，pH 值止于 7.1，BioCommand? 程序自動開啟補料泵。DO 和pH 也被精確控制。培養(yǎng) E. coli 獲得的菌體干重為 25 g/L。
（4）cGAS蛋白純化
菌體細胞溶于50mM Tris.HCl（pH 7.5）,用細胞碎儀（奧維斯丁中試型）破碎細胞，高速離心后得到含蛋白的上層清夜，然后用Ni-NTA（購于Qiagen公司）親和柱初步分離純化cGAS蛋白，用SDS-Page分析蛋白純度（85%），進而用SUMO蛋白酶（購于Qiagen公司）酶切除去SMT3融合標簽蛋白，再進行第二次Ni-NTA親和柱分離純化。 最后用HiLoadTM Superdex 75 凝膠柱進一步純化，得到95%純度cGAS酶蛋白，冷凍干燥后保存與-80度超低溫冷藏柜。
運用重組的環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶cGAS催化,大規(guī)模制備環(huán)二核苷酸cGAMP
運用制備的重組cGAS酶催化，高效專一性地制備環(huán)二核苷酸cGAMP。反應體系為20升生物酶反應器，反應體系含cGAS （10 mM）, ATP （10 mM）,GTP (10 mM), MgCl2 (10 mM), DNA (0.2mg/ml), NaCl (100 mM)，反應溫度37度，時間8小時。用分光光度計在260nm檢測產(chǎn)物和反應物，反應產(chǎn)率95%以上。
環(huán)二核苷酸cGAMP規(guī)?；咝Х蛛x純化方法
用100毫升體積離子交換柱(購于GE公司)分離純化，梯度洗脫cGAMP,得到純度高于95%的cGAMP。用-50度冷凍干燥機冷凍干燥后獲得約250克cGAMP凍干白色粉末樣品。